下载
加入VIP
  • 专属下载特权
  • 现金文档折扣购买
  • VIP免费专区
  • 千万文档免费下载

上传资料

关闭

关闭

关闭

封号提示

内容

首页 ELISA的原理及操作、注意事项

ELISA的原理及操作、注意事项.pdf

ELISA的原理及操作、注意事项

偶然
2011-06-11 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《ELISA的原理及操作、注意事项pdf》,可适用于高等教育领域

电话:传真:地址:中国武汉#关山二路创业园邮编:三鹰生物技术有限公司SANYINGBIOTECHNOLOGY,INCElisa的原理及操作、注意事项一、ELISA基础知识ELISA是一种免疫测定。免疫测定(immunoassayIA)是应用免疫学技术测定标本的方法。在临床检验中主要通过抗原抗体反应检测体液中的抗体或抗原性物质。抗原抗原是能在机体中引起特异性免疫应答的物质。抗原进入机体后可刺激机体产生抗体和引起细胞免疫。在免疫测定中抗原是指能与抗体结合的物质。能在机体中引起抗体产生的抗原多为分子量大于的蛋白质例如乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)、甲胎蛋白(AFP)等。小分子化合物在与大分子蛋白质结合后能引起机体产生特异性抗体的称为半抗原(hapten)。例如某些激素、药物等。抗原的反应性取决于抗原决定簇(antigenicdeterminant)或称为表位(epitope)。一个抗原分子可带有不同的决定簇例如中可带有等决定簇。抗体抗体的结构抗体是能与抗原特异性结合的免疫球蛋白(immunoglobulinIg)。Ig分五类即IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。与免疫测定有关的Ig主要为IgG和IgM。Ig由两个轻链(L)和两个重链(H)的单体组成。Ig的轻链是相同的有κ(kappa)和λ(Lambda)两种型别。五类Ig的重链结构不同这决定了它们的抗原性也不同。IgG和IgM的重链分别称为γ(gamma)链和μ(mu)链。IgG的结构见图。①木瓜酶裂解部位②胃蛋白酶裂解部位电话:传真:地址:中国武汉关山二路创业园#邮编:三鹰生物技术有限公司SANYINGBIOTECHNOLOGY,INC重链和轻链的N端的氨基酸排列顺序因各种抗体而异称为可变区分别用VH和VL表示。两者构成抗体的抗原结合部位只与相应的抗原决定簇匹配发生特异性结合(见图)是抗体专一性结合抗原的结构基础。IgG可被木瓜蛋白酶分解为三个区段其中两个相同的区段称抗原结合片段(Fab)。每个Fab都保存结合抗原的能力但只有一个抗原结合位点是单价的与抗原结合后不出现凝集或沉淀。另一区段称Fc段无抗体活性但具有IgG特有的抗原性。IgG可被胃蛋白酶分解为两个片段一个Fab双体称F(ab')能和两个相同的抗原结合另一片段类似Fc随后被分解成小分子多肽无生物活性。IgM是由五个单体组成的五聚体含个重链和个轻链具有个抗原结合价由于空间位置的影响只表现为五个抗原结合价。IgM分子量约为IgG分子量约为。机体被微生物感染后先产生IgM抗体然后产生IgG抗体。经过一段时间IgM抗体量逐渐减少而消失而IgG抗体可长期存在在疾病痊愈后可持续数年之久。IgM抗体一般为保护性抗体具有免疫性。因此IgM抗体的测定对某些传染病如甲型肝炎有较高的临床诊断价值。右图为为甲型肝炎病人血清中IgG抗体和IgM抗体出现的时间和水平。抗体的产生机体受抗原刺激后B淋巴细胞产生相应的抗体。含有抗体的血清称为抗血清(antiserum)。每一系B细胞只产生针对某一抗原决定簇的抗体。如将多种抗原或含有多个抗原决定簇的抗原注入机体则将由多系的B细胞产生相应的多种抗体这些抗体均存在于免疫血清中。免疫测定中所用的抗血清一般用抗原免疫兔、羊或马制得。产生抗体的B细胞可在体外与繁殖力强的肿瘤细胞融合成杂交瘤细胞。将单个杂交瘤细胞分离在体内或体外培养而分泌的抗体单克隆抗体(monoclonalantibodyMcAb或Mab)。单克隆抗体仅针对一种抗原决定簇具有很高的特异性。单克隆抗体通常用抗原免疫小鼠制备。将免疫的脾电话:传真:地址:中国武汉#关山二路创业园邮编:三鹰生物技术有限公司SANYINGBIOTECHNOLOGY,INC细胞(含产生抗体的B细胞)与小鼠肿瘤细胞融合分离杂交瘤细胞接种于小鼠腹腔产生的腹水中含有浓度很高的单克隆抗体。抗原抗体反应可逆性抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态平衡其反应式为:AgAb→Ag·Ab抗体的亲和力(affinity)是抗原抗体间的固有结合力可以用平衡常数K表示:K=Ag·Ab/AgAbAg·Ab的解离程度与K值有关。高亲和力抗体的抗原结合点与抗原的决定簇在空间构型上非常适合两者结合牢固不易解离。解离后的抗原或抗体均能保持原有的结构和活性因此可用亲和层析法来提纯抗原或抗体。