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荧光分光光度法.ppt

荧光分光光度法

非凡阿甘
2011-05-30 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《荧光分光光度法ppt》,可适用于人文社科领域

荧光分光光度法荧光分光光度法简介简介和UV异同点荧光分析法主要应用范围与常用方法优势与UV异同点)构造与UV很相似属于分光光度法,光源单色器等)组件的布置稍有不同荧光采用激发光和发射光成直角的直角光路,)原理也不一样这在后面介绍荧光分析法主要应用范围)生物技术的分析,免疫技术的分析,如DNA、抗体、抗原等)痕量元素的分析如多种无机元素)间接测定众多的有机物包括药物。荧光分析一般分为三种:荧光分析一般分为三种:X射线荧光分析(X射线)原子荧光分析(激光)分子荧光分析(汞弧灯)优势)灵敏度高:比UV高~~个数量级)信息多:激发分光光谱(信息同于UV)、发射光光谱的发光强度、发光寿命、量子效率、荧光偏振等多种信息,定性更好)工作曲线的线性范围宽(定量更准)应用范围也广微量元素的分析、医药、环境,石油工业等能直接或间接分析众多的有机物)专一性强:许多物质的测定采用间接法伯乐公司的LabeledDNA的荧光标记物Labelingkits荧光发光的原理:荧光发光的原理:激发和发射过程激发过程:①基态:能量最低状态S②激发态:电子处于反键轨道上为激发态最有意义的为ππ*和nπ*过程电子激发过程很快S不稳定。发射过程当激发态在返回基态时伴有光子的辐射称为发光过程又称发射过程。荧光和磷光均为此种光致发光过程。(又称冷光)实际从激发态回到基态过程充满竞争。(jablonskii)杰不朗斯基的图解(jablonskii)杰不朗斯基的图解S:基态S*激发态S、基态F:荧光P:磷光S:为单一态的低能级T:三重态ThreeVR:振动驰豫VibratoryRelaxation内转换:InterCrossing系内转换:InterSystemCrossing)单一态激发过程中,当S=时为单一态①S原子光谱谱项符号量子数S的S表示谱项的多重性②自旋量子数ms(电子)可取值只有±(即顺旋或反旋)③自旋的两种状态:当自旋配对时S=不配对则S=)三重态S=则S=A跃迁时通常自旋不变即单一态单一态B激发过程中自旋方向被倒转或改变了则为三重态C三重态的能量比相应的单一态高但能量差要低应该到三重态D单一态向三重态的跃迁属于跃迁禁戒跃迁几率为单重态向单一态的。)振动驰豫VibratoryRelaxation溶质分子向溶剂转移过剩的振动能吸收跃迁所需的时间很短(S)分子具有的几何形状及所处的环境还来不及改变可能发生两种变化①直接从激发回到基态(发射光子)~S②发射辐射前改变振动能级~S溶质分子向溶剂转移过剩的振动能而发生的分子驰豫是相当快的在~S就能无辐射而降落到受激态最低振动能级因为快所以溶液中分子快速振动驰豫后光子发射总是由受激态的最低振动能级发生的。)荧光Fluorescence分子处于受激态的最低振动能级后变化之一发射光子回到基态荧光波长:荧光光谱>吸收光谱量子效率φ:受激单一态的寿命在~若无其他竞争则全部受激分子发射荧光φ=实际有竞争之间)内转换:(IC)InterCrossingA全部激发能转变为热而本身回到基态,即受激单一态与基态间转换为低效率过程B受激单一态间(能量不同的单一态)的内转换则为多得多的几率过程(主要))系内转换(ISC)ISC:单一态与三重态间的转换对三重态布居粒子的高效途径是与回到基态发生争夺。状态的改变是禁戒的但发射光子回到基态需要S,而内交换只需S,比发射光子的时间更短所以系内交换可与荧光发射进行竞争。一般来说系内交换的几率愈大小取决于:最低能量受激单一态与三重态的能量间隔愈小最低能量受激单一态的寿命愈长,(即发射光子愈慢)几率愈大。)