山东省牛_猝死病_病原学研究

第24卷 　第3期 　　　 　　　　　　中 　国 　预 　防 　兽 　医 　学 　报 　　　　　　　　Vol. 24 , 　No. 3 2 0 0 2 年 5 月 　　　　　　　Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine 　 　　　　　　 May 　2002 山东省牛“猝死病”病原学研究 朱瑞良 ,牛钟相 ,刘思当 ,姜世金 ,崔言顺 ,林 　海 (山东农业大学 动物科技学院 ,山东 泰安 271018) 摘要 : 采用流行病学调查、毒物检测及微生物学检验等方法 ,对山东省牛“猝死病”发病原因进行了系统研究。结果证明 , 本病是由凝结芽孢杆菌和克雷伯氏杆菌肺炎亚种协同感染所致 ,并通过研制成的二联灭活菌苗 ,有效地控制了牛“猝死病”的 发生。 关键词 : 牛 ; 　猝死病 ; 　凝结芽孢杆菌 ; 　克雷伯氏杆菌肺炎亚种 ; 　病原 中图分类号 : S858. 2 ; 　　　　　　　　文献标识码 : A 　　　　　　　文章编号 : 1008-0589 (2002) 03-0209-04 Aetiology of Sudden Death of Cattle in Shandong Province ZHU Rui-liang ,NIU Zhong-xiang ,LIU Si- dang ,J IANG Shi-jin ,CUI Yan- shun ,LIN Hai (Animal Technique College ,Shandong Agricultural University ,Taitan 271018 ,China) Abstract : By using epidemiological investigation ,inspection of poisons and microbiological examination ,the aetiology of“sudden death” of cattle was studied. The results showed that the disease was caused by mixed infection of B acillus coagulans and Klebsiella penumoniae. The disease was controlled by combined inactivated vaccine based on the two bacteria. Key words : Cattle ; 　Sudden death ; 　Bacillus coagulans ; 　 Klebsiella pneumoniae ; 　Pathogen 　　家畜“猝死病”是近年来在我国新发生的一种病 因不明的疾病 ,山东省自 1992 年冬季开始发生 ,并 迅速蔓延至全省 ,据统计全省有 13 个地市 60 多个 县(市、区) 发生该病 ,牛、羊、猪及马属动物都有发 生 ,其中牛死亡 10 余万头。本病多呈急性发作 , 92 %的病畜从出现症状到死亡仅有几分钟或几个小 时 ,往往来不及救治 ,损失惨重。“猝死病”的病因各 地报道有所差异 ,为了探明该病在山东省的发生原 因及控制 措施 《全国民用建筑工程设计技术措施》规划•建筑•景观全国民用建筑工程设计技术措施》规划•建筑•景观软件质量保证措施下载工地伤害及预防措施下载关于贯彻落实的具体措施 ,进行了系统研究。 1 　 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 和方法 111 　培养基 　营养琼脂培养基、鲜血琼脂培养基、 厌氧肉肝汤培养基、生化试验用培养基等 ,均按参考 文献[1 ,2 ]制备。 112 　化学药品 　蔗糖、氯仿等 ,购自上海化学试剂 商店。 　基金项目 :“九·五”国家重点科技攻关 计划 项目进度计划表范例计划下载计划下载计划下载课程教学计划下载 资助项目 (编号 96-003-03-04) 　作者简介 :朱瑞良 (1963 - ) ,男 ,山东省单县人 ,山东农业 大学动物科技学院教授、博士 ,主要从事兽医分 子生物学研究. 　收稿日期 :2001 - 06 - 06 113 　农药标样 　氟乙酰胺、六六六、DDT等 ,由本校 内科教研室提供。 114 　流行病学调查及病理学观察 　对发病严重的 菏泽、济宁、德州、枣庄、莱芜等地市的牛“猝死病”进 行了系统的流行病学调查 ,死牛剖检和病理组织学 观察。 