在抗血清中特异性的IgG抗体仅占总IgG中的极小部分。用亲和层析法提取的特异性抗体称为亲和层析纯抗体应用于免疫测定中可得到更好的效果。最适比例在恒定量的抗体中加入递增量的抗原形成抗体复合物(沉淀)的量见图。曲线的高峰部分是抗原抗体比例最合适的范围称为等价带(zoneofequivalence)。在等价带前后分别为抗体过剩带和抗原过剩带。如果抗原或抗体极度过剩则无沉淀物形成在免疫测定中称为带现象(zonephenomenon)。抗体过量称为前带(prezone)抗原地过量称为后带(postzone)。在用免疫学方法测定抗原时应使反应系统中有足够的抗体量否则测得的量会小于实际含量甚至出现假阴性。特异性抗原抗体的结合实质上只发生在抗原的抗原决定簇与抗体的抗原结合位点之间。由于两者在化学结构和空间构型上呈互补关系所以抗原抗体反应具有高度的特异性。例如乙肝病毒中的表面抗原(HBsAg)、e抗原(HBeAg)和核心抗体(HBcAg)随来源于同一病毒但仅与其相应的抗体结合而不与另外两种抗体反应。抗原抗体反应的这种特异性使免疫测定能在一非常复杂的蛋白质化合物(例如血清)中测定某一特定的物质而不需先分离待检物。但是这种特异性也不是绝对的。假使两种化合物有着部分相同的结构在抗原抗体反应中可出现交叉反应。例如:绒毛膜促性腺激素(hCG)和黄体生成激素(LH)均由α和β两个亚单位组成其结构的不同处在β亚单位而两者的α亚单位是同类的。用hCG免疫动物所得的抗血清中含有抗αhCG和抗βhCG两种抗体抗αhCG抗体将与LH中的α酶位发生交叉反应。在临床检验中如用抗hCG抗血清作为妊娠诊断试剂检定尿液中hCG只能用于hCG浓度较高的试验否则妇女生理性排泄入尿液中的微量LH将与之发生交叉反应。因此在作为早孕诊断(敏感度应达到mIumlhCG)的实际中必须应用只对hCG特异的抗βhCG以避免与其它激素的交叉反应的发生。敏感性在测定血清中某一物质的含量时化学比色法的敏感度为mgml水平酶反应测定法的敏感度约为~μgml免疫测定中凝胶扩散法和浊度法的敏感度与酶反应法相仿。标记的免疫测定的敏感度可提高数千倍达ngml水平。例如用放射免疫测定法或酶免疫测定法测定HBsAg其敏感度可达ngml。免疫测定在临床检验中的应用由于各种抗原成份包括小分子的半抗原均可用以制备特异性的抗血清或单克隆抗体电话:传真:地址:中国武汉#关山二路创业园邮编:三鹰生物技术有限公司SANYINGBIOTECHNOLOGY,INC利用此抗体作为试剂就可检测标本中相应的抗原因此免疫测定的应用范围极广在临床检验中可用于测定:)体液中的各种蛋白质包括含量极少的蛋白质如甲胎蛋白等。)激素包括小分子量的甾体激素等。)抗生素和药物。)病原体抗原HBsAg、HBeAg等。)另外也可利用纯化的抗原检测标本中的抗体例如抗HBs等。标记的免疫测定如上所述免疫测定是一种很敏感的测定方法抗原抗体反应后直接测定形成的沉淀或浊度敏感度可达~μgml但在临床检验中某些待测物在标本中的含量远低于这一水平因此要寻找增加敏感度的方法。标记的免疫测定是将检测试剂中的抗原或抗体用可微量测定的物质加以标记通过测定标记物来提高敏感度。在放射免疫测定和酶免疫测定中标记物分别为放射性核素和酶最后用测定放射性和酶活力来计算待检物的量敏感度可比直接测定沉淀物提高数百至数千倍。在标记免疫测定中一般加入过量的标记试剂以保证与待测物彻底反应。以标记抗体(Ab※)检测抗原(Ag)为例反应式如下:AgAb※→AgAb※Ab※在反应产物中有与Ag结合的Ab※和游离和Ab※如不将两者分离而测定标记物测得的结果将为两者之和。因此游离标记物与结合标记物的分离是标记免疫测定中的重要步骤。可采用多种手段固相载体是其中之一。如将抗原或抗体包被在固相载体上然后再与标记的抗原或抗体直接反应结合的标记物被固定在载体上而游离的标记物留于溶液中。这样可以通过洗涤将游离的Ab※除去结合标记物的测定可在固相上进行。.酶免疫测定酶免疫测定(enzymeimmunoassay)可分为均相(homogenous)和非均相(heterogenous)两种类型。在均相EIA中可不需进行游离的和结合的标记物的分离而直接测定标记物。例如在某种条件下抗原抗体反应后形成的酶标记抗原抗体复合物中的酶失去其对底物作用的活力因而测出的酶活力直接反映游离的酶标记物。均相EIA在临床检验中较少应用。非均相EIA需先进行游离的和结合的标记物的分离。如前所述固相载体可用作一种分离手段。这种固相酶免疫测定方法在年最初建立时称为酶联免疫吸附剂测定(enzymelinkedimmunosorbentassay)简称ELISA在国内有译作酶联免疫吸附试验的虽然含义不完全确切但已习用。二、ELISA的原理和类型ELISA的原理ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性又保留酶的活性。