磷光phosphorescence受激三重态上的粒子回到单一态基态的形式是被禁戒的但还是可发生的原因:寿命很长(S)及ΔE小总结:原理步①激发λex,②发射λem,发时竞争(jablonskii)杰不朗斯基的图解(jablonskii)杰不朗斯基的图解三量子效率:(在定量计算先讨论Ф)三量子效率:(在定量计算先讨论Ф)影响发生的因素总的是内交换(IC和ISC)。衡量发生的效率如何前已提到以量子效率Ф来判断数值在。其公式为公式Ф=k:为速率常数,竞争由时间的快慢起重要作用,因此以其各影响因素的速率常数体现Ф=Kf:荧光发生过程Kx:系内交联的ISC过程Kc:第一受激单一态的无辐射能量损失过程或讲将其激发能转变为热能过程的IC过程。Kf>>Kc和KxФfKc或Kx>>Kf则Фf无荧光Kf大小影响Фf的大小影响k的因素:)Kf为最低受激单一态与基态之间跃迁几率大小的量度。Δεmax(摩尔吸光系数)当εmax变小时可预期Kf也相应变小ππ*吸收带的εmax大于nπ*,大约大倍∴ππ*的Kf远比后者大)KxISC的几率的大小强烈依赖单一态和三重态之间的能量大小。能量差愈小则ISC几率大Kx变大)Kc受环境因素的影响最为强烈主要影响是T。∴随T变大碰撞变多无辐射去激活的几率增大。Kc增大。大量实验证实:大多数分子随T升高。Фf会变小。四.荧光发光光谱仪的构造:四.荧光发光光谱仪的构造:待测的化学物系盛在玻璃或石英容器中。和UV类似。样品由激光光源发生的紫外或可见光激发。光源通常是高压氙弧灯。或高压汞弧灯。再用单色器选择合适的激发光波长区。荧光的发射是向所有方向的现放在与激发光轴成直角放置的发射光单色器只能收集到所发冷光的一小部分。由发射光单色器选出要进行测量的发光波电区。检测由光电倍增管再将所得信号放大并显示描绘出。五.荧光的定量分析:五.荧光的定量分析:公式:If=ФfIaIa:所吸收的光的强度I:入射光的强度It:透射光的强度UV中T=ItI=εbcIt=I·εbcIa=IIt=I(εbc)若将指数项展开为级数。当吸光物质视为稀溶液即C则可忽略幂次高于的所有项则上式为If=ФfIεbcIf=ФfIεbcIf=ФfIεbc同时在c浓度小时,If~C成线性关系If跟I成正比∴I增大可提高灵敏度。此定量分析除多了个量子效率跟紫外定量一致又对于同一种物质时,在同一条件仪器T溶剂均一致则Фf应一致。.实例:If~C经上公式推算实质和紫外一致。在实际测量中。在找准λem波长带找到λex(max)即可以UV类似方法定量如不同在于弛豫后波长红移药物(西药类)药物(西药类)A采用荧光分光光度法测定奥沙普嗪肠溶胶囊的含量测定波长为Ex=nmEm=nm。BSMZλex=nm,λem=nmC替硝唑λex=nm,λem=nmD氟康矬λex=nm,λem=nm药物(中药)药物(中药)A测定生药厚朴中厚朴酚与和厚朴酚通过选取适当的光谱校正点可扣除厚朴酚与和厚朴酚的光谱干扰和背景干扰,方法用于生药厚朴中厚朴酚与和厚朴酚的测定.B香内酯荧光分光法定量分析其发射光谱λem=(±)nmλex=nm或激发光谱λex:(±)nmλem:nm无机元素无机元素A测定杨梅黄素中痕量锗的新方法。锗与杨梅黄素在磷酸介质中形成配合物此配合物在乙醇溶液中具有较强的荧光强度λEx=nmλEm=nm。B海藻产品中的硒采用荧光分光光度法测定海藻产品中的硒含量。C探讨耐药逆转剂对耐药细胞K/A内游离钙离子(Ca^i)浓度的影响。医学上医学上A探讨谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)模拟物.环糊精(SeCD)对中波紫外线损伤的防护作用。以小鼠成纤维细胞(NIHT)制备紫外线损伤模型采用荧光分光光度法测定DNA裂解率改良硫代巴比妥酸荧光法测定细胞脂质过氧化作用流式细胞术测定HO。B采用最新合成的荧光试剂与大白鼠组织及食物中α-二羧基类化合物生成荧光诱导体然后用以相HPLC-荧光对大白鼠组织及食物中的乙二醛甲基乙二醛二乙酰和23-二酰丙酮4种α-二羧基类化合物同时进行分离定量检出荧光检出波长为λEx=nmλEm=nm药代动力学药代动力学A建立测定大鼠血浆中环丙沙星的RPHPLC荧光检测法和研究其体内的药物动力学。荧光检测λEX=nm,λEM=nm。B测定血液中左氧氟沙星的HPLC荧光检测法和研究其体内的药物动力学。