流式细胞术原理及功能介绍

流式细胞术详解 一. 流式细胞术概述 流式细胞术(Flow Cytometry, FCM)是七十年代发展起来的高科学技术 , 它集计算机技术、激光技术、 流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一体, 同时具有 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 和分选细胞功能。它不仅可测量细胞大小、内部 颗粒的性状,还可检测细胞表面和细胞浆抗原、细胞内 DNA、RNA含量等,可对群体细胞在单细胞水平上进 行分析, 在短时间内检测分析大量细胞,并收集、储存和处理数据,进行多参数定量分析; 能够分类收集(分选) 某一亚群细胞,分选纯度＞95%。在血液学、免疫学、肿瘤学、药物学、分子生物学等学科广泛应用。 国内使用的流式细胞仪主要由美国的两个厂家生产:BECKMAN- COULTER公司和 Becton-Dickinson公司 (简称 B-D公司)。流式细胞仪主要有两型:临床型（又称小型机、台式机）和综合型（又称大型机、分析型）。 BECKMAN-COULTER公司最新产品为EPICS ALTRA和EPICS XL/XL-MCL, B- D 公司最新产品为FACS Vantage和 FACS Calibur。EPICS XL/XL-MCL和 FACS Calibur是临床型;EPICS ALTRA和 FACS Vantage是综合型，除具备检测分析功能外,还具有细胞分选功能 , 多用于科学研究。 二.流式细胞仪主要技术指标 1．流式细胞仪的分析速度： 一般流式细胞仪每秒检测 1000～ 5000个细胞,大型机可达每秒上万个细胞。 2．流式细胞仪的荧光检测灵敏度：一般能测出单个细胞上<600个荧光分子,两个细胞间的荧光差＞5%即 可区分。 3．前向角散射（FSC）光检测灵敏度：前向角散射（FSC）反映被测细胞的大小,一般流式细胞仪能够测 量到 0.2µm～０.5µm。 4．流式细胞仪的分辨率：通常用变异系数 CV值来表示，,一般流式细胞仪能够达到<2.0%,这也是测量标 本前用荧光微球调整仪器时要求必须达到的。 5．流式细胞仪的分选速度：一般流式细胞仪分选速度＞1000个/秒，分选细胞纯度可达 99%以上。 三.流式细胞仪主要构造和工作原理 流动室及液流驱动系统 流式细胞仪主要由以下五部分构成:①流动室及液流驱动系统②激光光源及光束形成系统③光学系统④信 号检测与存储、显示、分析系统⑤细胞分选系统。 流动室（Flow Cell或 Flow Chamber）是流式细胞仪的核心部件，流动室由石英玻璃制成，单细胞悬液在 细胞流动室里被鞘流液包绕通过流动室内的一定孔径的孔,检测区在该孔的中心，细胞在此与激光垂直相 交，在鞘流液约束下细胞成单行排列依次通过激光检测区。流动室里的鞘液流是一种稳定流动，控制鞘液 流的装置是在流体力学理论的指导下由一系列压力系统、压力感受器组成，只要调整好鞘液压力和标本管 压力, 鞘液流包绕样品流并使样品流保持在液流的轴线方向，能够保证每个细胞通过激光照射区的时间相 等，从而使激光激发的荧光信息准确无误。见图 12.1流动室示意图。流动室孔径有 60µm、100µm、150µm 、 250µm等多种，供研究者选择。小型仪器一般固定装置了一定孔径的流动室。 图 12.1流动室示意图(采自 Coulter Training Guide) 四. 流式细胞仪主要构造和工作原理 激光光源及光束形成系统 流式细胞仪可配备一根或多根激光管，常用的激光管是氩离子气体激光管，它的发射光波长 488ηm,此外可 配备氦氖离子气体激光管（波长 633ηm）和/或紫外激光管。 流式细胞仪的主要测定信号荧光是由激发光激发的，荧光信号的强弱与激发光的强度和照射时间相关，激 光是一种相干光源,它能提供单波长、高强度、高稳定性的光照，正是能达到这一要求的理想的激发光光源。 在激光光源和流动室之间有两个圆柱形透镜，将激光光源发出的横截面为圆形的激光光束聚焦成横截面较 小的椭圆形激光光束(22µm×66µm)，在这种椭圆形激光光斑内激光能量成正态分布，使通过激光检测区的 细胞受照强度一致。 五. 流式细胞仪主要构造和工作原理 光学系统 流式细胞仪的光学系统由若干组透镜、小孔、滤光片组成，大致可分为流动室前和流动室后两组。流动室 前的光学系统由透镜和小孔组成，透镜和小孔（一般为 2片透镜、1个小孔）的主要作用是将激光光源发 出的横截面为圆形的激光光束聚焦成横截面较小的椭圆形激光光束，使激光能量成正态分布，使通过激光 检测区的细胞受照强度一致，最大限度的减少杂散光的干扰；流动室后的光学系统主要由多组滤光片组成， 滤光片的主要作用是将不同波长的荧光信号送到不同的光电倍增管。滤光片主要有三类：长通滤片（LP） --只允许特定波长以上的光线通过，短通滤片(SP)-- 只允许特定波长以下的光线通过，带通滤片(BP)-- 只 允许特定波长的光线通过，不同组合的滤片可以将不同波长的荧光信号送到不同的光电倍增管(PMT),如接 收绿色荧光(FITC)的PMT前面配置的滤光片是 LP550和BP525, 接收色橙红色荧光(PE)的PMT前面配置 的滤光片是LP600和BP575, 接收红色荧光(CY5)的PMT前面配置的滤光片是LP650和BP675。见图12.2 光学系统和信号检测系统示意图。 六. 