115 　病料采集 　将先后收集到的 42 头“猝死病”牛 采取肝、脾、肾、肺、脑、心、淋巴结、胃肠内容物等病 料。 116 　毒物的检验 　采用奈氏试剂反应及气相色谱 等检测方法 ,对病料进行氟乙酰胺、六六六、DDT 药 物检测。 117 　病毒的检验 　将肝、脾、脑等病料按 1∶5 加灭 菌生理盐水研磨后 5000r/ min 离心 15 分钟取上清 液 ,一部分加双抗后接种 9 日龄鸡胚尿囊腔 (0. 1ml/ 胚)和牛肾原代细胞 ,观察病变并收获培养物 ;另一 部分用氯仿提取 ,然后加蔗糖作梯密度离心 ,取梯密 度离心带及鸡胚尿囊液和细胞培养液用电镜观察有 无病毒 ,鸡胚尿囊液用常用动物红细胞再做血凝试 验 ,观察血凝性。 118 　细菌学检验 　将病料分别划线接种于营养琼 脂平板、鲜血琼脂平板和厌氧肉肝汤培养基 ,平板培 养基分别用需氧和厌氧方法培养。对分离出的细菌 分别进行革兰氏染色及瑞氏染色等 ,观察其形态及 染色特性。再对分离纯化的细菌分别作生化试验、 动物试验和血清学检验。 119 　保护试验 　将分离到的 2 种病原菌培养后灭 活 ,加油佐剂做成二联油乳剂灭活苗 (另文报道) ,免 疫注射小鼠 10 只 (0. 3ml/ 只) 和家兔 6 只 (1ml/ 只) , 一个月后攻毒 ,检查保护率。另在疫区免疫接种健 康牛 1485 头 ,每头肌注所研制的疫苗 5ml ,观察保护 率。 2 　结 　果 211 　流行病学调查 　本病自 1992 年冬首先在菏泽 地区开始发生 ,后蔓延至全省 13 个地市 60 多个县 (市、区) ,死亡牛 121820 头。本病以冬末、春初发生 较严重 ,天气转暖病也逐渐减少。本病不形成烈性 传染 ,多为散发。同一舍内有的牛发病死亡 ,有的牛 健康存活。病牛 92 %呈现急性发病死亡。病牛死前 不安、呼吸急促、体温不高。从出现症状到倒地死亡 仅几分钟或几个小时。少数病牛病程稍缓 , 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 现神 经症状、哞叫、继而精神沉郁 ,痉挛而死。 212 　病理学检查 　病死牛胃肠臌气 ,前三胃粘膜脱 落 ,第四胃有炎症 ,有的粘膜出血、脱落 ,小肠、大肠 均有出血斑点 ,肝脏淤血 ,有的肝被膜与膈肌粘连 , 心脏有出血点 ,肺脏淤血、表面有出血斑点 ,脾脏肿 大有出血点 ,肾淤血肿大 ,表面有出血点 ,子宫壁出 血 ,膀胱粘膜出血 ,脑膜有出血斑 ,外脑膜有出血点 , 脑沟处出血严重 ,脑桥部实质出血严重 ,脊髓出血或 有血样渗出。对死牛某些脏器进行病理组织学检 查 ,发现有特征性的变化 ,肺脏呈典型的间质性肺 炎、支气管及血管周围炎 ,浸润的细胞以淋巴细胞为 主 ,并有数量不等的嗜酸性粒细胞浸润。肾脏呈典 型的急性肾小球肾炎 ,有的以渗出为主 ,有的以增生 为主 ,肾小管上皮细胞严重变性、坏死 ,脾脏呈急性 炎性肿胀 ,脾窦内有大量嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细 胞浸润。肝脏有淋巴细胞、嗜酸性粒细胞和嗜中性 粒细胞浸润及肝细胞变性坏死等炎性变化。淋巴结 呈急性浆液性淋巴结炎并有大量嗜酸性粒细胞浸 润。脑有不典型的非化脓性脑炎变化。胃粘膜 (特 别是真胃)大片脱落 ,轻度出血、水肿。心肌没有特 征性变化。 213 　毒物检测 　用奈氏试剂反应 ,对 18 头死牛的 胃内容物、肝、肾病料进行氟乙酰胺的含量测定 ,结 果均为阴性。用气相色谱仪对 18 头死牛病料进行 的氟含量检测 ,结果见表 1。用气相色谱仪对 18 头 死牛脏器中的六六六、DDT含量进行检测 ,结果见表 2。 表 1 　死牛不同脏器中氟含量 (平均数) Table 1 　The fluorine content in different organs of dead cattle ( average) ( ppm) 脏器 Organs 病死牛 Death cattle 健康牛 Healthy cattle 　　　　肝Liver 2. 320 2. 056 　　　　肾 Kidney 2. 465 2. 512 胃内容物 Substance of stomach 1. 435 1. 