荧光检测λEX=nm,λEM=nm。测血清中心律平含量以往有用HPLC法测,此法,a前处理麻烦b成批测量较好而改用荧光衍生化薄层色谱测时用丹磺酰肼对心律平中的羰基衍生化则可克服以上缺点在后面讲到最新的荧光测定可进行薄层色谱测定六:荧光光度计的发展六:荧光光度计的发展发展:年第一台光电荧光计问世以来经过三阶段:手动式自动扫描微机化随科技发展,激光,微机,电子学等新技术引进,推动了理论上的发展分辨率提高:分辨率提高:①S可测荧光寿命范围μs~ps,分辨率达±ps②SGH型可测荧光寿命范围μs~ps,分辨率达±ps扫描速度加快扫描速度加快日立的F型其中三维荧光测定为固有装置,扫描速度达nmmin∴三维荧光测量只需~min多功能:多功能:PE公司的LSB发光分析仪,可同机进行荧光、磷光和化学发光测量利用光纤传感的平板扫描仪附件还可进行薄层色谱分离斑点的扫描测定采用W的脉冲氙灯同机可测磷光相应的软件能获得三维方式或文件轮廓显示的谱图促使应用技术的扩展促使应用技术的扩展①时间分辨(相分辨)②荧光偏振(荧光免疫)③同步荧光④三维荧光和⑤(美SLM亚明科公司)荧光光纤化学传感器等分析新方法相继出现S级荧光寿命的测定。荧光测量新技术及应用:荧光测量新技术及应用:荧光偏振及各向异性:在偏振光的激发下荧光体所发射的荧光在空间不同取向的强度不同,亦是偏振光荧光偏振值P和各向异性r的公式P=IIIIr=IIII式中I和I分别为检偏器的取向平行或垂直于起偏器取向时所观察到的荧光强度荧光偏振不仅与荧光体分子形状大小,荧光体吸光对偏振激光的取向、光选择性以及许多外界因素都有关用处很大比如环境的粘度等都会影响和改变其偏振度从而在生化领域中获得广泛的应用应用应用①大小:可用于确定生物分子间的缔合反应量(缔合量大,则转速小,偏振度加大)②粘度:膜内微粘度对偏振影响③对蛋白质的衰变和转动速度的研究,在荧光体的偏振度与荧光体的转动速度成反比此用于荧光免疫分析如:当小分子荧光体联接到大分子蛋白质或抗体上以后由于体积变大分子转动速度变慢偏振度增大若样品中存在小分子的抗原,则就有可能抗原把联在抗体大分子上的荧光体夺走结果偏振度又下降从而可用于抗原或抗体的测定时间分辨荧光光谱时间分辨荧光光谱时间分辨荧光光谱技术是基于不同发光体发光衰减速度不同寿命不同在进行这种测量时要求带有时间延迟设备的脉冲光源和带有门控时间电路的检测器件,从而可在固定延迟时间td和门控时间tg,用发射单色器进行扫描可得到时间分辨发射光谱。作用:作用:A可对发射光谱重叠但寿命有差异的组分进行分辨和分别测定B固定发射波长对门控时间进行扫描,从而可得到荧光强度随时间的衰变曲线和给定时间处的荧光发射谱,可用于荧光寿命得测量和relaxafion时间的测量等C时间分辨荧光技术还能利用不同光体形成速率的不同进行选择性测定排干扰。如Th,Zr,Al络和物荧光时间分辨率图时间分辨荧光技术还能利用不同发光体形成速率的不同进行选择性测定钍桑色素ToPoSLS体系,利用时间分辨荧光法消除铝,皓等的干扰,测定水中痕量钍的荧光时间分辨图从图可见,在S内测定荧光信号可消除铝,皓等的影响近年国内药物分析杂志存在以桑色素锗去测其含量如Th,Zr,Al络和物荧光时间分辨率图时间分辨荧光技术还能利用不同发光体形成速率的不同进行选择性测定钍桑色素ToPoSLS体系,利用时间分辨荧光法消除铝,皓等的干扰,测定水中痕量钍的荧光时间分辨图从图可见,在S内测定荧光信号可消除铝,皓等的影响近年国内药物分析杂志存在以桑色素锗去测其含量同步扫描同步扫描根据激发光和发射单色器在扫描过程中彼此间所保持的关系同步扫描技术分类:①固定波长差②固定能量差③可变角三类优点:①使光谱简化②谱带窄化,提高分辨率,③减少光谱重叠④提高选择性,减少散射光的影响等应用应用例如酪安酸和色氨酸的荧光光激发谱很相似,发射光谱又严重重叠,但△λ<nm时的同步光谱只显示酪氨酸的光谱特征,△λnm的同步光谱只呈现色氨酸的光谱特征从而实现分别测定谢谢大家!

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