流式细胞仪主要构造和工作原理 信号检测系统 当测定标本在鞘流液约束下细胞成单行排列依次通过激光检测区时产生散射光和荧光信号,散射光分为前 向角散射（Forward Scatter, FS）和侧向角散射或 900散射（Side Scatter, SS）,散射光是细胞的物理参 数与细胞样本的制备（如染色）无关;荧光信号也有两种,一种是细胞自发荧光它一般很微弱,一种是细胞样 本经标有特异荧光素的单克隆抗体染色后经激光激发发出的荧光，它是我们要测定的荧光,荧光信号较强, 这两种荧光信号的同时存在是我们测定时需要设定阴性对照的理由,以便从测出的荧光信号中减去细胞自 发荧光和抗体非特异结合产生的荧光。 前向角散射（FS）反映被测细胞的大小,它由正对着流动室的光电二极管装置接收并转变为电信号；侧向角 散射或 900散射（SS）反映被测细胞的细胞膜、细胞质、核膜的折射率和细胞内颗粒的性状, 它由一个光 电倍增管(PMT) 接收并转变为电信号,这些电信号存储在流式细胞仪的计算机硬盘或软盘内。 流式细胞仪测定常用的荧光染料有多种,他们分子结构不同,激发光谱和发射光谱也各异,选择荧光染料时必 须依据流式细胞仪所配备的激光光源的发射光波长(如氩离子气体激光管,它的发射光波 488ηm,氦氖离子气 体激光管发射光波长 633ηm）。488ηm激光光源常用的荧光染料有 FITC（异硫氰酸荧光素）、PE（藻红 蛋白）、PI（碘化丙啶）、CY5（化青素）、preCP(叶绿素蛋白)、ECD(藻红蛋白-得克萨斯红)等。他们的 激发光和发射光波长分别是： 激发光波长（ηm） 发射光峰值（ηm） FITC 488 525（绿） PE 488 575（橙红） PI 488 630（橙红） ECD 488 610（红） CY5 488 675（深红） PreCP 488 675（深红） 各种荧光信号由各自的光电倍增管(PMT) 接收并转变为电信号后存储在流式细胞仪的计算机硬盘或软盘 内.见图 12.2光学系统和信号检测系统示意图。 七. 流式细胞仪主要构造和工作原理 信号存储、显示、分析系统 (一) 信号存储 存储在流式细胞仪的计算机硬盘或软盘内的数据一般是以 List mode(列表排队)方式存入的,采用 List mode 方式有两大优点:①节约内存和磁盘空间②易于加工处理分析。 （二）信号显示和分析 由于 List mode方式数据缺乏直观性，数据的显示和分析一般采用一维直 方图(图 12.3)、二维点阵图(图 12.4,12.5)、等高线图(图 12.8)和密度图(图 12.7)。 1．单参数数据显示和分析 细胞的每一个单参数测量数据用直方图来显 示，图中横坐标表示散射光或荧光信号相对强度值，其单位是道数，可以是线性的，也可以是对数的；纵 坐标表示细胞数。见图 12.3一维直方图，图中横坐标是 FITC荧光信号相对强度值（对数），纵坐标表示 细胞数;图中已根据阴性对照设定适当的“门”（直线门），仪器的计算机就会给出测定值（包括阳性细胞% 和平均荧光强度）。 2.双参数数据显示和分析 细胞的双参数测量数据和细胞数量的关系用一维直方图、二维点阵图、等高线图和密度图显示和分析。如 图 12.4二维点阵图，是正常人外周血白细胞的前向散射光（FS）和侧向散射光（SS）组成的点阵图，横 坐标和纵坐标均是线性的，图中淋巴细胞、单核细胞、粒细胞很明显地分为 3群，可以很容易地圈“门” （ Bitmap，无定型门），分析各亚群细胞的数据;图 12.6假三维地形图(X轴: SSC ,Y轴:FSC Z轴:细胞数) 更清楚地表明这一点。图 12.5二维点阵图是细胞的两种荧光（FITC和 RD1）双参数数据显示，横坐标和 纵坐标均是对数的，横坐标代表 FITC，纵坐标代表 PE，图中已设定适当的“门”（十字门），十字门的 D1、 D2、D3、D4门分别代表 PE单阳性细胞、PE和 FITC双阳性细胞 、阴性细胞、FITC单阳性细胞。仪器的计算机就会给出两种荧光测定值（包括阴性细胞%、两种荧光各自 的阳性细胞%、两种荧光的双阳性细胞%、各群细胞的平均荧光强度）。 图 12.7和图 12.8分别是测定细胞的两种荧光双参数数据的密度图和等高线图，横坐标和纵坐标分别代表 一种荧光参数，同理只要设定十字门就可得到两种荧光的各种测定值，密度图和等高线图较点阵图更直观。 3．三参数数据显示和分析 细胞的三参数测量数据和细胞数量的关系每两个数据组成一对（三参数测量数据和细胞数量每两个数据可 组成 6对数据）用一维直方图、二维点阵图、等高线图和密度图显示和分析。三个荧光数据关系用分光图 （prism）表示，分光图可直接给出 8个数据（如用 ABC代表 3种荧光，可有 A+B+C+、A+B+C- 、A+B-C-、 A-B+C+、 A-B+C-、 A-B-C+、 A+B-C+ 、A-B-C-）。见图 12.9 prism，图 12.9为人外周血淋巴细胞亚 群测定结果的分光图，图中给出 CD3、CD4、CD8组合的各种结果，如 T辅助细胞（CD3+CD4+CD8-） 为 42.0%,如 T抑制细胞（CD3+CD4+CD8-）为 17.4%。 图 12.5两种荧光的二维点阵图(采自 Coulter Operaters Guide) 图 12.7. 双参数数据的密度图(采自 Coulter Operaters Guide) 图 12.6假三维地形图和二维点阵图(采自 Coulter Operaters Guide) 图 12.8双参数数据的等高线图(采自 Coulter Operaters Guide) 图 12.9 分光图（prism） 八. 流式细胞仪主要构造和工作原理 细胞分选系统 如在细胞流动室上装有超声压电晶体,通电后超声压电晶体发生高频震动，可带动细胞流动室高频震动 , 使 细胞流动室喷咀流出的液流束断成一连串均匀的液滴, 每秒钟形成液滴上万个。每个液滴中包含着一个样 品细胞 , 液滴中的细胞在形成液滴前已被测量,如符合预定要求则可被充电,在通过偏转板的高压静电场时 向左或向右偏转被收集在指定容器中 , 不含细胞液滴或细胞不符合预定要求液滴不被充电亦不发生偏转进 入中间废液收集器中,从而实现了分选。