426 表 2 　死牛各脏器中毒物含量 (平均数) Table 2 　The poison content in different organs of dead cattle ( average) ( ppm) 脏器 Organs 六六六 Benzene hexachloride DDT Dichloro-diphenyl trichloroethane 肝Liver 1. 12 28. 68 肾 Kidney 10. 65 54. 67 胃内容物 3. 65 42. 2 Substance of stomach 214 　病毒的检验 　病料接种鸡胚后 120 小时未出 现死亡 ,解剖鸡胚 ,胚胎发育正常 ,采集鸡胚尿囊液 做血凝试验 ,对鸡、猪、兔及人“O”型红细胞均无凝集 现象。病料接种牛肾原代细胞未出现细胞病变。病 料悬液梯度密度离心区带、鸡胚尿囊液及细胞培养 液经电镜观察后 ,均未发现病毒颗粒。 215 　细菌学检验 21511 　培养特性观察 : 将病料接种培养基 ,经 24～ 48 小时需氧和厌氧条件下培养 ,以厌养生长为好 , 在营养琼脂平板上多出现 2 种菌落 ,1 号为灰白色扁 平不透明、表面稍皱褶、边缘不整齐的大菌落 ;2 号 为灰白色、表面湿润、粘稠、边缘整齐的菌落 ,同时也 混有其它菌落 ,但分离率较低。这 2 种菌落在血液 琼脂上为褐色。厌氧肉肝汤培养基呈混浊状态 ,钩 取此菌液 ,接种普通琼脂平板培养基 ,也生长出与上 述 2 种菌相同的菌落。将上述 1 号和 2 号菌落进行 纯培养。 21512 　细菌形态观察 : 将上述 2 种菌落的纯培养物 分别染色、镜检。1 号菌为 G+ 杆菌 ,大小为 0. 5～ 0. 83 ×1～3. 8μm ,单个或成双存在 ,偶有长链 ,芽孢 居菌体中央或偏端。2 号菌为 G- 杆菌 ,两端钝圆 , 单个或成双排列 ,无芽孢 ,大小为 0. 5～0. 8 ×1～ 012　　　　　　　　　　　　　　　　　中 　国 　预 　防 　兽 　医 　学 　报 　　　　　　　　　　　　　　　　2002 年 2μm ,在动物组织中可见明显的荚膜。 21513 　细菌生化试验 : 1 号菌接触酶阴性 ;厌氧生 长阳性 ;V- P 试验阳性 ;可还原硝酸盐到亚硝酸盐 , 能分解酪朊 ,水解淀粉 ,不分解尿素和酪胺酸 ,水解 七叶树苷 ,不水解明胶 ,卵磷脂酶阴性 ;对葡萄糖、木 糖产酸 ,而对阿拉伯糖和甘露醇不产酸 ;可利用柠檬 酸盐 ,不利用丙酸盐 ,对石蕊牛乳产酸 ,不能在 7 % NaCl 中生长。2 号菌能水解七叶树苷和水杨苷 ,对 葡萄糖、木糖 ,甘露醇、阿拉伯糖、鼠李糖、蔗糖、乳糖 棉籽糖产酸 ,水解侧金盏花醇、肌醇和山梨醇 ;分解 尿素 ,不分解鸟氨酸 ;V- P 试验阴性 ,M·R 试验阳性 ; 不产生吲哚和 H2S ,不利用柠檬酸盐。 21514 　动物试验 : 将分离出的各种细菌进行统计后 发现 ,1 号菌分离率为 96 % ,2 号菌为 93. 5 % ,2 种菌 同时分离到的几率为 85. 7 % (36/ 42) 。用 2 种菌的 24 小时培养物分别或混合接种小鼠 (6 亿菌/ 只) 和 幼兔 (15 亿菌/ 只) 均 24 小时内发生死亡 ,但单独接 种一种菌者需 52～68 小时死亡。回归健康牛 (按 3 亿菌/ kg 体重接种)可造成牛 24 小时内急性死亡 ,死 亡前症状及死亡后的病理变化与自然发病者相同。 并从死亡的小鼠、兔、牛体内又回收到接种菌。 综合上述各种特性 ,经查阅伯杰氏细菌学鉴定 手册第九版确定 1 号菌为凝结芽孢杆菌 ,2 号菌为克 雷伯氏杆菌肺炎亚种。 21515 　血清学检验 : 将分离的凝结芽孢杆菌、克雷 伯氏杆菌肺炎亚种分别研制成平板凝集诊断抗原 , 经特异性检验合格 (另文报道) ,用作检查发病牛血 清 62 份 ,阳性率 1 号菌为 9119 % ,2 号菌为 8213 % ,2 种菌同时阳性为 7714 % ;检查外观为健康牛血清 118 份 ,阳性率 1 号菌为 3516 % ,2 号菌为 3212 % ,2 种菌 同时阳性为 2917 %。 21516 　免疫保护试验 : 用 2 种菌研制成油乳剂灭活 苗 ,经检验合格后 ,免疫小鼠 10 只、家兔 6 只 ,1 月后 攻毒保护率均为 100 % ,而对照小鼠 10 只、家兔 6 只 ,攻毒后 100 %发病 ,死亡率分别为 80 %、67 %。在 疫区免疫接种健康牛 1485 头 ,据调查在接种后 42～ 57 天正巧牛又发生“猝死病”,免疫接种的牛死亡 30 头 ,保护率为 98 % ,而与免疫牛为相同养殖户的未免 疫牛 876 头死亡 494 头 ,死亡率为 5614 %。 