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GB-T 18246-2000 饲料中氨基酸的测定.pdf

GB-T 18246-2000 饲料中氨基酸的测定

华山论剑
2011-06-12 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《GB-T 18246-2000 饲料中氨基酸的测定pdf》,可适用于农林牧渔领域

GB'r前言本标准是根据FAOWHO(联合国粮食及农业组织和世界卫生组织)植物蛋白评价组专家联席会的推荐在GBT((饲料中含硫氨基酸测定方法离子交换色谱法》,GBT《饲料中色氨酸测定方法分光光度法》国家标准和NYT(原GB)《谷物籽粒氨基酸测定的前处理方法》行业标准的基础上充分吸纳国内外有关研究的最新成果和两次参加国际大型氨基酸实验室间联合试验研究的经验与结果制定的。本标准的酸水解部分和国际公职分析化学家协会(AOACInternational)的最新方法《饲料氨基酸测定方法》具有相同的构架但补充了碱解色氨酸的离子交换色谱和高效液相色谱法增加了酸提取添加氨基酸的测定。本标准对饲料氨基酸不同水解、测定方法的适应场合与局限性做了全面综合、归纳和阐述改进了有关国家标准的有如样品量、粒度和燕发去酸温度等实验条件。但是考虑我国具体情况本标准未像AOAC法那样采用内标法而采用了外标法在酸解法中除以偏重亚硫酸钠做终止剂的氧化酸解法外其他水解法也未采用AOAC和欧共体标准通用的回流水解法而采用了真空封管水解法。在碱解法中未用AOAC的氢氧化钠做碱解剂而是沿用了NYT(原GB)《谷物籽粒色氨酸测定法》中的碱解剂氢氧化锉这也是与德国等国家的做法相一致的。本标准达到了与AOAC等方法同样的准确度和精密度。在具体应用中一般可用常规直接水解法测定除色氨酸和含硫氨基酸(胧氨酸和蛋氨酸)以外的蛋白水解氨基酸用氧化酸解法测定含硫氨基酸而用碱解法测定色氨酸。但使用者可根据自己的测定目的在本标准不同方法中组合、择用。本标准的附录A是标准的附录。本标准由农业部和全国饲料工业标准化技术委员会提出。本标准由全国饲料工业标准化技术委员会归口。本标准负责起草单位:国家饲料产品质量监督检验中心(北京)。本标准参加起草单位:中国农业科学院畜牧研究所、吉林省农业科学院大豆研究所和农业部谷物质量检侧中心。本标准起草人:常碧影、张瑜、阎惠文、张明、梁维英、李静梅。中华人民共和国国家标准饲料中氨基酸的测定GBTDeterminationofaminoacidsinfeeds范围本标准规定了饲料中氨基酸的测定方法。本标准适用于配合饲料、浓缩饲料、添加剂预混合饲料、单一饲料和预混料中氨基酸总量和添加游离氨基酸的测定。酸、碱水解法适于含动、植物蛋白的单一饲料、配合饲料、浓缩饲料和预混料中氨基酸总量的测定。酸水解法不能测定色氨酸其中常规水解法适于测定除含硫氨基酸(胧氨酸和蛋氨酸等)以外的蛋白水解氨基酸氧化水解法在以偏重亚硫酸钠为氧化终止剂时适于测定除酪氨酸以外的蛋白水解氨基酸在以氢嗅酸为终止剂时适于测定除酪氨酸、苯丙氨酸和组氨酸以外的蛋白水解氨基酸。碱水解法只适于色氨酸的测定。酸提取法适于配合饲料、预混料和浓缩饲料中添加氨基酸主要是赖氨酸、蛋氨酸含量的测定也可用于苏氨酸等其他添加(游离)氨基酸含量的测定。引用标准下列标准所包含的条文通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时所示版本均为有效。所有标准都会被修订使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性GT饲料中粗蛋白测定方法(eqvISO:)GBT饲料粗脂肪测定方法(eqvISO:)(BT饲料中含硫氨基酸测定方法离子交换色谱法方法原理酸水解法常规(直接)水解法是使饲料蛋白在'C,c(HC)=molL盐酸作用下水解成单一氨基酸再经离子交换色谱法分离并以苟三酮做柱后衍生测定。