分选的详细原理和操作请有兴趣者参考有关文献。 九. 流式细胞术在血液学中的应用 DNA倍体分析及细胞周期分析 在细胞周期内,DNA含量随细胞内时相发生周期性变化,正常情况下,大多数细胞处于休止期(Go), G1期 细胞虽有 DNA合成，但 DNA含量仍为 2N，为二倍体细胞,;处于活跃的 DNA合成期(S期)的细胞 DNA 含 量为 2N-4N;正经历细胞分裂(G2/M期)的细胞含有最大量的 DNA(4N)。细胞经固定后用 PI(Propidium Iodine 碘化丙啶)等荧光染料染色即可上机测定。但标本需先经 RNA酶处理以排除 RNA 干扰。FCM可在测量大量细胞(数分钟可测定 105个细胞)后给出 DNA分布直方图,见图 12.10.正常人外周 血 DNA示意图，图中第一个峰(G1)是 DNA含量为 2N 的细胞峰 , 第二个峰是 DNA含量为 4N 的细胞峰, 两峰之间是 DNA 含量为 2N-4N的处于活跃的 DNA合成期(S期)的细胞。用厂家提供的Multicycle软件， 计算机可自动计算出 G1%、S+G2M%;如用 DNA/RNA双参数分析 , 可得到 G0:G1%,G0/G1期 DNA指数, 如标本中有凋亡细胞,在 G1峰前会出现一个亚 G1期峰,软件可自动计算出凋亡细胞的%。 图 12.10.正常人外周血 DNA示意图(采自 Coulter Training Guide) DNA倍体分析的临床有价值的指标是 DNA非整倍体和/或超二倍体%和四倍体%增高。这些改变是肿瘤细 胞的特异性改变,和实体瘤相比 , 急性白血病非整倍体发生率较低,约 30～40%。 十. 流式细胞术在血液学中的应用 淋巴细胞亚群测定 淋巴细胞担负着免疫的主要功能。淋巴细胞亚群的测定有助于了解机体免疫状况及一些疾病的监测。临床 经常测定的淋巴细胞亚群包括 T淋巴细胞 (CD3+), T 辅助细胞 (CD3+CD4+), T 抑制细胞(CD3+CD8+), B 淋巴细胞（CD19+或 CD20+），NK 细胞 (CD3-CD56+)等。 常用来测定淋巴细胞亚群的单克隆抗体(Monoclonal Antibody McAb)都是小鼠抗人 Ig,有精制抗体,有直标 荧光抗体,现在一些国外公司有双色和三色McAb出售,如 CD4-FITC/CD8-RD1、 CD3-CY5/CD4-FITC/CD8-PE等 , 此时应根据这些双色或三色McAb的 Ig性质选择相应的阴性对照,如 MsIgG1-RD1/MsIgG2-FITC等。上机测定时应先测定阴性对照管,阴性对照的阳性细胞应＜2.0%。 三色测定可给出更为准确的各亚群的情况:如真正的 T 辅助细胞应是 CD3+CD4+CD8-, 真正的 T 抑制细 胞应是 CD3+CD4-CD8+,单标 CD8+细胞中不仅有 T 抑制细胞,还含有 30%左右的 NK细胞;而 CD3+CD4-CD8-细胞群是 γδT细胞,此类细胞与感染有关, CD3+CD4+CD8-细胞+CD3+CD4-CD8+细胞 +CD3+CD4-CD8-细胞+CD3+CD4+CD8+细胞=CD3+细胞。如单标记 CD56不能准确测定 NK 细胞,NK 细 胞应是 (CD3-CD56+),因为 CD56+细胞中包含着非 HLA束缚细胞毒 T 细胞(CD3+CD56+)。双色组合还能 测定 B 淋巴细胞（CD3-CD19+或 CD20+）、激活的 T 细胞(CD3+CD69+或 CD3+25+)等。 应用适当的双色组合如 CD4与 CD29,CD4与 CD45RA,可以测定 T辅助细胞的的亚群。如 CD4+2H4(CD45RA)+细胞是 Ts的诱导细胞;CD4+4B4(CD29)+细胞 Th的诱导细胞。同理 , 利用 CD8+CD45RA和 CD8+CD29+S6F1可测定 T抑制细胞的亚群。 T辅助细胞还可分成 Th1、Th2两个亚群，同时标记细胞内细胞因子 IFN-γ和 IL-4，可区分 Th1细胞（CD4+/ IFN-γ+）和 Th2细胞（CD4+/ IL-4+）。 利用 CD25、CD69等McAb和其他淋巴细胞标记双色或三色标记还可测定淋巴细胞亚群的功能状态，如 活化 T8、活化 B细胞等。 以下给出常用细胞亚群的正常范围供参考,请注意同一 CD中有多种克隆的McAb, 同一 CD中不同 McA b 所测出的数值不同,每个实验室应测定自己实验室的正常数值。 CD3+ 70.0±12.0% +4B4+ 23.0±7.0% CD3+CD4+CD8- 40.0±9.0% CD4+2H4+ 19.0±6.0% CD3+CD4-CD8+ 30.0±8.0% CD3-CD56+(NK) 12.0±8.0% 十一. 流式细胞术在血液学中的应用 白血病免疫分型原理 白血病免疫学分型是利用单克隆抗体 (McAb) 检测白血病细胞的细胞膜和细胞浆抗原,分析其表现型, 以了解被测白血病细胞所属细胞系列及其分化程度。对白血病细胞抗原的分析研究有助于对白血病分型,为 诊断和治疗提供依据。白血病免疫分型是形态学分型的重要补充和进一步深化，国际MIC分型协作组认为 每一例急性白血病的免疫分型都是必不可少的。白血病免疫分型对鉴别急淋和急非淋有决定作用，对鉴别 急非淋的某些亚型如M7、M3也有决定作用，对于一些用形态学、细胞组织化学不能诊断的急性白血病， 急性未分化白血病，混杂性白血病等有重要意义。自从单克隆抗体问世以来,最成功的应用就是研究造血系 统各类细胞表面抗原与细胞增殖、分化及恶变的关系。研究发现细胞表面抗原有重要功能,一些抗原分子作 为细胞生长因子的受体而影响细胞的增殖分化;一些抗原分子作为细胞间相互识别的物质基础而参与细胞 间相互作用;一些抗原分子则是细胞特异功能的物质基础。 