3 　讨 　论 311 　“猝死病”在山东一带发生非常严重 ,多发生在 冬末春初 ,可能与气候条件有关 ,机体抵抗力下降 , 病原菌活动旺盛造成发病。除牛发生之外 ,羊、猪、 鹿、禽也有发生 ,该病虽不是烈性传染病 ,但死亡较 多 ,损失惨重 ,造成了巨大的经济损失。 312 　根据毒物检测、病毒分离培养、细菌学检查 ,结 果证明山东地区发生的家畜“猝死病”与农药中毒、 病毒感染无关。而魏氏梭菌分离率为 418 %(2/ 42) , 凝结芽孢杆菌和克雷伯氏杆菌肺炎亚种同时分离率 为 8517 % ,并且经动物试验结果证明 ,凝结芽孢杆菌 和克雷伯氏杆菌肺炎亚种同时分离率为 8517 % ,并 且经动物试验结果证明 ,凝结芽孢杆菌和克雷伯氏 杆菌肺炎亚种均具有致病性 ,单独感染致病性弱 ,混 合感染致病性强 ,因此山东家畜猝死病主要是由凝 结芽孢杆菌和克雷伯氏杆菌肺炎亚种协同作用所 致 ,而与魏氏梭菌关系不大。 313 　山东省“猝死病”病牛 的 1 号菌及 2 号菌同时 由农业部畜牧兽医司防疫处送卫生部医学分子细菌 学重点实验室和中国人民解放军军事医学科学院进 行鉴定 ,均被鉴定 1 号菌为凝结芽孢杆菌 ,2 号菌为 克雷伯氏杆菌肺炎亚种。 314 　山东省对牛“猝死病”病因学的研究结果受到 了全国家畜“猝死病”研究攻关课题项目组的高度重 视 ,对其结果曾一度怀疑 ,于是由全国畜牧兽医总站 委托中国农科院兰州兽医研究所的杨位礼、李英才 两位学者亲临山东 ,经亲自做动物试验和调查研究 , 确证了凝结芽孢杆菌和克雷伯氏杆菌肺炎亚种协同 作用是造成山东家畜“猝死病”的主要病因。 315 　由于家畜“猝死病”临床症状以发病急、死亡快 为特征 ,往往来不及治疗 ,所以本病关键在预防。用 分离到的两种细菌研制成功的二联灭活菌苗经初步 试验预防牛“猝死病”的效果良好 ,有效保护率可在 98 %以上 ,值得在生产中推广应用。 316 　“猝死病”是近些年全国多种动物普遍发生的 一种疾病 ,危害严重。根据全国各地报道家畜“猝死 病”病因有多种[3 ] ,有的报道为魏氏梭菌[4 ,5 ] ;有的报 道为多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌、或链球菌[6 ] ;有的 报道为李氏杆菌[7 ] ;有的报道为氟乙酰胺中毒[8 ]或 缺硒[9 ]造成 ,还有的报道为牛冠状病毒、粘膜病病毒 感染后继发 A 型魏氏梭菌[10 ]而造成。而山东报道 的病原为凝结芽孢杆菌和克雷伯氏杆菌肺炎亚种协 同作用所致。这可能是由于中国地大物博、自然环 境差异较大的缘故。 参考文献 [1 ] 李景林. 培养基手册[M] . 长春 :吉林科学技术出版社 ,1991 ,114～ 200. 112第 3 期 　　　　　　　　　　　　　　朱瑞良 ,等. 山东省牛“猝死病”病原学研究 　　　　　　　　　　　　　　　 第24卷 　第3期 　　　 　　　　　　中 　国 　预 　防 　兽 　医 　学 　报 　　　　　　　　Vol. 24 , 　No. 3 2 0 0 2 年 5 月 　　　　　　　Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine 　 　　　　　　 May 　2002 鸡新城疫强毒株的分离及其人工感染试验 张训海1 ,朱鸿飞2 ,周功强1 ,王 　旋1 ,黄福林2 ,李德元2 (1. 安徽技术师范学院 , 安徵 凤阳 233100 ; 　2. 南京农业大学 , 江苏 南京 210095) 摘要 : 采用鸡胚接种法从安徽凤阳某患病鸡群中分离到一株病毒 ,经 HA、HI试验及血清中和接种鸡胚试验 ,确定为新城 疫病毒。参照国际上规定的新城疫病毒毒力判定的标准及其方法 ,测定该分离株的鸡胚最小致死量平均死亡时间 (MDT) 、1 日龄鸡脑内接种致病指数 ( ICPI)和 6 周龄鸡静脉内接种致病指数 ( IVPI) 分别为 44h、1. 74 和 2. 39。表明该分离株具有与新城 疫病毒速发型相类似的毒力 ,属强毒力毒株。用该分离株对 16 日龄的鸡、鹅、鸭分别进行了人工试验感染 ,其发病率均为 100 % ,而死亡率分别为 40 %～80 %、40 %～60 %和 0。 关键词 : 鸡 ; 　新城疫病毒 ; 　分离 ; 　人工感染 中图分类号 : S852. 