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1、抗体的制备与应用.ppt

1、抗体的制备与应用

luoyi19861219
2011-06-07 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《1、抗体的制备与应用ppt》,可适用于自然科学领域

抗体的制备与应用参考书:医学免疫学纲要(研究生教材)。主编:章崇杰。四川大学出版社。医学实验技术的原理与选择(卫生部十一五规划教材)。主编:李幼平。人民卫生出版社。免疫教研室胡丽娟immunehulijuancom抗体的制备与应用参考书:医学免疫学纲要(研究生教材)。主编:章崇杰。四川大学出版社。医学实验技术的原理与选择(卫生部十一五规划教材)。主编:李幼平。人民卫生出版社。免疫教研室胡丽娟immunehulijuancomEmilvonBehring()antibodyInbyvonBehringandKitasatodescribedanactivityinserumoftoxinimmunizedanimalsthatneutralizedtoxinTransferofimmuneserumcouldprotectnaïveanimalsfromdiphtheriaortetanusHistoryAntibodies(Ab)areproductsobtainedbyantigenstimulatingBlymphocytes,thenBcellswillproliferateintoplasmacellstoproducespecificantibodieswhichcanreactspecificallywithcorrespondingantigensImmunoglobulins(Ig)areallthoseglobulinswhichhavethefunctionorstructureofantibodyTwokindsofimmunoglobulins:>secretedimmunoglobulins(sIg):Antibody>membraneimmunoglobulins(mIg):BCRDayRestingBcellAntibodyformingcell(plasmacell)YYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYAntibodyStructureandFunctionStructureofimmunoglobulinsStructureofimmunoglobulinsBasicstructureHeavychainandLightchain(重链和轻链)VariableregionandConstantregion(可变区和恒定区)OtherstructuresHingeregion(铰链)Joiningchain(J链)Secretorycomponent(SC分泌片)Domains(功能区)peptidepeptideepitopebindingofHV(CDR)andepitopeThefunctionofIgThefunctionofIgV区的功能:特异性结合抗原(neutralization中和作用)抗体结合相应抗原分子发挥免疫效应(生理与病理)BCR特异性识别并结合抗原分子介导体液免疫应答。C区的功能激活补体Immunecomplex(IC)激活补体经典途径与细胞表面FcR结合)调理作用(opsonization)IgG或IgM的Fc段与吞噬细胞表面FcR结合促吞噬)抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(Abdependentcellmediatedcytotoxicity,ADCC))介导I型超敏反应IgE的Fc段与肥大细胞表面FcR结合受体桥联细胞活化穿过胎盘和粘膜IgG通过胎盘sIgA穿过粘膜抗原是启动机体免疫系统的先决条件Antigensaresubstancescapableofstimulatingimmunesystem,generatingantibodiesandoreffectorlymphocytesandbindingspecificwiththeantibodyandeffectorlymphocytesinvivoorinvitroImmunologicpropertiesofAgsImmunogenicity免疫原性antigenicityimmunoreactivity抗原性反应原性免疫反应性刺激免疫系统抗原决定基抗原特异性的分子基础抗原决定基抗原特异性的分子基础抗原决定基(antigenicdeterminant)指抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团。是被免疫细胞识别的靶结构也是免疫反应具有特异性的物质基础。也称为表位(epitope)。抗原决定基的位置、数目和空间结构决定抗原特异性。T细胞决定基(T细胞表位):T细胞决定基主要位于抗原分子内部必须由APC将抗原加工处理为小分子多肽并与MHC分子结合然后才能被TCR所识别。B细胞决定基(B细胞表位):BCR能直接识别未经APC加工的天然抗原其识别的B细胞表位主要位于抗原分子的表面与BCR具有易接近性。根据抗原决定基由TCR还是BCR识别分类主要内容主要内容概述多克隆抗体的制备与应用单克隆抗体的制备与应用基因工程抗体的制备与应用概述概述第一代抗体:多克隆抗体(polyclonalantibodyPcAb)第二代抗体:单克隆抗体(monoclonalantibodyMcAb)第三代抗体:基因工程抗体(geneticengineeringantibodyGeAb)第一节多克隆抗体的制备与应用(polyclonalantibodyPcAb)第一节多克隆抗体的制备与应用(polyclonalantibodyPcAb)概念:采用含有多种抗原决定基(B细胞表位)的抗原免疫动物从而刺激多个B细胞克隆产生针对多种抗原表位的不同抗体。因此所获得的免疫血清实际上是含有多种抗体的混合物称为多克隆抗体。制备流程:免疫原(佐剂)免疫动物分离抗血清鉴定保存。传统抗血清(多克隆抗体)抗原(含多种表位)免疫脾脏淋巴結B細胞多克隆抗体的优缺点多克隆抗体的优缺点优点:制备流程简便操作技术要求低制备周期短一个月左右就能获得目的抗体缺点:制备的抗体是针对多种抗原决定基的混合物特异性不高易出现交叉反应抗体来源于动物应用于人体会产生严重的过敏反应。应用:主要用于免疫学检测被动免疫治疗和紧急预防。其缺点限制了其在疾病诊断和治疗中的应用。抗A抗BABCrossreactionSameepitope第二节单克隆抗体的制备与应用(monoclonalantibodyMcAb)第二节单克隆抗体的制备与应用(monoclonalantibodyMcAb)概念:通过小鼠杂交瘤细胞和单克隆抗体技术生产的抗体。这种杂交瘤细胞既具有骨髓细胞能大量无限增殖的特性又具有B细胞合成和分泌抗体的能力。每一个杂交瘤单克隆是用一个B细胞融合而产生的克隆因此由一个识别一种抗原表位的B细胞克隆产生的抗体称为单克隆抗体。制备流程:免疫融合筛选单克隆抗体制备流程杂交瘤技术的原理亲本细胞的选择-小鼠骨髓瘤细胞:不产生Ig的重链和轻链HGPRTTK与提供淋巴细胞的动物品系相同。能永生化。备注:HGPRT:次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶TK:胸腺嘧啶激酶-免疫脾细胞:经抗原免疫的BALBc小鼠的脾脏。不能永生化但能分泌抗体HGPRTTK。细胞融合骨髓瘤细胞PEG杂交瘤细胞脾细胞融合后细胞的类型:未融合的脾细胞杂交瘤细胞未融合的瘤细胞杂交瘤细胞的筛选杂交瘤细胞的筛选采用筛选培养基:HAT培养基H次黄嘌呤、A氨基喋呤、T胸腺嘧啶只有融合成功的细胞(杂交瘤)才能在HAT培养基上长期生长原因在于只有杂交瘤能成功合成DNA。DNA合成途径DNA合成途径内源性途径(主要途径)利用谷氨酰胺(Gln)或单磷酸尿苷酸在二氢叶酸还原酶的催化下合成DNA(氨基喋呤是二氢叶酸还原酶的抑制剂因此能有效阻断DNA的合成)。