从多能造血干细胞(PHSC)分化成熟为功能细胞过程中, 细胞表面和细胞浆内抗原随着分化成熟过程不断 发生改变, 这些抗原称为造血细胞分化抗原。造血细胞分化抗原是造血细胞分化过程中由细胞核内染色体 上的基因编码的镶嵌蛋白, 其出现、增多、减少或消失与造血细胞分化密切相而表现出与细胞系列及分化 程度相关的特异性。这些抗原可作为鉴别和分类造血细胞的标记。如髓系细胞的MPO、CD33、CD13、 CD14、CD15等抗原 ; 巨核系的 CD41、CD41、CD61抗原; T淋巴细胞的 CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、 CD8等抗原;B淋巴细胞的 CD19、CD20、CD22等抗原。至今尚未发现白血病细胞特异性抗原，而白血病 细胞是造血细胞在某一分化阶段的大量积累,表达与之相应的造血细胞分化抗原，因此可用造血细胞分化抗 原类标记检测白血病细胞; 但白血病细胞毕竟不是正常造血细胞,其抗原表达与正常造血细胞并不完全相 同。常有丢失某一分化发育阶段正常应有的抗原,或表达某一分化发育阶段正常不应有的抗原，或表达其他 系列抗原，部分丧失了系列专一性和分化的严格性。 用 FCM检测白血病免疫分型具有快速、简便、重复性好等优点。由于 FCM可根据 FSCνSSC直方图区分 细胞并可圈定检测细胞范围(Bitmap，无定型门),或用 SSC(线性或对数)和 CD45直方图圈定检测细胞范围 (Bitmap，无定型门)，排除其他细胞干扰，因此较光学显微镜免疫荧光法或免疫组化法结果更准确。 十二. 流式细胞术在血液学中的应用 白血病免疫分型其临床意义 目前公认的系列特异性指标是:T淋巴细胞系--胞浆 CD3（cCD3）,B淋巴细胞系-- cCD22或 cCD79，髓系 ---MPO 或 cCD13,一般可先用他们区分细胞系列后再进一步分析某一系列亚型和分化阶段。 1. ALL的免疫学分型 1986年前分为普通型 ALL（cALL）、未分化细胞 ALL （Null-ALL）、T细胞 ALL（ T-ALL） 、前 B细胞 ALL （PreB-ALL）、B细胞 ALL （B-ALL）五型;1986-1994年分为两大类九型(非 T-ALL六 型,T-ALL三型),九十年代后期有人按临床实用性一般分为 B祖细胞 ALL、前 B细胞 ALL、B细胞 ALL、T 细胞 ALL四型。表 12.1-表 12.4列出 ALL的五型、九型（ B细胞系列六型、T细胞系列三型）、四型分 类法。 B-祖细胞 ALL :B-祖细胞 ALL 占儿童 ALL的 65%-70%,青少年 ALL的 55%-60%,成人 ALL的 50%,儿童 ALL >90%病例 CD10+，而婴儿 CD10+病例<50%。FAB分类为 L1、L2，白血病细胞的 FS和 SS都很低; 一般 TdT、HLA-DR、CD19阳性，大多数病例 CD24、CD34阳性，本型细胞膜免疫球蛋白(Ig)阴性。此 型有 CD10+、CD10-两个亚型，CD10+型预后较 CD10-型好。 前 B 细胞 ALL ：前 B 细胞 ALL在发育阶段上较 B祖细胞 ALL晚，占儿童 ALL的 25%，在成人 ALL占 的比例还不清楚。一般 CD24、HLA-DR、CD19、 CD10、cCD22阳性，CD34阴性,鉴别特点时有胞浆重 链 µ。此型预后较 B祖细胞 ALL差，可能与 t(1;19)有关，t(1;19)占前 B 细胞 ALL的 25%，此型 CD34-， 而 B系列 ALL中 CD34-是独立的预后不良标记。 B细胞 ALL ：B细胞 ALL 占所有 ALL 的 2%-5%；B细胞 ALL更为成熟，白血病细胞的 FS和 SS较 B- 祖细胞 ALL明显增加，在 FSνSS直方图或 SS(线性或对数)νCD45直方图中处于淋巴细胞和单核细胞区 域。典型标记是细胞膜免疫球蛋白（sIg）阳性,表型一般为 CD19、CD20、CD22、CD24阳性,多数病例 CD10+，但 sIg和成熟抗原出现可区别于更早的 B系 ALL。此型 FAB分类一般为 L3,罕见病例有 B细胞 ALL标记而 FAB分类一般为 L1，这些病人多有 t(1;19)和 t(14;18)。 T细胞 ALL ：T细胞 ALL占儿童 ALL的 15%,成人 ALL的 25%。多数表型为胸腺细胞型，最常见的是晚 期胸腺皮质细胞亚型，CD1+、CD2+、CD5+、CD7+,CD4+CD8+，CD3表达较少，TdT常阳性；另一常 见亚型是早期胸腺皮质细胞亚型，CD2+、CD5+、CD7+、TdT+。髓质期亚型较少见，CD2+、CD5+、CD7+， CD3+CD4+或 CD3+CD8+，TdT表达较少。前 T细胞亚型，仅有 CD7和 cCD3而无其他 T系抗原表达， 预后较差。T系肿瘤性疾病多有特异性正常抗原表达的下调或表达该分化阶段正常不应出现的抗原。成人 T 细胞 ALL预后较好，而儿童 T细胞 ALL较儿童 B-祖细胞 ALL和前 B细胞 ALL预后差，虽然各亚类预后 仍不甚明确，但 CD10阴性者预后不良。 ALL 的免疫学分型经过 1986年前分为五型，1986-1994年分为两大类九型,九十年代后期(1997)分为 四型的过程。1986年前的五型，是当时单克隆抗体和检测手段的反映；随着新的单克隆抗体（主要是 T、 B淋巴细胞亚群的McAb）的发现和临床大量病例的检测，不仅弄清了 T、B淋巴细胞的来源、分化发育过 程，而且使免疫分型更加细致，因而出现了 1986-1994年分为两大类九型；但按照细胞的分化发育阶段分 型的两大类九型分型法对临床略显繁琐，指导治疗、判断预后临床实用性也不够强，因此又出现了以上简 单的四型分类法。