在测定时受检标本(测定其中的抗体或抗原)与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反电话:传真:地址:中国武汉#关山二路创业园邮编:三鹰生物技术有限公司SANYINGBIOTECHNOLOGY,INC应的底物后底物被酶催化成为有色产物产物的量与标本中受检物质的量直接相关故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高间接地放大了免疫反应的结果使测定方法达到很高的敏感度。ELISA的类型ELISA可用于测定抗原也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要的试剂:()固相的抗菌素原或抗体即"免疫吸附剂"(immunosorbent)()酶标记的抗原或抗体称为"结合物"(conjugate)()酶反应的底物。根据试剂的来源和标本的情况以及检测的具体条件可设计出各种不类型的检测方法。用于临床检验的ELISA主要有以下几种类型:双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法操作步骤如下:)将特异性抗体与固相载体联结形成固相抗体。洗涤除去未结合的抗体及杂质。)加受检标本保温反应。标本中的抗原与固相抗体结合形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去其他未结合物质。)加酶标抗体保温反应。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。)加底物显色。固相上的酶催化底物成为有色产物。通过比色测知标本中抗原的量。在临床检验中此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。只要获得针对受检抗原的异性抗体就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。如抗体的来源为抗血清包被和酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动物。如应用单克隆抗体一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗分别用于包被固相载体和制备酶结合物。这种双位点夹心法具有很高的特异性而且可以将受检标本和酶标抗体一起保温反应作一步检测。在一步法测定中当标本中受检抗原的含量很高时过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合而不再形成"夹心复合物"。类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象此时反应后显色的吸光值(位于抗原过剩带上)与标准曲线(位于抗体过剩带上)某一抗原浓度的吸光值电话:传真:地址:中国武汉#关山二路创业园邮编:三鹰生物技术有限公司SANYINGBIOTECHNOLOGY,INC相同(参见图)如按常法测读所得结果将低于实际的含量这种现象被称为钩状效应(hookeffect)因为标准曲线到达高峰后呈钩状弯落。钩状效应严重时反应甚至可不显色而出现假阴性结果。因此在使用一步法试剂测定标本中含量可异常增高的物质(例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等)时应注意可测范围的最高值。用高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削弱钩状效应。假使在被测分子的不同位点上含有多个相同的决定簇例如HBsAg的a决定簇也可用针对此决定的同一单抗分别包被固相和制备酶结合物。但在HBsAg的检测中应注意亚型问题HBsAg有adr、adw、ayr、ayw个亚型虽然每种亚型均有相同的a决定簇的反应性这也是用单抗作夹心法应注意的问题。双抗体夹心法测抗原的另一注意点是类风湿因子(RF)的干扰。RF是一种自身抗体多为IgM型能和多种动物IgG的Fc段结合。用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含有RF它可充当抗原成份同时与固相抗体和酶标抗体结合表现出假阳性反应。采用F(ab')或Fab片段作酶结合物的试剂由于去除了Fc段从而消除RF的干扰。双抗体夹心法ELISA试剂是否受RF的影响已被列为这类试剂的一项考核指标(参见)。双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原因其不能形成两位点夹心。双抗原夹心法测抗体反应模式与双抗体夹心法类似。用特异性抗原进行包被和制备酶结合物以检测相应的抗体。与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体。此法中受检标本不需稀释可直接用于测定因此其敏感度相对高于间接法。乙肝标志物中抗HBs的检测常采用本法。本法关键在于酶标抗原的制备应根据抗原结构的不同寻找合适的标记方法。