外源性途径(补救途径)利用次黄嘌呤或胸腺嘧啶在HGPRT(次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶)或TK(胸腺嘧啶激酶)的催化作用下补救合成DNA融合后细胞在HAT培养基中存活情况脾细胞(HGPRT,TK,能生长但不能永生化)骨髓瘤细胞(HGPRT,TK不能生长)杂交瘤细胞(HGPRT,TK能生长且能永生化)、杂交瘤细胞的筛选和克隆化筛选:免疫荧光ELISA等克隆化:有限稀释法单个细胞显微操作法软琼脂培养法配制方案:杂交瘤细胞((~)xml)细胞冻存液(~牛血清~RPMI培养液DMSO)“慢冻”:分步冷冻℃→℃→液氮 “快融”:取出立即浸入℃~℃水浴中使其迅速融化、复苏杂交瘤细胞的冻存与复苏单克隆抗体的生产体内:BALBc小鼠体内诱发含有单抗的腹水体外:无血清培养基悬浮培养等单克隆抗体的纯化硫酸铵沉淀法离子交换层析A蛋白Sepharose亲和层析单克隆抗体(McAb)的优缺点优点:成分、结构均一特异性强。一种McAb分子的所有区域完全相同只针对一种抗原决定基避免了交叉反应。效价高使用一种抗原免疫动物可以获得针对不同抗原决定基的不同特异性的McAb。杂交瘤细胞能在体内外无限繁殖、传代因此产量高可连续生产缺点:制备McAb成本昂贵制备流程长操作烦琐技术要求较高。McAb为鼠源性应用于人体将产生人抗鼠抗体(Humanantimouseantibody,HAMA),治疗中可能引起过敏反应且疗效大大降低。抗体为全Ig相对分子量过大难以穿透实体肿瘤组织达不到有效杀伤浓度。单克隆抗体在医学上的应用单克隆抗体在医学上的应用(一)用作诊断试剂检测淋巴细胞表面分子区分不同分化阶段的淋巴细胞鉴别淋巴细胞。鉴定病原体准确诊断传染病。用于肿瘤的诊断和分型激素类单抗用于测定体内激素含量判断内分泌的功能状态(二)用作研究工具纯化抗原分析和探查抗原结构分析抗原决定基的功能(三)用于疾病的治疗抗细胞表面分子单抗用于移植排斥反应的防治抗细胞因子单抗用于自身免疫性疾病的治疗抗肿瘤单抗用于肿瘤的导向治疗单克隆抗体用于免疫治疗存在的问题单克隆抗体的特异性由于肿瘤特异性抗原较少缺乏对肿瘤有严格特异性的单抗对正常组织有交叉反应异种抗体反应鼠源性单抗用于人体导致超敏反应生产成本高,技术要求高稳定性差难于普及应用第三节基因工程抗体的制备与应用(geneticengineeringantibodyGeAb)第三节基因工程抗体的制备与应用(geneticengineeringantibodyGeAb)概念:利用基因工程及蛋白工程技术对抗体基因进行改造按人们需要重新组装抗体或抗体基因片段并转化适当的受体细胞后表达的规模化抗体。基本原理:利用分子生物学技术分离纯化抗体基因或基因片段在最大限度保留其抗原结合活性降低其异源性的原则指导下按临床或科研需要对抗体基因进行拼接组装在转化适当的受体细胞表达制备具有不同大小和不同功能的抗体。基因工程抗体产生的时代背景、单克隆抗体的毒副作用、人杂交瘤技术未获真正突破:融合率低、建株难、不稳定、产量低、人体不能随意免疫、现代免疫学和分子生物学技术的推动、基因工程抗体的优点基因工程抗体的优点:易于获得稀有抗体人抗鼠抗体反应(Humananti-mouseantibodyreaciton,HAMAR)低小分子抗体:渗透力强、HAMAR低、亲和性高、靶向性高、组织非特结合少等。基因工程抗体的分类、全抗体()嵌和抗体(chimericantibody)()人源化抗体(humanizedantibody)、小分子抗体()Fab()ScFv()单域抗体()分子识别单位、其它抗体、其它抗体多价微型抗体双链抗体(diabody)微型抗体(minibody)三链抗体(triabody)新型抗体分子新效能抗体双特异性抗体(bispecificantibody,BsAb)胞内抗体(intrabody)免疫黏连素(immunoadhesin)催化抗体(catalyticantibody)一、基因工程全抗体一、基因工程全抗体基因工程全抗体研发的演变历程鼠抗体鼠源鼠人崁合抗体(人源)人源化抗体(人源)人源(一)嵌和抗体(chimericantibody)、概念指由两种不同种系来源的基因所编码的抗体。