经过对比不难看出，四型分类法的 B-祖细胞 ALL型实际上包含了两大类九型分类法的非 T-ALL的Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ 3个亚型，而Ⅴ型即是前 B 细胞 ALL型，Ⅵ型是 B 细胞 ALL型；而 T细胞 ALL型 是两大类九型中 T-ALL的三型合并为一型。两大类九型分类法的非 T-ALL的Ⅰ型分类为急性未分化白血病 （见后）。 ALL也可按 DNA含量分类，用流式细胞仪很容易测定 DNA含量，DNA含量分为两个亚类：超二倍体和亚 二倍体，前者预后好，后者预后差。 2.急性髓细胞白血病(AML)攪 目前所有粒、单核系的单克隆抗体基本无分化发育阶段特异性,因此 AML的免疫学分型 FAB-M0、M1、 M2界限不十分明显;但M3多不表达 HLA-DR和 CD34，常表达 CD13、CD33、CD9、CD38；GPA在鉴 别红白血病(M6)时可提供帮助;巨核细胞白血病(M7)则有 CD41、CD42、 CD61 为系列特异标记,为确诊的 重要指标。由于白血病的异质性,同一 FAB分类的白血病抗原表达并不完全相同。AML的免疫表型见表 12.5。 M0：M0白血病细胞的 FS和 SS都很低，在 SSνCD45直方图中处于原始淋巴细胞区域。M0的白血病细 胞至少表达一个髓系特异性标记如MPO、CD13、CD116，MPO较 CD13、CD116更敏感；一般淋巴系 标记是阴性的，但可能表达 CD7或 CD4；一般 CD34、HLA-DR阳性。有研究显示 AML复合表达 CD7 和 CD34预后不良。 M1：M1的白血病细胞抗原表达类似于M0并与M0不好区分，M1一般表达 CD13，CD33和 HLA-DR， CD34表达较 M0少，部分可能表达 CD15，较少病人可能表达 CD4。 M2：M2与M1的主要区别是分化成熟增加，原始细胞减少；CD34表达较M1少，CD15表达较M1增加， 大部分病例 HLA-DR阳性，CD13表达强于 CD33；部分M2表达 CD19和 CD56伴有 t(8;21)，罕见的伴 有 t(8;21)的M2不表达 CD13，CD33和 CD14但MPO阳性。 M3：M3白血病细胞由于它的高颗粒性而 SS增大；M3的白血病细胞一般表达 CD13，CD33，部分病人 可能表达 CD2，但 HLA-DR阴性，CD34一般为阴性，复发病人阳性；部分病人可能表达 CD56，表达 CD56 者应作基因检查(APL/RARα)以排外髓/NK细胞急性白血病(详见后)。 M4、M5：M4、M5的免疫表型相似，重要表型特点是表达 CD13、CD33、CD14、CD15和 HLA-DR，部 分病人表达 CD4、CD7,部分病人可能表达 CD56，表达 CD2多为M4E0，常伴有 16号染色体异常，预后 好。 M6：M6较少见，一般表达 HLA-DR、CD34、CD13、CD33，GPA对确定红系有用。 M7：M7占成人 ANLL的 1%、儿童的 4%。成人M7多见于二次性白血病,即 CML.BC或MDS-RAEB或 MF白血病变。而儿童M7多为原发。 M7 免疫学表型一般 为:CD41+,CD42+,CD61+,CD33+/-,CD13+/-,CD34+,DR+/-,CD10-。特异性标记 CD41、CD42、CD61阳 性可确诊M7，但要注意排外血小板粘附于细胞上的假阳性结果。 3．急性未分化白血病 用流式细胞仪分析仅有大约 1%的急性白血病不能分类，典型急性未分化白血病仅有 HLA-DR和 CD34表 达而无系列特异性抗原表达。 4．杂合型白血病 真正的双系列表型白血病是伴有 t(9;22)或有 11q23 MLL（myeloid/lymphoid or mixed lineage leukemia髓 /淋系或混合性白血病）基因重排的病人，以往报道的许多杂合型白血病多是由于方法学问题不能排除非白 血病细胞的干扰，或将非特异弱表达当作特异表达，如前所述白血病细胞毕竟不是正常造血细胞,其抗原表 达与正常造血细胞并不完全相同，部分丧失了系列专一性和分化的严格性，因此不要轻易定型杂合型白血 病，国际上杂合型白血病尚无统一诊断标准。 5．慢性粒细胞白血病急性变(CML BC) 慢性粒细胞白血病(慢粒 CML)是一种多能造血干细胞疾病,其转归 多为急性变。慢粒急变(CML BC)涉及所有造血细胞系列,往往不易从形态学上确定急变类型, 50%-60%为 AML变,30%左右为 ALL变。AML变可表达 AML的所有表型，大多数 ALL变为 B细胞来源,其中 cALL 及前 B-ALL多见,罕见 T-ALL变。 6．B 淋巴系细胞增殖性疾病 B 淋巴系细胞增殖性疾病的免疫学分型见表 12.6。采自 C.D Jennings and K A.Foon略加改变. MCL: mantle cell 淋巴瘤; FCCL:Follicular center cell lymphoma---泸泡中心细胞淋巴 瘤; MZL: Marginal zone lymphoma—边缘区淋巴瘤; SLL:small cell lymphocyte lymphoma--小细胞淋巴细 胞淋巴瘤 B 淋巴系细胞增殖性疾病中包括 B慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)、B幼淋细胞白血病（B-PLL）、毛细 胞白血病（HCL）和多发性骨髓瘤（MM）/浆细胞白血病和部分淋巴瘤，淋巴瘤免疫分型将在不同章节中 描述。 B-CLL：B-CLL的白血病细胞一般表达 CD19、CD20、CD43和 CD79a，CD5与以上抗原复合表达，sIgM、 sIgD、CD11c和 CD25也常表达但表达较弱，CD10、CD22阴性。