间接法测抗体间接法是检测抗体常用的方法。其原理为利用酶标记的抗抗体(抗人免疫球蛋白抗体)以检测与固相抗原结合的受检抗体故称为间接法(见图)。操作步骤如下:)将特异性抗原与固相载体联结形成固相抗原。洗涤除去未结合的抗原及杂质。)加稀释的受检血清保温反应。血清中的特异抗体与固相抗原结合形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后固相载体上只留下特异性抗体血清中的其他成份在洗涤过程中被洗去。)加酶标抗抗体。可用酶标抗人Ig以检测总抗体但一般多用酶标抗人IgG检测IgG抗体。电话:传真:地址:中国武汉#关山二路创业园邮编:三鹰生物技术有限公司SANYINGBIOTECHNOLOGY,INC固相免疫复合物中的抗体与酶标抗体抗体结合从而间接地标记上酶。洗涤后固相载体上的酶量与标本中受检抗体的量正相关。)加底物显色本法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病的诊断。间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。间接法成功的关键在于抗原的纯度。虽然有时用粗提抗原包被也能取得实际有效的结果但应尽可能予以纯化以提高试验的特异性。特别应注意除去能与一般健康人血清发生反应的杂质例如以EColi为工程酶的重组抗原如其中含有EColi成份很可能与受过EColi感染者血甭中的抗EColi抗体发生反应。抗原中也不能含有与酶标抗人Ig反应的物质例如来自人血浆或人体组织的抗原如不将其中的Ig去除试验中也发生假阳性反应。另外如抗原中含有无关蛋白也会因竟争吸附而影响包被效果。间接法中另一种干扰因素为正常血清中所含的高浓度的非特异性。病人血清中受检的特异性IgG只占总IgG中的一小部分。IgG的吸附性很强非特异IgG可直接吸附到固相载体上有时也可吸附到包被抗原的表面。因此在间接法中抗原包被后一般用无关蛋白质(例如牛血清蛋白)再包被一次以封闭(blocking)固相上的空余间隙。另外在检测过程中标本须先行稀释(:~:)以避免过高的阴性本底影响结果的判断。竞争法测抗体当抗原材料中的干扰物质不易除去或不易得到足够的纯化抗原时可用此法检测特异性抗体。其原理为标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合。标本中抗体量越多结合在固相上的酶标抗体愈少因此阳性反应呈色浅于阴性反应。如抗原为高纯度的可直接包被固相。如抗原中会有干扰物质直接包被不易成功可采用捕获包被法即先包被与固相抗原相应的抗体然后加入抗原形成固相抗原。洗涤除去抗原中的杂质然后再加标本和酶标抗体进行竞争结合反应。竞争法测抗体有多种模式可将标本和酶标抗体与固相抗原竞争结合抗HBcELISA一般采用此法。另一种模式为将标本与抗原一起加入到固相抗体中进行竞争结合洗涤后再加入酶标抗体与结合在固相上的抗原反应。抗HBe的检测一般采用此法。竞争法测抗原小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的位点因此不能用双抗体夹心法进电话:传真:地址:中国武汉#关山二路创业园邮编:三鹰生物技术有限公司SANYINGBIOTECHNOLOGY,INC行测定可以采用竞争法模式。其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量含量愈多结合在固相上的酶标抗原愈少最后的显色也愈浅。小分子激素、药物等ELISA测定多用此法。捕获包被法测抗体IgM抗体的检测用于传染病的早期诊断中。间接法ELISA一般仅适用于检测总抗体或IgG抗体。如用抗原包被的间接法直接测定IgM抗体因标本中一般同时存在较高浓度的IgG抗体后者将竞争结合固相抗原而使一部份IgM抗体不能结合到固相上。因此如用抗人IgM作为二抗间接测定IgM抗体必须先将标本用A蛋白或抗IgG抗体处理以除去IgG的干扰。在临床检验中测定抗体IgM时多采用捕获包被法。先用抗人IgM抗体包被固相以捕获血清标本中的IgM(其中包括针对抗原的特异性IgM抗体和非特异性的IgM)。然后加入抗原此抗原仅与特异性IgM相结合。继而加酶标记针对抗原的特异性抗体。再与底物作用呈色即与标本中的IgM成正相关。此法常用于病毒性感染的早期诊断。甲型肝炎病毒(HAV)抗体的检测模式见图。类风湿因子(RF)同样能干扰捕获包被法测定IgM抗体导致假阳性反应。因此中和IgG的间接法近来颇受青睐用这类试剂检测抗CMVIgGM和抗弓形虫IgM抗体已获成功。ABSELISA法ABS为亲和素(avidin)生物素(biotin)系统(system)的略语。亲和素是一种糖蛋白分子量每个分子由个能和生物素结合的亚基组成。生物素为小分子化合物分子量。用化学方法制成的衍生物素羟基琥珀酰亚胺酯可与蛋白质和糖等多种类型的大小分子形成生物素标记产物标记方法颇为简便。生物素与亲和素的结合具有很强的特异性其亲和力较抗原抗体反应大得多两者一经结合就极为稳定。