2暗盘孢属YM421黑色素稳定性及其抗氧化活性2

Mycosystema 菌 物 学 报 15 March 2010, 29(2): 254-260 jwxt@im.ac.cn ISSN1672-6472 CN11-5180Q ©2010 Institute of Microbiology, CAS, all rights reserved. 基金项目：安徽省自然科学基金（No. 090413086） *Corresponding author. E-mail: yeming123@sina.com 收稿日期: 2009-07-05, 接受日期: 2009-09-15 暗盘孢属 YM421 黑色素稳定性及其抗氧化活性 叶明 1* 陈晓 1 朱立 1 胡雪芹 1 林英任 2 1合肥工业大学生物与食品 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 学院 合肥 230009 2安徽农业大学林学与园林学院 合肥 230036 摘 要：对暗盘菌 Plectania sp. YM421 菌株所产黑色素的稳定性及其抗氧化活性进行了研究。结果表明：该黑色素易溶于 氢氧化钠溶液和二甲亚砜，微溶于蒸馏水，不溶于盐酸、无水乙醇、乙酸乙酯、氯仿、二甲苯、丙酮和乙醚；该黑色素在 pH≥6 时稳定，pH≤5 时产生沉淀；对室光、日光、紫外光、亚硫酸钠、Na+和 K+稳定；添加苯甲酸钠、柠檬酸钠、蔗糖、 葡萄糖、乳糖、麦芽糖对黑色素有增色或护色作用；而双氧水、柠檬酸、Vit C、Mg2+、Cu2+、Zn2+、Ca2+、Fe3+、Al3+降低 其稳定性；该黑色素与 Vit C 还原能力的 EC50值（吸光度为 0.5 时的浓度）分别为 169.6µg/mL 和 31.88µg/mL，对羟基清除 作用的 IC50值（清除率为 50%时的浓度）分别为 360.4µg/mL 和 183µg/mL。作为一种新型的天然色素，YM421 黑色素有望 应用于食品、化妆品以及医药等行业。 关键词：pH，光，金属离子，还原能力，羟自由基，天然色素 Stability and antioxidative activities of melanin from Plectania sp. YM421 YE Ming1* CHEN Xiao1 ZHU Li1 HU Xue-Qin1 LIN Ying-Ren2 1School of Biotechnology and Food Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China 2College of Forest and Garden, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China Abstract: The stability and antioxidative activities of melanin from Plectania sp. YM421 were studied. The results showed that the melanin was soluble in NaOH solution and dimethylsulfoxide, slightly soluble in distilled water, and insoluble in HCl, anhydrous ethanol, ethyl acetate, chloroform, dimethylbenzene, acetone and ether. The melanin was stable in the solution at pH≥6, but deposited at pH≤5. The melanin was stable to room light, sunlight, ultraviolet light, Na2SO3, Na+ and K+. Sodium benzoate, sodium citrate, sucrose, glucose, lactose and maltose had the function of color increase or color preservation to the melanin, while H2O2, citric acid, Vit C, Mg2+, Cu2+, Zn2+, Ca2+, Fe3+ and Al3+ decreased melanin stability. For the melanin and Vit C, the EC50 value (the effective concentration at which the absorbance was 0.5) of the reducing power were 169.6µg/mL and 31.88µg/mL, and the IC50 value (the effective concentration at which the scavenging rate was 50%) of hydroxyl radical scavenging activity were 360.4µg/mL