、原理从鼠源的单克隆抗体杂交瘤细胞株分离并鉴定抗体V区基因再通过适当的技术将其连接到人抗体C区基因上构建Vm(mouse)Ch(human)嵌和基因并转入适当的受体细胞表达。嵌合抗体、嵌和抗体的优缺点:优点:特异性强亲和性高具有全抗体的所有功能半衰期长、疗效显著缺点:有-发生HAMA靶向性差(二)人源化抗体(humanizedantibody)、概念指利用基因工程技术在嵌合抗体基础上针对嵌合抗体仍然具有较高的HAMA反应的问题进一步对抗体进行CDR及FR区域置换。通过这种方式获得的抗体人源部分可达又称为CDR移植抗体(CDRgraftingantibody)。、原理首先利用计算机模建技术模拟抗体立体结构。再根据同源性原理从人抗体基因库中筛选人FR序列。通过分子模拟技术鉴别出与抗原结合位点密切相关的鼠单抗FR上氨基酸残基将这些残基与CDR重组并一同移植到人FR上。、方法在抗体可变区具有较高变异的是位于超变区内(互补决定区CDR)少数核心氨基酸它决定了抗体的特异性而可变区中的“框架区(FR)”则决定了可变区的三维空间结构。通过同源蛋白三维结构模建技术预测抗体可变区三维结构后对鼠及人VH、VL表面容易引起较强免疫反应的氨基酸进行比较分析进行人源化分子设计。二、基因工程小分子抗体二、基因工程小分子抗体小分子抗体小分子抗体.Fab抗体片段.单链抗体(singlechainFv,ScFv).单域抗体(singledomainantibody).分子识别单位(molecularrecognizationunit,MRU)(一)Fab抗体由V链的VH、CH及完整的L链构成优点:分子小HAMAR低亲和性高靶向性高于McAb缺点:仍然有一定的HAMAR发生靶向性不如ScFv稳定性差(二)单链抗体(ScFv)概念是指通过特定的方法将抗体分子VH和VL连接在一起构成的只有一条链的抗体。优点:克服了HAMAR的问题分子量小、渗透性高靶向性增加ScFv可保留较高活性在体内半衰期长、稳定性高没有Fc段非特异结合减少在肿瘤导向治疗及成像诊断中有特别的意义类型()二硫键稳定的单链抗体(dsFv)()由连接肽连接的单链抗体(ScFv)、dsFv(二硫键稳定的单链抗体)利用基因突变技术在VH和VL上加入半胱氨酸利用两者形成的二硫键将VH和VL连接在一起。突变部位的确定:由Jung等人在年用分子模建技术确定:VHVL及VHVL。、ScFv(由连接肽连接的单链抗体)Linker的设计原则长度和性质以不干扰VH和VL的折叠和不影响抗原结合部位的功能为标准。过短的接头会影响VH和VL之间的相互作用过长的接头会影响抗体与抗原的结合而且易受酶水解不稳定。接头中尽量不含疏水氨基酸。常采用次重复出现的个甘氨酸和个丝氨酸即(GlySer),的氨基酸接头。(三)单域抗体(三)单域抗体只有一个VH或VL的抗体通常为VH(四)分子识别单位(四)分子识别单位只有一个CDR通常为CDR三、其它基因工程抗体三、其它基因工程抗体多价微型抗体双链抗体(diabody)微型抗体(minibody)三链抗体(triabody)新型抗体分子新效能抗体双特异性抗体(bispecificantibody,BsAb)胞内抗体(intrabody)免疫黏连素(immunoadhesin)催化抗体(catalyticantibody)(一)多价微型抗体(一)多价微型抗体.双链抗体(diabody).微型抗体(minibody).三链抗体(triabody).双链抗体(diabody).双链抗体(diabody)双链抗体是通过化学铰链、黏性蛋白结构域融合法和接头长度控制三种主要手段将两个ScFv通过非共价键结合形成刚性、稳定的二聚体结构。具有两个抗原结合位点分子量约KD。具有穿透力强的优势易于通过血管壁进入实体瘤。与ScFv比较其肾脏的清除速度减慢。具有更大的临床应用价值。.微型抗体(minibody).微型抗体(minibody)采用基因工程的手段使用不同的接头把单链抗体(VLVH)的VH功能区与IgG的CH功能区融合构成VLVHCH的融合蛋白称之为微型抗体(minibody)。