由于一个亲和素可与个生物素分子结合因此如把ABS与ELISA法可分为酶标记亲和素生物素(LAB)法和桥联亲和素生物素(ABC)法两种类型。两者均以生物素标记的抗体(或抗原)代替原ELISA系统中的酶标抗体(抗原)。在LAB中固相生物素先与不标记的亲和素反应然后再加酶标记的生物素以进一步提高敏感度。在早期亲和素从蛋清中提取这种卵亲和素为碱性糖蛋白与聚苯乙烯载体的吸附性很强用于ELISA中可使本底增高。从链霉菌中提取的链霉亲和素则无电话:传真:地址:中国武汉#关山二路创业园邮编:三鹰生物技术有限公司SANYINGBIOTECHNOLOGY,INC此缺点在ELISA应用中有替代前者的趋势。由于ABSELISA较普通ELISA多用了两种试剂增加了操作步骤在临床检验中ABSELISA应用不多。三、ELISA的试剂在临床检验中一般采用商品试剂盒进行测定。前文()已述ELISA中有三个必要的试剂:免疫吸附剂、结合物和酶的底物。完整的ELISA试剂盒包含以下各组分:()已包被抗原或抗体的固相载体(免疫吸附剂)()酶标记的抗原或抗体(结合物)()酶的底物()阴性对照品和阳性对照品(定性测定中)参考标准品和控制血清(定量测定中)()结合物及标本的稀释液()洗涤液()酶反应终止液。免疫吸附剂已包被抗原或抗体的固相载体在低温(~℃)干燥的条件下一般可保存个月。有些不完整的试盒仅供应包被用抗原或抗体检测人员需自行包被。以下简述固相载体和包被过程。固相载体固相载体在ELISA测定过程中作为吸附剂和容器不参与化学反应。可作ELISA中载体的材料很多最常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能抗体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性加之它的价格低廉所以被普遍采用。聚苯乙烯为塑料可制成各种形式。ELISA载体的形状主要有三种:微量滴定板、小珠和小试管。以微量滴定板最为常用专用于EILSA的产品称为ELISA板国际上标准的微量滴定板为×的孔式。为便于作少量标本的检测有制成联孔条或联孔条的放入座架后大小与标准ELISA板相同。ELISA板的特点是可以同时进行大量标本的检测并可在特制的比色计上迅速读出结果。现在已有多种自动化仪器用于微量滴定板型的ELISA检测包括加样、洗涤、保温、比色等步骤对操作的标准化极为有利。聚苯乙烯经射线照射后其吸附性能特别是对免疫球蛋白的吸附性能增加应用于双抗体夹心法可使固相上抗体量增多但用于间接法测抗体时空白值较大。良好的ELISA板应该是吸附性能好空白值低孔底透明度高各板之间、同一板各孔之间、同一板各孔之间性能相近。聚苯乙烯ELISA板由于原料的不同和制作工艺的差别各种产品的质量差异很大因此每一批号的ELISA板在使用前须事先检查其性能。常用的检查方法为:以一定浓度的人IgG(一般为ngml)包被ELISA板各孔洗涤后每孔内加入适当稀释度的酶标抗人IgG抗体保温后洗涤加底物显色终止酶反应后分别测每孔溶液的吸光度。控制反应条件使各孔读数在吸光度左右。计算全部读数的平均值。所有单个读数与全部读数的均数之差应小于。与聚苯乙烯类似的塑料是聚氯乙烯。作为ELISA固相载体聚氯乙烯的特点为质软板薄可剪割价廉但光洁度不如聚苯乙烯板孔底亦不如聚苯乙烯平整。聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯高但空白值也略高。电话:传真:地址:中国武汉#关山二路创业园邮编:三鹰生物技术有限公司SANYINGBIOTECHNOLOGY,INC为比较不同固相在某一ELISA测定中的优劣可应用如下的试验:用其他免疫学测定方法选出一个典型的阳性标本和阴性标本将它们进行一系列稀释后在不同的固相载体上按预定的ELISA操作步骤进行测定然后比较结果。在哪一种载体上阳性结果与阴性结果差别最大这种载体就是这一ELISA测定项目的最合适的固相载体。在ELISA中用作固相载体的小珠一般为直径cm的圆珠表面经磨砂处理后吸附面积大大增加。ELISA板孔的吸附面积约为mm小珠均为mm将近ELISA板孔的倍。吸附面积的增大即意味着固相抗原或抗体量的增加。再者球型小珠的表面弧度更有利于吸附的抗原决定簇或抗体结合位点的暴露面处于最佳反应状态因此珠式ELISA的反应往往更为灵敏。小珠的另一特点是更易于使洗涤彻底使用特殊的洗涤器使小珠在洗涤过程中滚动淋洗其洗涤效果远较板孔的浸泡式为好。但由于磨砂工艺的难度较大小珠的均一性较差。小试管作为固相载体也有较大的吸附表面而且标本的反应量也相应增加。板式及珠式ELISA的标本量一般为ul而小试管可根据需要加大反应体积标本反应量的增加有助于试验敏感性的提高。小试管还可以当作比色杯最后直接放入分光光度计中比色。也有应用聚苯乙烯胶乳或其他材料制成的微粒作为ELISA固相载体的。其优点是表面积极大反应在悬液中进行其速率与液相反应近似。以含铁的磁性微粒作为ELISA固相载体反应后用磁铁的吸引进行分离洗涤方便试剂盒一般均配以特殊仪器。