Vol.29 No.2 255 菌物学报 and 183µg/mL, respectively. As a kind of new-style natural pigment, YM421 melanin is expected to be utilized in food, cosmeticand and medicine industry. Key words: pH, light, metal ions, reducing power, hydroxyl radical, natural pigment 黑色素是一类广泛存在于动植物和微生物的 进化过程中，通过多羟基酚氧化而成的构造不 规则 编码规则下载淘宝规则下载天猫规则下载麻将竞赛规则pdf麻将竞赛规则pdf 的类多酚聚合体（Alois & Michael 1986），可为生 物体提供结构性强度以及保护生物体免受紫外线、 电离辐射、重金属污染、低温和高温等环境胁迫的 伤害（Hofrichter & Steinbuchel 2004）。黑色素不仅 可以作为紫外线吸收剂、抗氧化剂、自由基清除剂、 阳离子螯合剂和新型天然的药物载体（Jacobson & Tinnell 1993；Liu et al. 1993），还可用来治疗某些 与黑色素缺乏有关的神经系统疾病（da Silva et al. 2006）。 近年来，陆续发现合成色素对人体潜在的危 害，因此越来越多的天然色素用于食品和化妆品。 在国际市场上天然色素的产量正以每年 10%的速 度增长。另外，源自动植物的天然色素由于受到季 节、气候及地理区域限制等，已远远不能满足实际 需求。真菌色素是世界菌物资源的重要组成部分， 具有极大的开发潜力。本研究首次对分离的一株暗 盘菌属菌株所产黑色素的稳定性，还原力以及清 除·OH 能力进行研究，以期为盘菌黑色素在食品， 医药等方面的开发和应用提供理论依据。 1 材料和方法 1.1 菌株 暗盘菌 Plectania sp. YM421，由合肥工业大学 微生物资源与应用研究室分离保藏。 1.2 培养基 分离与保藏培养基：PDA 培养基加入 0.5%蛋 白胨（叶明等 2007）。 发酵培养基：蔗糖2.5%，K2HPO4 0.05%，MgSO4 0.03%，谷氨酸钠 0.5%，酵母膏 0.4%，蒸馏水 1,000mL，pH 6.5（杨端云等 2007）。 1.3 YM421 黑色素发酵 用打孔器接种直径 6mm、菌龄一致的 YM421 菌块于装有 30mL 发酵培养基的 100mL 三角瓶中， 于 25℃、200r/min 摇床中培养 10d。 1.4 YM421 黑色素的分离与纯化 参考叶明等（2009）以及 Wang et al.（2006） 的方法并略作修改。黑色素粗品经 7mol/L HCl 于 100℃酸解 2h，以除去与黑色素结合的蛋白质及碳 水化合物。酸解后，沉淀经双蒸水洗涤至上清液 pH 值为 7 时重新溶于 1mol/L NH3·H2O 溶液，旋转蒸 发仪蒸去 NH3 至溶液 pH 为 7.5 后，依次经乙酸乙 酯、氯仿、无水乙醇萃取，以除去脂类物质，萃取 后除去有机相，水相调 pH 值为 2，5,000r/min 离心 10min，沉淀反复经去离子水洗涤至上清液 Cl–定性 检测为阴性后，真空冷冻干燥即可。 1.5 YM421 黑色素紫外可见吸收光谱扫描及黑色素 相对含量测定 将纯化后的黑色素溶于 1mol/L NH3·H2O 溶液， 50℃水浴 1h，用旋转蒸发仪蒸去 NH3至溶液 pH 值 为 7.5 左右，定容至合适的浓度，以蒸馏水作为空白 对照，1cm 石英比色皿在 200－800nm 处进行光谱扫 描。以 λmax下吸光度 A 值表示黑色素的相对含量。 1.6 YM421 黑色素溶解性测定 取 0.01g 黒色素分别用 10mL NaOH 溶液 （pH9）、DMSO、HCl（1mol/L）、蒸馏水、无水乙 醇、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙醚、二甲苯振荡溶 解 1h，于 λmax 处测吸光度 A 值。 1.7 YM421 黑色素稳定性 参照徐磊和王长海（2006）的方法进行，配制 浓度为 0.1g/L 的黑色素溶液，在不同 pH 值、光以 及添加不同金属离子、糖、氧化剂、还原剂和食品 添加剂条件下，于 λmax 处测吸光度 A 值，重复 3 次。 1.8 YM421 黑色素体外抗氧化活性测定 1.8.1 还原力测定：参照魏行等（2007）方法进行， 以蒸馏水作为无还原能力的样品对照调零，700nm 处测定吸光度值。A700 越大，还原能力越强。Vit C 作为阳性对照。 1.8.2 清除·OH 测定：参照 Zhao et al.（2004）的方 256 Mycosystema http://journals.im.ac.cn/jwxtcn 法并略作改进。取5×l0-3mol/L邻二氮菲溶液1.5mL， 依次加入 2.0mL PBS（0.05mol/L，pH7.4），1.0mL FeSO4（7.5 × 10-3 mol/L）溶液，1.0mL H2O2（0.1%）， 混匀后，以蒸馏水定容至 10mL。反应液 37℃保温 lh，于 536nm 处测吸光度 A 损伤。