该抗体合成后通过CH功能区形成稳定的二聚体发挥其双价抗体的作用。微型抗体的分子量约为KD较双链抗体(约KD)的大降低了体内清除速度增加了滞留时间。此抗体具有(Fab’)的类似性质但没有(Fab’)需对完整抗体进行酶切消化及二次纯化的繁琐过程是一种较为理想的基因工程抗体形式。.三链抗体(triabody).三链抗体(triabody)制备单链抗体时把接头的长度降个或个以下氨基酸残基或者直接把VH功能区的N末端与VL功能区的C末端相连这样可通过非共价键形成三聚体称为三链抗体。VH和VL直接连接构成无连接肽(ScFv)三聚体的亲和力高其与抗原结合比较牢固解离速度慢。(二)新型抗体分子(二)新型抗体分子.新效能抗体.双特异性抗体(bispecificantibody,BsAb).胞内抗体(intrabody).免疫黏连素(immunoadhesin).催化抗体(catalyticantibody).新效能抗体.新效能抗体通过基因拼接、化学交联等多种方法将抗体分子与酶、化学药物、放射性核素、生物毒素、超抗原等相结合。通过抗体发挥导向或载体效应使抗体携带物靶向结合于特异细胞上发挥抗体携带物的效应功能。.双特异性抗体(bispecificantibody,BsAb).双特异性抗体(bispecificantibody,BsAb)又称双功能抗体(bifunctionalantibody,BFA)具有两个能结合不同特异性抗原位点的抗体。具有小分子抗体低副作用又能有效促进细胞或分子聚合介导高效生物学效应在肿瘤、病毒感染治疗中具有较大优势。、胞内抗体(intrabody)、胞内抗体(intrabody)概念:利用基因工程技术在ScFv抗体基因的C端或N段加上先导序列使抗体分子定向分布于非淋巴细胞的细胞核、细胞浆或某些特定的细胞器中表达从而特异性干扰或阻断分布于该部位的生物大分子的加工、分泌或活性引起胞内一系列生物过程改变的抗体。胞内抗体的构建首先获得ScFv基因再通过PCR技术在其N或C端插入胞内定位信号序列。N端定位信号序列可引导抗体进入相关的细胞部位。而C端信号序列可使抗体滞留在该细胞特定部位。常用的胞内定位信号肽:核定位信号肽:PKKKPTV内质网定位信号肽:MWIWRILFVGAATGAAS内质网滞留信号肽:KDEL胞内抗体的作用机制抑制或稳定大分子之间的相互作用改变蛋白所在的区室。通过对配体的修饰使其功能丧失。通过调节酶或阻碍酶活性位点、隐蔽酶底物使酶固定在活化或失活构象。.免疫黏连素(immunoadhesin).免疫黏连素(immunoadhesin)抗体C区和细胞膜表面受体或细胞黏附分子等细胞表面结合位点通过一定的方式连接后在真核细胞表达出的抗体样融合蛋白称为免疫黏连素。其不含抗体Fab段与抗原特异性无关但与表达相应受体或黏附分子的靶细胞结合后可发挥抗体的部分效应功能如ADCC、CDC等功能。.催化抗体(catalyticantibody).催化抗体(catalyticantibody)根据免疫学及有机化学的基本原理利用基因工程技术制备的具有催化活性的抗体不仅能与抗原特异性结合还能促使其发生化学转变。特点:能选择性结合并降解病毒、肿瘤细胞及其它生理靶细胞表面表达的蛋白及碳水化合物。其高效催化活性及位点特异性蛋白降解作用为临床疾病的治疗提供新的途径有可能成为肿瘤导向治疗的新方法。四、基因工程抗体的应用四、基因工程抗体的应用(一)肿瘤(一)肿瘤基因工程抗体由于分子量小渗透能力强容易进入肿瘤组织局部等优点可将细胞毒素、酶、药物或放射性同位素偶连在抗体上通过抗体的导向作用特异性杀伤肿瘤组织或显像。对术后残留灶、术后复发、晚期肿瘤、肿瘤转移灶的诊断治疗具有重要的意义。(二)感染性疾病(二)感染性疾病病毒感染细菌感染(三)器官移植(三)器官移植抗ILR人鼠嵌合抗体已进入预防和治疗移植排斥反应Ⅲ临床实验结果显示:能使肾移植排斥反应的发生率降低。(四)自身免疫性疾病(四)自身免疫性疾病美国已用抗肿瘤坏死因子的嵌合抗体治疗类风湿性关节炎疗效显著。

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