包被的方式将抗原或抗体固定在过程称为包被(coating)。换言之包被即是抗原或抗体结合到固相载体表面的过程。蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合的靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的作用于。这种物理吸附是非特异性的受蛋白质的分子量、等电点、浓度等的影响。载体对不同蛋白质的吸附能力是不相同的大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多的疏水基团故更易吸附到固相载体表面。IgG对聚苯乙烯等固相具有较强的吸附力其联结多发生在Fc段上抗体结合点暴露于外因此抗体的包被一般均采用直接吸附法。蛋白质抗原大多也可采用与抗体相似的方法包被。当抗原决定簇存在于或邻近于疏水区域时抗原与固相载体的直接吸附可使抗原决定簇不能充分暴露在这种情况下直接包被效果不佳可以采用间接的捕获包被法即先将针对该抗原的特异抗体作预包被其后通过抗原抗体反应使抗原固相化。此间接结合在固相上的抗原远离载体表面其抗原决定簇也得以充分暴露。间接包被的抗原经固相抗体的亲和层析作用包被在固相上的抗原纯度大大提高因此含杂质较多的抗原也可采用捕获包被法(见)试验的特异性、敏感性均由此得以改善重复性亦佳。间接包被的另一优点是抗原用量少仅为直接包被的乃至于。不易吸附在聚苯乙烯载体上的非蛋白质抗原可采用特殊的包被方式。例如在检测抗DNA抗体时需用DNA作为包被抗原而普遍的固相载体一般不能直接与核酸结合。可将聚苯乙烯板先经紫外线照射(例如W紫外灯cm照射小时)以增加其吸附性能。固相载体先用碱性蛋白质如聚赖氨酸、鱼精蛋白等作预包被也可提高核酸的结合力。也可用亲和素生物素系统作间接包被即用亲和素先包被载体然后加入生物素化的DNA这种包被方法均匀、牢固已扩大应用于各种抗原物质的定量测定。脂类物质无法与固相载体结合可将其在有机溶剂(例如乙醇)中溶解后加入ELISA板孔中开盖置冰箱过夜或冷风吹干待酒精挥发后让脂质自然干固在固相表面。抗心磷脂抗体的ELISA试剂一般采用这种包被方式。电话:传真:地址:中国武汉#关山二路创业园邮编:三鹰生物技术有限公司SANYINGBIOTECHNOLOGY,INC包被用抗原用于包被固相载体的抗原按其来源不同可分为天然抗原、重组抗原和合成多肽抗原三大类。天然抗原可取自动物组织、微生物培养物等须经提取纯化才能作包被用。如HBsAg可以从携带者的血清中提取一般的细菌和病毒抗原可以从其培养物中提取蛋白成份抗原可从富含此抗原的材料中提取等(例如AFP从脐带血或胎肝中提取)。重组抗原是抗原基因在质粒体中表达的蛋白质抗原多以大肠杆菌或酵母菌为质粒体。重组抗原的优点是除工程菌成份外其他杂质少而且无传染性但纯化技术难度较大。以大肠杆菌为质粒体的重组抗原如不能充分除大肠杆菌成份用于ELISA在反应中可出现假阳性因不少受检者受大肠杆菌感染而在血清中存在抗大肠杆菌抗体。重组抗原的另一特点是能用基因工程制备某些无法从天然材料中分离的抗原物质。例如丙型肝炎病毒(HCV)尚不能培养成功而且丙肝病人血清中HCV抗原含量极微。目前检测抗HCVELISA中所用包被抗原大多为根据HCV的基因克隆表达而制备的重组抗原。在传染病诊断中不少重组抗原如HBsAg、HBeAg和HIV抗原等均在ELISA中取得应用。合成多肽抗原是根据蛋白质抗原分子的某一抗原决定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。多肽抗原一般只含有一个抗原决定簇纯度高特异性也高但由于分子量太小往往难于直接吸附于固相上。多肽抗原的包被一般需先使其与无关蛋白质如牛血清白蛋白质(BSA)等偶联借助于偶联物与固相载体的吸附间接地结合到固相载体表面。应用多肽抗原的另一注意点为他仅能检测与其相应的抗体。一种蛋白质抗原往往含有多个不同的能引起抗体产生的决定簇因此在受检血清中的其他抗体就不能与该多肽抗原发生反应。另外某些微生物发生变异时往往发生抗原结构变化在这种情况下用个别多肽抗原进行包被可引起其他抗体的漏检。包被用抗体包被固相载体的抗体应具有高亲和力和高特异性可取材于抗血清或含单克隆抗体的腹水或培养液。如免疫用抗原中含有杂质(即便是极微量的)在抗血清中将出现杂抗体必须除去(可用吸收法)后才能用于ELISA以保证试验的特异性。抗血清不能直接用于包被应先提取IgG通常采用硫酸铵盐析和Sephadex凝胶过滤法。一般经硫酸铵盐析粗提的IgG已可用于包被高度纯化的IgG性质不稳定。如需用高亲和力的抗体包被以提高试验的敏感性则可采用亲和层析法以除去抗血清中含量较多的非特异性IgG。腹水中单抗的浓度较高特异性亦较强因此不需要作吸收和亲和层析处理一般可将腹水作适当稀释后直接包被必要时也可用纯化的IgG。应用单抗包被时应注意一种单抗仅针对一种抗原决定簇在某些情况下用多种单抗混合包被可取得更好的效果。