水解中色氨酸全部破坏不能测量。胧氨酸和蛋氨酸部分氧化不能测准。氧化水解法是将饲料蛋白中的含硫氨基酸(恍氨酸、半胧氨酸和蛋氨酸等)用过甲酸氧化然后进行酸解再经离子交换色谱分离、测定(详见GBT)。水解中色氨酸破坏不能测定。酪氨酸在以偏重亚硫酸钠做氧化终止剂时被氧化不能测准。酪氨酸、苯丙氨酸和组氨酸则在以氢漠酸作终止剂时被氧化不能测准。碱水解法词料蛋白在C,碱的作用下水解水解出的色氨酸可用离子交换色谱或高效反相色谱(见附录八)分离、测定酸提取法饲料中添加的氨基酸以稀盐酸提取再经离子交换色谱分离、测定国家质量技术监督局一批准一一实施GBT试剂和材料除特别注明者外所有试剂均为分析纯水为去离子水电导率小于sm酸水解法常规水解门酸解剂一一盐酸溶液c(HCl)=molL:将优级纯盐酸与水等体积混合液氮或干冰一乙醇(丙酮)。门门稀释上机用柠檬酸钠缓冲液pH,c(Na')二。molL:称取柠檬酸三钠g用水溶解后加入优级纯盐酸ml硫二甘醇mL苯酚Ig加水定容至mL摇匀用G垂熔玻璃砂芯漏斗过滤备用。不同pH和离子强度的洗脱用柠檬酸钠缓冲液:按仪器说明书配制。门布三酮溶液:按仪器说明书配制。氨基酸混合标准储备液:含L一夭门冬氨酸、L一苏氨酸等种常规蛋白水解液分析用层析纯氨基酸各组分浓度c(氨基酸)=(或)KmolmL,混合氨基酸标准工作液:吸取一定量的氨基酸混合标准储备液(()置于mL容量瓶中以稀释上机用柠橄酸钠缓冲液(()定容混匀使各氨基酸组分浓度。(氨基酸)=nmolmL,氧化水解按GBT中氧化水解步骤操作。碱水解法碱解剂氢氧化a溶液‘(l,iOH)=molI:称取一水合氢氧化锉g用水溶解并稀释至mL使用前取适量超声或通氮脱气。液氮或干冰一乙醉(丙酮)。盐酸溶液c(HCU=molL:配制方法同,稀释上机用柠檬酸钠缓冲液pH,c(Na')=molL:称取柠檬酸三钠g,,化钠g和柠檬酸g,溶于ml水加人硫二甘醇mL和辛酸。mL最后定容至m工。不同pH和离子强度的洗脱用柠檬酸钠缓冲液与苟三酮溶液:按仪器说明书配制。L一色氨酸标准储备液:准确称取层析纯L一色氨酸mg加少许水和数滴。molI氢氧化钠使之溶解定量地转移至ml容量瓶中加水至刻度。:(色氨酸)=yMOIMI。氨基酸混合标准储备液:同,混合氨基酸标准工作液:准确吸取mLL一色氨酸标准储备液和适量的氨基酸混合标准储备液置于mL容量瓶中并用pH稀释上机用柠檬酸钠缓冲液(()定容。该液色氨酸浓度为nmolml而其他氨基酸浓度为nmolmL,酸提取法提取剂盐酸溶液,c(HCI)二。molL:取ml优级纯盐酸用水定容至ml混匀。不同pH和离子强度的洗脱用柠檬酸钠缓冲液:按仪器说明书配制。茹三酮溶液:按仪器说明书配制。蛋氨酸、赖氨酸和苏氨酸标准储备液:于三只mL烧杯中分别称取蛋氨酸mg、赖氨酸盐酸盐mg和苏氨酸mg加水约mL和数滴盐酸溶解定量地转移至各自的ml容量瓶中并用水定容。该液各氨基酸浓度。(氨基酸)=kmolmL,混合氨基酸标准工作液:分别吸取蛋氨酸、赖氨酸和苏氨酸标准储备液各mL于同一uil容准瓶中用水稀释至刻度。该液各氨基酸的浓度。(氨基酸)=nmolm工GBT仪器、设备门实验室用样品粉碎机。样品筛:孔径。mm分析天平:感量。g,真空泵与真空规。喷灯或熔焊机恒温箱或水解炉。旋转蒸发器或浓缩器:可在室温至℃间调温控温精度士`C真空度可低至X'Pa(mm汞柱)。氨基酸自动分析仪:茹三酮柱后衍生离子交换色谱仪要求各氨基酸的分辨率大于样品取具代表性的饲料样品用四分法缩减分取g左右粉碎并过。mm孔径(目)筛充分混匀后装入磨口瓶中备用。