伴染色体异常者预后较差。 B-PLL ：流式细胞仪在区分 B-PLL和 B-CLL中十分有用, B-PLL通常 sIg表达强, CD5阴性而 CD22阳性, 困难的是原发 B-PLL和由 B-CLL转化为 B-PLL的区分, 由 B-CLL转化来的 B-PLL CD5阳性而CD22表达 弱,类似于 B-CLL。 HCL：HCL 一般表达成熟 B细胞标记:CD20、CD22、CD19、CD79、sIg，CD11c、CD22高表达，CD25 中等度以上表达，一般 CD21-，典型病例 CD5-、CD10-、CD23-，但有少数病例可阳性。CD103是 HCL 最可信的标记，可用来与其它 B细胞白血病鉴别。 浆细胞瘤：由于大多数多发性骨髓瘤病人骨髓标本中含骨髓瘤细胞少及瘤细胞丧失了大多数 B细胞系特异 性标记，用流式细胞仪分析多发性骨髓瘤（MM）/浆细胞白血病较为困难，典型的浆细胞 CD38强表达而 CD45弱表达。一般浆细胞 sIg弱表达,cIg阳性。 7．T淋巴系细胞增殖性疾病 T淋巴系细胞增殖性疾病的免疫学分型见表 12.7。 T淋巴系细胞增殖性疾病中包括 T幼淋细胞白血病（T -PLL）、NK细胞白血病（T-LGL、NK-LGL）和成 人 T淋巴细胞白血病（ATL）、T慢性淋巴细胞白血病(T-CLL)。 T-PLL ：T-PLL的白血病细胞一般表达 CD2、CD3、CD5和 CD7，大多数病人 CD4+ CD8-,但偶有 CD4+ CD8+,单独表达 CD8者少见, 本病常伴有 14q11和 14q32改变, 有 CD4+ CD8-表型者预后较好,本病较 B-PLL恶性度高。 NK 细胞白血病 ：NK系列白血病最早描述的是大颗粒淋巴细胞白血病（LGL）, LGL有两种类型：T-LGL和 NK-LGL，T-LGL 表达 CD3、CD8、CD2、CD16、CD11b、CD57、而 CD56、CD5、CD7、CD4和 CD25多阴性，有 TCR 基因重排。NK-LGL表达 CD2、CD16和 CD56，而 CD3、CD4多阴性，CD8、和 CD57弱表达或阴性， 无 TCRα-β基因重排。最近 NK系列白血病又有新的亚型发现，如急性前髓系/NK 细胞白血病、急性髓系 /NK 细胞白血病、原始 NK 细胞白血病、NK样 T细胞白血病。急性前髓系/NK 细胞白血病是一种最近认 识的不同类型的白血病, 其特点是有明显髓外涉及,不成熟的原始淋巴细胞样形态,伴MPO--、CD7+、 CD33+/CD13+、sCD3-、cCD3-、CD56+,预后不良。急性髓系/NK 细胞白血病，形态学和免疫表型类似 于M3,但无 RARα基因重排，一般 HLA-DR-、CD33+、CD13+、CD56+，多见于老年病人，对维甲酸无 反应。原始 NK 细胞白血病，无髓系和淋巴系抗原，CD56+、cCD3+/-、CD2+/-、CD4+/-、CD7+/-，少数 有 TCRβ基因重排，而无 TCRγ-δ基因重排。NK细胞系列白血病的新亚型是近 10年才较多注意到的白血 病,其临床特点,免疫表型,染色体及基因改变需进一步积累病例研究才能彻底明了。大约 10%-20%左右的急 性白血病表达 CD56，除了原始 NK 细胞白血病、NK样 T细胞白血病、急性髓系/NK 细胞白血病、急性 前髓系/NK 细胞白血病外，大部分表达 CD56的急性白血病是 FAB分类的M2、M3、M4、M5型，这类 病人究竟是急性髓系/NK 细胞白血病还是急性髓系细胞白血病伴 NK抗原表达有待进一步研究，鉴于急性 白血病部分丧失了系列专一性和分化的严格性，可能称为急性髓系细胞白血病伴 NK细胞抗原表达较为合 适。 成人 T淋巴细胞白血病(ATL)：大多数 ATL细胞表达激活 T细胞表型：CD3、CD4、CD5、CD25、HLA-DR、 TCR，一般 CD7-和 CD8-,常有粘附分子 L-选择素的异常表达； 伴有 p53异常者预后不良。 T-CLL：T-CLL少于 CLL总数的 1%，细胞形态学类似与一般 CLL，但临床发展较快，但多数病人表达 CD2、 CD3、CD5、CD7、CD4、少数病人表达 CD8。 十三.流式细胞术在血液学中的应用 淋巴瘤免疫分型 目前淋巴瘤的分类方法已从 LSG的形态学分类逐渐转变为 REAL分类法, REAL分类法是以肿瘤发生源为 基础的分类方法,在原来的形态学基础上加上免疫学分型后再加以分类,这种分类方法不仅能够推断肿瘤的 发生源,对治疗也有指导意义。因此淋巴瘤的免疫分型越来越重要。如同白血病免疫分型一样，淋巴瘤的免 疫分型也是利用单克隆抗体检测淋巴瘤细胞的细胞膜和细胞浆抗原,分析其表现型,以了解被测淋巴瘤细胞 所属细胞系列及其分化程度。流式细胞仪能对多数的淋巴瘤细胞的细胞膜和细胞浆抗原迅速客观地做出检 测，在淋巴瘤的免疫分型中起着不可替代的作用。 临床淋巴瘤的免疫分型的检测标本一般是淋巴结、脾脏、胸水、腹水等。在临床淋巴瘤的免疫分型工作中 常可遇到以下四种情况：①B细胞系淋巴瘤②T/NK细胞系淋巴瘤③淋巴细胞系以外的造血细胞肿瘤④造血 细胞以外的肿瘤。 REAL分类淋巴瘤的免疫表型见表 12.8。*：弱表达或阴性。 