包被的条件包被用抗原或抗体的浓度包被的温度和时间包被液的pH等应根据试验的特点和材料的性质而选定。抗体和蛋白质抗原一般采用pH的碳酸盐缓冲液作为稀释液也有用pH的磷酸盐缓冲液及pH~的TrisHCL缓冲液作为稀释液的。通常在ELISA板孔中加入包被液后在℃冰箱中放置过夜℃中保温小时被认为具有同等的包被效果。包被的最适当浓度随载体和包被物的性质可有很大的变化每批材料需通过实验与酶结合物的浓度协调选定。一般蛋白质的包被浓度为ngmlugml。封闭封闭(blocking)是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。抗原或抗体包电话:传真:地址:中国武汉#关山二路创业园邮编:三鹰生物技术有限公司SANYINGBIOTECHNOLOGY,INC被时所用的浓度较低吸收后固相载体表面尚有未被占据的空隙封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙从而排斥在ELISA其后的步骤中干扰物质的再吸附。封闭的手续与包被相类似。最常用的封闭剂是的牛血清白蛋白也有用的小牛血清或明胶作为封闭剂的。脱脂奶粉也是一种良好的封闭剂其最大的特点是价廉可以高浓度使用()。高质量的速溶食用低脂奶粉即可直接当作封闭剂使用但由于奶粉的成份复杂而且封闭后的载体不易长期保存因此在试剂盒的制备中较少应用。封闭是否必要取决于ELISA的模式及具体的实验条件。并非所有的ELISA固相均需封闭封闭不当反而会使阴性本底增高。一般说来双抗体夹心法只要酶标记物是高活性的操作时洗涤彻底不经封闭也可得到满意的结果。特别是用单抗腹水直接包被时因其中大量非抗体蛋白在包被时同样也吸附在固相表面业已起到了类似封闭剂的作用。但在间接法测定中封闭一般是不可少的(见)。包被好的ELISA板干燥后放入密封袋或锡袋中在低温可保存数月。结合物结合物即酶标记的抗体(或抗原)是ELISA中最关键的试剂。良好的结合物应该是既保有酶的催化活性也保持了抗体(或抗原)的免疫活性。结合物中酶与抗体(或抗原)之间有恰当的分子比例在结合试剂中应尽量不含有或少含有游离的(未结合的)酶或游离的抗体(或抗原)。此外结合物尚要有良好的稳定性。酶用于ELISA的酶应符合以下要求:纯度高催化反应的转化率高专一性强性质稳定来源丰富价格不贵制备成酶结合物后仍继续保留它的活性部分和催化能力。最好在受检标本中不存在相同的酶。另外它的相应底物易于制备和保存价格低廉有色产物易于测定等。在ELISA中常用的酶为辣根过氧化物酶(horseradishperoxidaseHRP)和碱性磷酸酶(alkalinephosohataseAP)。在少数商品ELISA试剂中应用的酶尚有葡萄糖氧化酶、βD半乳糖苷酶和脲酶等。国产ELISA试剂一般都用HRP制备结合物。HRP是一种糖蛋白含糖量约为分子量为是一种复合酶由主酶(酶蛋白)和辅基(亚铁血红素)结合而成是一种卟啉蛋白质。主酶无色糖蛋白在nm波长处有最高吸收峰辅基是深棕色的含铁卟啉环在nm波长处有最高吸收峰。HRP的纯度用RZ(ReinheitZahl德文意为纯度数)表示是nm的吸光度与nm吸光度之比高纯度的HRP的RZ≥。HRP除符合上述的ELISA中标记酶的要求外更有价格低廉和性质较稳定的特点。值得注意的是在选用酶制剂时除其纯度RZ外更应注意酶的活力。高纯度的酶如保存不当活力也会降低。酶制剂的活力以所含的酶活力单位表示可用对底物作用后生成产物量的测定进行试验。国外很多ELISA试剂采用碱性磷酸酶(AP)作为标记酶。常用的AP有两个来源分别从大肠杆菌和小牛肠膜中提取。不同来源的酶生化特性特性略不相同从大肠杆菌中提取的AP分子量为酶作用的最适合pH为用小牛肠膜中提取的AP分子量为最适pH为。在ELISA中AP系统的敏感度一般高于HRP系统空白值也较低但AP价格昂贵制备结合物所得率也较HRP低。电话:传真:地址:中国武汉#关山二路创业园邮编:三鹰生物技术有限公司SANYINGBIOTECHNOLOGY,INC抗原和抗体制备结合物时所用抗体一般均为纯度较高的IgG以免在与酶联结时其他杂蛋白的干扰。最好用亲和层析纯的抗体这样全部酶结合物均具有特异的免疫活性可以在高稀释度进行反应实验结果本底浅淡。如用F(ab')进行标记则更可避免标本中RF的干扰。在ELISA中用酶标抗原的模式不多总的要求是抗原必须是高纯度的。结合物的制备酶标记抗体的制备方法主要有两种即戊二醛交联法和过碘酸盐氧化法。()戊二醛交联法:戊二醛是一种双功能团试剂它可以使酶与蛋白质的氨基通过它而联结。碱性磷酸一般用此法进行标记。交联方法一步法、两步法两种。在一步法中戊二醛直接加入酶与抗体的混合物中反应后即得酶标记抗体。ELISA中常用的酶一般都用此法交联。它具有操作简便、有效(结合率达)和重复性好等优点。缺点是交联反应是随机的酶与抗体交联时分子间的比例不严格结合物的大小也不均一酶与酶抗体与抗体之间也有可能交联影响效果。在两步法中先将酶与戊二醛作用透析除去多余的戊二醛后再与抗体作用而形成酶标抗体。也可先将抗体与戊二醛作用再与酶联结。