酸水解样品按GBT测定蛋白质含量。碱水解样品按GBT测定粗脂肪含量。对于粗脂肪含量大于、等于的样品需将脱脂后的样品风干、混匀装入密闭容器中备用。而对粗脂肪小于的样品则可直接秤用未脱脂样品。了分析步骤样品前处理酸水解法常规水解法:称取含蛋白mg的试样(约^mg,准确至。mg)于m工安瓶中加ml酸解剂(()置液氮或干冰(丙酮)中冷冻然后抽真空至Pa(<X'mm汞柱)后封口。将水解管放在(士)℃恒温干燥箱中水解^h。冷却混匀开管过滤用移液管吸取适量的滤液置旋转蒸发器或浓缩器中、称·抽真空蒸发至干必要时加少许水重复蒸干次。加入^mLpH稀释上机用柠檬酸钠缓冲液(()使样液中氨基酸浓度达nmolml摇匀过滤或离心取上清液上机测定。门氧化水解法:按GBT中规定操作。门碱水解法:称取^mg的饲料试样(准确至mg),置于聚四氟乙烯衬管中加ml,碱解剂(()于液氮或干冰乙醇(丙酉剐中(()冷冻而后将衬管插入水解玻管抽真空至Pa(<X,mm汞柱)或充氮(至少min)封管。然后将水解管放入(士)℃恒温干燥箱水解h。取出水解管冷至室温开管用稀释上机用柠檬酸钠缓冲液(()将水解液定量地转移到ML或ml容量瓶中加入盐酸溶液(()约mL中和并用上述缓冲液定容。离心或用pm滤膜过滤后取清液贮于冰箱中供上机测定使用。酸提取法:称取g饲料试样(蛋氨酸含量<mg赖氨酸可略高)加。molI盐酸提取剂()mI,搅拌提取min沉放片刻将上清液过滤到m工容量瓶中残渣加水mL,搅拌min重复提取两次再将上清液过滤到上述容量瓶中用水冲洗提取瓶和滤纸上的残渣并定容摇匀清液供上机测定。若试样提取过程中过滤太慢也可离心min(rmin),测定赖氨酸时预混料和浓缩饲料基质会有较大干扰应针对待测试样同时做添加回收率实验以校准测定结果。测定用相应的混合氨基酸标准工作液(如,或等)按仪器说明书调整仪器操作冬数和(或)洗脱用柠檬酸钠缓冲液的pH使各氨基酸分辨率)注入制备好的试样水解I:和川应的csT氨基酸混合标准工作液进行分析测定。酸解液每个单样为一组碱解液和酸提取液每个单样为一组组间插人混合氨基酸标准工作液进行校准。分析结果的表述分别用式(()和式()计算氨基酸在试样中的质量百分比:w(})一会X。一XDX,(Yo)一会X(一)X。一XDX‘。。式中:。L用未脱脂试样测定的某氨基酸的含量。一用脱脂试样测定的色氨基酸的含量A,一每毫升上机水解液中氨基酸的含量,ngA一每毫升上机液中色氨酸的含量,ngm一试样质量,mgD一试祥稀释倍数F一样品中的脂肪含量。以两个平行试样测定结果的算术平均值报告结果保留两位小数。允许差对于酸解或酸提取液测定的氨基酸当含量小于或等于。时不大于含量大于。肠时不大于写。对于色氨酸当含量小于差不大于。含量大于、等于时相对偏差不大于a两个平行试样测定值的相对偏差呢时两个平行试样测定值相GBT附录A(标准的附录)色氮酸测定反相高效液相色谱(RPHPLC)法除测定时将氨基酸分析仪更换为反相液相色谱仪、相应的洗脱用柠檬酸钠缓冲液更换为下述流动相以及用下述具体的仪器测定条件外其试剂、设备、样品前处理以及结果计算、表述和允许差等均同正文A液相色谱仪具适当内径、长度和柱材粒度的C柱(如cmXmm内径的pBondapakCl柱)、紫外(UV)或荧光检测器。A流动相乙酸钠缓冲液〔c(Na')=molL的乙酸钠溶液用乙酸调节pH至用。pm的滤膜过滤〕甲醇=,A测定条件:柱温:室温流动相流速:mLmin检测:紫外检测波长:nm荧光检测:激发波长:nm发射波长:nm进样量:IAL,先从混合氨基酸标准工作液开始分析每个水解液为一组组间插入氨基酸标准工作液(()进行校准。

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