BLBL :前 B原始淋巴细胞淋巴瘤/白血病; BSLL: B-小淋巴细胞淋巴瘤; LPL:淋巴浆细胞样淋巴瘤; MCL: 斗 篷细胞淋巴瘤; FCL:滤泡中心淋巴瘤; MZL: 边缘带 B细胞淋巴瘤; SMZL :脾MZL ;HCL:毛细胞白血病; PC: 浆细胞瘤;DLBL: B-弥漫性大细胞淋巴瘤; BL: Burkitts淋巴瘤; HBLB:高度 B细胞淋巴瘤, Burkitts样; TLB L: 前 T原始淋巴细胞淋巴瘤/白血病; TPLL: T幼淋细胞白血病; LGLT:大颗粒淋巴细胞白血病, T细胞型; LGLNK: 大颗粒淋巴细胞白血病, NK细胞型; MF:覃样真菌病; PTL:外周 T细胞淋巴瘤,非特异;AILD:血管免 疫 T细胞淋巴瘤;ACL:血管中心性淋巴瘤; ITCL:肠 T细胞淋巴瘤; ATL:成人 T细胞淋巴瘤/白血病; LCL:大 细胞淋巴瘤; LCLH: 大细胞淋巴瘤,何杰金氏样; 1． B细胞系淋巴瘤 大多数情况下, B细胞系淋巴瘤 CD19、CD20阳性，分化早期 CD20阴性，CD10、CD34阳性；分化晚期 CD5、CD23阳性，成熟为浆细胞后以上标记均阴性。利用单克隆抗体 κ、λ（正常时 κ：λ=2：1）可检测 免疫球蛋白轻链的偏移，推断是否克隆性增殖免疫球蛋白。表 12.6. 列出了外周 B 淋巴系淋巴瘤的 4种类 型的免疫分型。 SLL(small cell lymphocyte lymphoma)--小细胞淋巴细胞淋巴瘤: 小细胞淋巴细胞淋巴瘤细胞一般表达 CD19、CD20、CD43和 CD79，CD5与以上抗原复合表达，sIgM、sIgD、CD11c和 CD25也常表达但表 达较弱，CD10、CD22阴性。伴染色体异常者预后较差。 MCL（mantle cell lymphoma）--斗篷细胞淋巴瘤：MCL包括以前分类为中等淋巴细胞淋巴瘤（ILL）、中 度分化淋巴细胞淋巴瘤(IDL)、中心细胞淋巴瘤和套区细胞淋巴瘤（MZL）,占淋巴瘤的 2%-8%，λ型较 κ 型常见， sIgM中度表达,IgD弱或阴性，表达 CD19、CD20、CD22、CD43，但多数病例 CD5阳性 CD23 阴性，CD10一般阴性，CD5阳性 CD23阴性和 Ig类型可帮助鉴别MCL和 FCL。 FCL（Follicular center cell lymphoma）---泸泡中心细胞淋巴瘤：FCL占淋巴瘤的 45%，表达 CD19、CD20、 CD22， sIg强表达,但多数病例 CD10和 CD23阳性，典型 FCCL CD5、CD43和 CD11c阴性。CD10阳 性、CD11c阴性和 sIg强表达利于与MZL鉴别。 MZL（Marginal zone lymphoma）--边缘带淋巴瘤和相关 B 细胞淋巴瘤：典型免疫表型: CD19、CD20、 CD22、HLA-DR阳性，sIg中度表达，CD5、CD10、CD23、CD25阴性，CD21、CD24多数情况下阴性， 多数表达 CD11c。CD5、CD10、CD23、CD25阴性，CD21、CD24多数情况下阴性，利于与 CLL/SLL、 FCCL、MZL鉴别。 2． T/NK细胞系淋巴瘤 早期 T细胞一般 CD2、CD5、CD7、cCD3阳性。T/NK细胞系淋巴瘤的详细分类及表型参见表 12.8。细 胞膜 CD3阳性可确认为外周 T细胞肿瘤, 外周 T细胞肿瘤的特征是 CD3与 CD4或 CD8复合表达，并常 有克隆性 T细胞受体，或 α-β型或 γ-δ型； MF（mycosis fungoides）--蕈样真菌病和 sezary综合症:占皮肤淋巴瘤的绝大多数，CD4阳性，同时表达 CD2、CD3、CD5，有时 CD7阴性，CD8阳性病例极少见但已有报道，有无 TCRβ基因重排对鉴别淋巴 瘤和炎性反应有帮助。 LCL（large cell lymphoma）--大细胞淋巴瘤: 大细胞淋巴瘤（LCL）占成人淋巴瘤的 40%，儿童的 1/3， 成人 80%是 B细胞型的，儿童 B细胞型和 T细胞型各占一半。 3． 淋巴细胞系以外的造血细胞肿瘤 急性髓系细胞白血病（特别是M4、M5）淋巴结转移时有发生，如 T、B淋巴细胞标记低表达应怀疑并按 白血病免疫分型处理。 4． 造血细胞以外的肿瘤 检测淋巴结、胸腹水标本时如遇 CD45阴性情况应考虑非造血系统肿瘤淋巴结、胸膜、腹膜转移。 十四. 流式细胞术在血液学中的应用 红细胞疾病诊断 （一）网织红细胞测定 计数外周血中网织红细胞数量 , 对于评价骨髓红系造血及网织红细胞从骨髓到外周血的转送速率有重要意 义。有核红细胞在成熟过程中,脱去细胞核后仍有少量 RNA残留在细胞浆内,再经过约一天时间残留 RNA 完全消失,成为成熟红细胞。这种细胞浆内有残留 RNA的红细胞称作网织红细胞。正常情况下有一定量的 网织红细胞出现在外周血中,正常值为 1.0～1.5%,上限 3.0%,但当红细胞数异常时会出现错误结果。因此用 网织红细胞绝对值表示,正常值 5～15×1010/L。由于常规方法测定须先在体外经活体染色(最常用亚甲兰), 然后在显微镜下计数,计数细胞数有限。用流式细胞仪测定网织红细胞具有以下优点:①可避免由于细胞核的 碎片或铁幼粒细胞的颗粒的存在而出现假性网织红细胞升高②可避免人为误差③因为可在短时间内测量上 万个细胞,结果较常规方法准确、可靠 , ④同时可给出网织红细胞年龄结构。 流式细胞仪测定网织红细胞方法简单 , 只须将红细胞洗净后用荧光染料染色后即可上机检测。常用的荧光 染料有焦宁Y(Pyronin Y) 丫啶橙 (Acridine OrangeAO) 碘化丙啶(崐Propidium Iodine PI) 花青( Cyanine dye)等。 （二）PNH诊断 阵发性睡眠性血红蛋白尿症（PNH）因血细胞膜上锚固蛋白-糖磷酸肌醇（GPI）减少或缺乏而导致与 GPI 有关的补体激活抑制因子如 CD55、CD59减少或缺乏，因而红细胞对补体异常敏感发生溶血。流式细胞仪 检查 CD55、CD59十分敏感，正常人 CD55、CD59双阳性细胞>95%，PNH病人 CD55、CD59明显减 少，这种减少不仅表现在红细胞上，粒细胞、淋巴细胞也有减少。已发现 CD55c可能对 GPI减少或缺乏 较 CD59更敏感。 十五. 