两步法的产物中绝大部分的酶与蛋白质是以:的比例结合的较一步法的酶结合物更有助于本底的改善以提高敏感度但其偶联的有效率较一步法低。()过碘酸盐氧化法:本法只适用于含糖量较高的酶。辣根过氧化物酶的标记常用此法。反应时过碘酸钠将HRP分子表面的多糖氧化为醛基很活泼可与蛋白质上的氨基形成Schiff氏碱而结合。酶标记物按克分子比例联结其最佳比例为:酶抗体=。此法简便有效一般认为是HRP最可取的标记方法但也有人认为所有试剂较为强烈各批实验结果不易重演。按以上方法制备的酶结合物一般都混有未结合物的酶和抗体。理论上结合物中混有的游离酶一般不影响ELISA中最后的酶活性测定因经过彻底洗涤游离酶可被除去并不影响最终的显色。但游离的抗体则不同它会与酶标抗体竞争相应的固相抗原从而减少了结合到固相上的酶标抗体的量。因此制备的酶结合物应予纯化去除游离的酶和抗体后用于检测效果更好。纯化的方法很多分离大分子化合物的方法均可应用。硫酸铵盐析法最为简便但效果并不理想因为此法只能去除留在上清中的游离酶但相当数量的游离抗体仍与酶结合物一起沉淀而不能分开。用离子交换层析或分子筛分离更为可取高效液相层析法可将制备的结合物清晰地分成三个部分:游离酶、游离抗体和纯结合物而取得最佳的分离效果但费用较贵。结合物制得后在用作ELISA试剂前尚需确定其适当的工作浓度。使用过浓的结合物既不经济又可使本底增高结合物的浓度过低则又影响检测的敏感性。所以必须对结合物的浓度予以选择。最适的工作浓度就是指结合物稀释至这一浓度时能维护一个低的本底并获得测定的最佳灵敏度达到最合适的测定条件和测定费用的节省。就酶标抗体本身而言它的有效工作浓度是指与其相应抗原包被的载体作试验时能得到阳性反应的最高稀释度。例如某一HRP:抗人IgG制剂标明的工作浓度为:表示该制剂经:稀释后在与人IgG包被的固相作ELISA试验时将发生阳性反应。但在用于具体的ELISA检测中酶标抗体的最适工作浓度受到固相载体的性质、包被抗原或抗体的纯度以及整个检测系统如标本、反应温度和时间等的影响因此必须在实际测定条件下进行"滴配"选择能达到高敏感度的最大稀释度作为试剂盒中的工作浓度。电话:传真:地址:中国武汉#关山二路创业园邮编:三鹰生物技术有限公司SANYINGBIOTECHNOLOGY,INC结合物的保存酶标抗体中的酶和抗体均为生物活性物质保存不当极易失活。高浓度的结合物较为稳定冰冻干燥后可在普通冰箱中保存一年左右但冻干过程中引起活力的减低而且使用时需经复溶颇为不便。结合物溶液中加入等体积的甘油可在低温冰箱或普通冰箱的冰格中较长时间保存。早期的ELISA试剂盒中的结合物一般均按以上两种形式供应配以稀释液(见)临用时按标明的稀释度稀释成工作液。现在较先进的ELISA试剂盒均已用合适的缓冲液配成工作液使用时不需再行稀释在℃保存期可达个月。由于蛋白质浓度较低结合物易失活需加入蛋白保护剂。另外再加入抗生素(例如庆大霉素)和防腐剂(HRP结合物加硫柳泵AP结合物可加叠氮钠)以防止细菌生长。结合物的稀释液用于稀释高浓度的结合物以配成工作液。为避免结合物在反应中直接吸附在固相载体上在稀释缓冲液中常加入高浓度的无关蛋白质(例如牛血清白蛋白)通过竞争以抑制结合物的吸附。一般还加入具有抑制蛋白质吸附于塑料表面的非离子型表面活性剂如吐温的浓度较为适宜高于时会洗掉包被在固相上的抗原或抗体减低实验灵敏度。在间接测定抗体时血清标本需稀释后进行测定也可应用这种稀释液。酶的底物HRP的底物HRP浓度越高的地方TMB与HO反应的越多TMB供氢越多变色越深。HRP催化过氧化物的氧化反应最具代表性的过氧化物为HO其反应式如下:DHHODHO上式中DH为供氧体HO为受氢体。在ELISA中DH一般为无色化合物经酶作用后成为有色的产物以便作比色测定。常用的供氢体有邻苯二胺(OphenylenediamineOPD)、四甲基联苯胺(,',,'tetramethylbenzidine,TMB)和ABTS,'azinodi(ethylbenziazobinesulfonate)。OPD氧化后的产物呈橙红色用酸终止酶反应后在nm处有最高吸收峰灵敏度高比色方便是HRP结合物最常用的底物。OPD本身难溶于水OPD·HCL为水溶性。曾有报道OPD有致异变性操作时应予注意。OPD见光易变质与过氧化氢混合成底物应用液后更不稳定须现配置现用。在试剂盒中OPD和HO一般分成二组分OPD可制成一定量的粉剂或片剂形式片剂中含有发泡助溶剂使用更为方便。过氧化氢则配入底物缓冲液中有制成易保存的浓缩液使用时用蒸馏水稀释。先进

用户评价(0)

关闭

新课改视野下建构高中语文教学实验成果报告(32KB)

抱歉,积分不足下载失败,请稍后再试!

提示

试读已结束,如需要继续阅读或者下载,敬请购买!

文档小程序码

使用微信“扫一扫”扫码寻找文档

1

打开微信

2

扫描小程序码

3

发布寻找信息

4

等待寻找结果

我知道了
评分:

/22

ELISA的原理及操作、注意事项

VIP

在线
客服

免费
邮箱

爱问共享资料服务号

扫描关注领取更多福利