65 　　　　　　　　　　文献标识码 : A 　　　　　　文章编号 : 1008-0589 (2002) 03-0212-04 Isolation and Experimental Infection of New Castle Disease Virus ZHANG Xun- hai1 ,ZHU Hong-fei2 ,ZHOU Gong- qiang1 ,WANG Xuan1 ,HUANG Fu-lin2 ,LI De-yuan2 (1. Anhui Technical Teachers College ,Fengyang 223100 , China ; 　2. Nanjing Agricultural University ,Nanjing 2100950 , China) Abstract : One strain virus was isolated from affected chickens in Fengyang of Anhui using specific pathogen free (SPF) chicken embryos , and characterized as Newcastle disease virus (NDV) by hemagglutination (HA) / hemagglutination-inhibition (HI) test ,inoculation of embryos after neutralization using particular sera. The biological characteristics of the virus was determined by measuring the mean death time of chicken embryos (MDT) ,the intracerebral pathogenicity index in day-old chicks ( ICP) and the intravenous pathgenicity index in 6-week-old chickens ( IVPI) at the virulence of NDV. The MDT ,ICPI and were 44h ,1. 74 and 2. 39 respectively. The results indicated that the isolate was high viru2 lence like velogenic Newcastle disease virus. 16- day-old chickens ,Geese and ducks could all be infected with a 100 % morbidity and 40 %～ 80 % ,40 %～60 % ,0 mortality respectively ,by different infection ways ,both inoculation and contagiou transuission such as co- breeding. Key words : Chicken ; 　Newcastle disease virus ; 　Isolation ; 　Experimental infection 　　2000 年 3 月起 ,安徽省蚌埠、滁州、淮南等地各 种周龄的产蛋鸡群相继发生一种以呼吸道病状和产 蛋下降为主的疾病 ,病鸡呼吸困难、气喘并有罗音、 流涎、甩鼻 ,产蛋下降 50 %以上 ,使用多种抗生素均 　作者简介 :张训海 (1964～) ,男 ,安徽省滁州人 ,副教授、硕 士 ,主要从事畜禽传染病的教学与研究. 　收稿日期 :2001 - 05 - 19 无效 ,但死亡率较低 ,一般在 5 %以下 ;而农户散养 鸡只则多表现为与新城疫 (ND) 速发型相类似的临 诊症状与病变 ,发病率和死亡率均较高 ,同时 ,混养 的鹅和鸭也有不同程度的发病与死亡。对发病的鸡 群用 ND IV 疫苗紧急免疫 ,效果不甚理想。为了及 时查明发病原因和研究出其防制对策 ,我们对某一 送检的病例进行了病原分离和鉴定 ,并分别进行了 对鸡、鹅、鸭的人工感染试验。现报告如下。 [2 ] 陈天寿. 微生物培养基的制造与应用 [ M] . 北京 :中国农业出版 社 ,1995 ,257～343. [3 ] 孔繁德 ,陈琼. 我国家畜猝死症的病因‘与防治对策 [J ] . 中国兽 医杂志 ,1999 ,25 (3) :50～52. 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