流式细胞术在血液学中应用 血小板功能分析和血小板病诊断 （一） 血小板功能分析 血小板膜上有丰富的糖蛋白受体，是血小板发挥其功能的物质基础，静止期和活化期血小板的膜糖蛋白受 体的种类、含量、结构和功能显著不同，用不同的抗血小板单克隆抗体可测定和分析血小板功能状态。血 小板质膜糖蛋白单克隆抗体 CD41(GPIIb/IIIa)、CD61(GPIIb/IIIa)、CD42b (GPIb)、CD41b (GPIIb)、血小 板颗粒膜糖蛋白 CD62p、CD63的测定可供分析血小板功能状态，如 CD62p、CD63正常血小板不表达， 当血小板活化时表达明显增加，可用来测定活化血小板。 （二）血小板病诊断攪 1．血小板相关抗体测定 血小板相关抗体可因不同机制产生。抗血小板自身抗体(包括原发性、药物诱导产生、合并其它自身免疫性 疾病如系统性红斑狼疮)能引起严重的血小板减少。大多数原发性(免疫性)血小板减少性紫癜病人血小板上 和/或血清中有抗自身血小板的血小板相关抗体 PAIgG、PAIgA、PAIgM。血小板相关抗体的抗原仍不十分 清楚,可能有多种,如 GPⅠb、GPⅡb 、GPⅢa、Pa、或HLA抗原。抗血小板自身抗体也可能发生于多 次输血后或怀孕期间 , 这些自身抗体多为针对HLA-Ⅰ类抗原决定簇的抗体,一般是 IgG,它们可迅速破坏和 清除随机供血者的血小板。因此能迅速测定这些抗体存在与否的方法是必需的。许多不同的利用放免、荧 光、酶、SPA等的测定血小板抗体的方法已建立,但这些方法都很复杂、费时;同时给出的结果只能以一定 量的血小板(105)中有多少抗血小板抗体来表示。近年来发展起来的用 FCM测定血小板抗体的方法具有快 速、简便的优点,同时可测定血小板上和血清中的抗体;测定中 FCM 分析每一个血小板表面有无抗体,能给 出血小板群体中有多少血小板表面有抗体(以%表示 ); 同时能给出血小板相关抗体量与血小板数的直方图 , 使我们了解血小板相关抗体在血小板群体中的分布情况。 FCM测定血小板抗体原理:分别用标有荧光的抗人 IgG、IgA、IgM或用抗血小板 GPⅠb、Ⅱb、Ⅱb/Ⅲa的 抗体与分离洗净的病人的血小板和在病人血清中孵育过的正常 O 型血小板作用后用FCM测定,前者测定的 是病人血小板上的抗体后者测定的是病人血清中的抗体。 2．血小板无力症 血小板无力症时血小板膜 GPIIb/IIIa明显减少，用血小板质膜糖蛋白单克隆抗体 CD41、CD61和流式细胞 仪测定不仅可测出 GPIIb/IIIa减少，CD42a、CD42b基本正常或偏高，还可测出 GPIIb/IIIa减少程度，分 类血小板无力症。 3.巨大血小板综合征（BSS）:血小板巨大, CD42a减少，CD42b减少，CD61 增加。 十六. 流式细胞术在血液学中的应用微小残留白血病检测 微小残留白血病(Minimal Residual Leukemia MRL)是指白血病经治疗后获得完全缓解(Complete Remisson CR) 后体内残留少量白血病细胞的状态。微小残留白血病与明显白血病(Overt leukemia)无明确 界限 , 仅是白血病细胞负荷数量不同,一般成人明显白血病时白血病细胞可达 1012,经治疗获 CR后 ≤ 1010, 因此 MRL状态白血病细胞数可能是 100-10攪。MRL是白血病复发的根源,因此检测MRL有十分 重要的意义: ①指导临床治疗②预测白血病复发③评价自体骨髓移植的净化效果。应用 FCM 检测 MRL的 优点在于可在短时间内分析大量标本,具有快速的特点。 由于白血病细胞缺乏特异性标记,FCM检测MRL的效果尚不理想,敏感性尚不够高，一般仅有 1/103-104。 目前主要有两类检测方法: ①用FCM分析 CR期骨髓细胞核酸量或染色体,可用于部分 AL病人MRL分析, 但敏感性仅 1-5%。②免疫表型分析,由于尚无白血病特异的标记,只能通过与正常细胞比较某些抗原量的差 别及分布部位的不同作为检测依据;如利用 TdT和 CD10双标记检测MRL,但敏感性亦不高,约 0.1-1%。 假阴性结果可能由于: ①标本中的白血病细胞＜10-4攪或＜10-5;②所取标本不能代表全身骨髓情况; ③病 人白血病细胞表型转换。 十七. 流式细胞术在血液学中的应用白细胞吞噬功能测定 粒、单核-巨噬细胞是机体免疫反应和免疫调节细胞中的重要成员。它们不仅具有吞噬功能,吞噬外来的微生 物、肿瘤细胞等,同时又分泌多种生物因子参于免疫反应,此外单核-巨噬细胞对抗原物质的摄取、修饰、递 呈等作用,是淋巴细胞的免疫功能必不可少的。因此检测白细胞吞噬功能对了解机体免疫状况有重要意义。 以下简要介绍 FCM 测定白细胞吞噬功能的概况。 应用光学显微镜、荧光显微镜测定白细胞吞噬功能时须分离粒、单核细胞, 并尽可能地保持细胞活性。用 FCM检测时不须分离细胞,应用全血即可, 因此可在自然状态下测定,结果准确可靠。 目标粒子一般以酵母、细菌等能激发自然吞噬作用或予先以抗体调理化的人造粒子为好;并标以荧光,常用者 为 FITC(异硫氰酸荧光素)或 RA(罗达明). 以肝素或拘橼酸抗凝取外周血(避免用 EDTA),200µl全血与目标粒子 200µl(目标粒子浓度 4×107/ml)置 37°C温育,温育结束后立即置冰水中, 以同样标本不在 37°C 温育而置于冰水中者作为对照。目标粒子不同 温育时间不一,FITC标记的金黄色葡萄球菌 25 分钟,FITC标记的粒子 15分钟即可达到吞噬饱和;此外,粒 子与白细胞的比例也很重要,一般为 10:1。温育结束后以溶血剂溶去红细胞即可上机检测。 应用 FCM全血法测定白细胞吞噬功能,对白细胞的丢失、损伤最小 ; 此外用本法可测定血清中的调理素 (Opsonine)水平及血清中有无吞噬作用抑制因子。如果用 FITC标记的单克隆抗体 CD13、CD