同法，分别加入 2mL 不同浓度黑色素溶液、Vit C 溶液后再加 H2O2， 测 A 加样。未损伤管不加 H2O2 及黑色素溶液或 Vit C 溶液。OH 清除率（%）=[（A 加样-A 损伤）／（A 未损伤 -A 损伤）]× 100%。 2 结果与分析 2.1 YM421 黑色素的紫外可见扫描 该黑色素在紫外波长下的最大吸收峰在286nm 处，并且在紫外和可见光区，吸光度随波长的增大 而逐渐降低（图1）。故选择在286nm处测定该黑色 素溶液的吸光度。 图 1 YM421 黑色素的紫外-可见吸收光谱图 Fig. 1 UV-Absorption spectrum of the melanin of YM421. 2.2 YM421 黑色素的溶解性 YM421 黑色素同徐磊和王长海（2006）所报道 的真菌黑色素类似，易溶于 NaOH 溶液和 DMSO， 溶液呈深棕色；微溶于蒸馏水，不溶于 HCl、无水 乙醇、乙酸乙酯、氯仿、二甲苯、丙酮和乙醚（表 1）。 2.3 YM421 黑色素的稳定性分析 2.3.1 pH 对黑色素稳定性的影响：YM421 黑色素 易溶于碱性溶剂，在酸性溶剂中析出沉淀。当调 节溶液的 pH 值为 5 时黑色素全部析出；当 pH≥ 6 时，黑色素逐渐溶解，吸光度呈上升趋势，表 明此时黑色素易溶于 pH≥6 的溶剂（表 2）。即 该黑色素溶液在 pH≤5 时不稳定，在 pH≥6 时较 稳定。 2.3.2 光对黑色素稳定性的影响：作为光保护剂， 真菌黑色素可以减小 UVB、UVA 以及可见光的波 长，从而有效防止紫外线等对生物体造成的伤害 （Gauslaa & Solhaug 2001）。YM421 黑色素在室光 下吸光度先略有下降后上升，超过 9d 时，其溶液 吸光度基本保持稳定（表 3），表明该黑色素在室光 下稳定；在暴晒情况下，3d 后，该黑色素溶液略有 褪色，吸光度略有下降，在暴晒 15d 后残存率达 91.5%（表 3），表明该黑色素在暴晒条件下较稳定， 但也应尽量避免强光。在紫外光的照射下，黑色素 溶液的吸光值变化很小，紫外线照射 120min 后残 存率达 99.4%（表 4），表明该黑色素在紫外光条件 下稳定。 2.3.3 金属离子对黑色素稳定性的影响：黑色素作 为一类由酪氨酸氧化而来的生物多聚物，因结构中 具有带负电的羧基和去质子化的羟基，对阳离子有 明显的结合作用（Riley 1997）。黑色素溶液中添加 K+及 Na+，其吸光度略有增大，表明该黑色素对 K+ 及 Na+稳定；而 Mg2+、Cu2+、Zn2+、Ca2+、Fe3+、 Al3+的加入，黑色素溶液产生大量沉淀，溶液颜色 急剧下降，表明该黑色素对 Mg2+、Cu2+、Zn2+、Ca2+、 Fe3+、Al3+极不稳定，在储藏过程中应尽量避免与这 些离子接触（表 5）。 表 1 不同溶剂的黑色素溶液吸光度及颜色 Table 1 The absorbency and color in different solvent of the melanin solution 溶液 Solution A286 颜色 Color NaOH 0.363±0.002 深棕色 Nigger-brown DMSO 0.386±0.001 深棕色 Nigger-brown 蒸馏水 Distilled water 0.044±0.001 浅黄色 Buff HCl － － 无水乙醇 Anhydrous ethanol － － 乙酸乙酯 Ethyl acetate － － 氯仿 Chloroform － － 二甲苯 Dimethylbenzene － － 丙酮 Acetone － － 乙醚 Aether － － 注：“－”表示 A286 未测出或无色. Note: “－”, A286 is not detected or colorless. Vol.29 No.2 257 菌物学报 表 2 pH 对黑色素稳定性影响 Table 2 Effects of pH value on stability of the melanin pH 时间（h） Time (h) 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 0 － － － 0.372 0.393 0.398 0.421 0.425 0.445 0.462 0.460 0.452 24 － － － 0.386 0.406 0.413 0.425 0.425 0.448 0.461 0.461 0.454 48 － － － 0.400 0.410 0.415 0.428 0.433 0.448 0.462 0.462 0.456 注：“－”表示沉淀 . Note: “－”, deposit. 表 3 光对黑色素稳定性影响 Table 3 Effects of light on stability of the melanin 照射时间（d） Irradiation time (d) 室光 Room light 暴晒 Insolation 0 0.330±0.002 0.330±0.001 3 0.321±0.001 0.325±0.002 6 0.350±0.004 0.316±0.003 9 0.360±0.003 0.310±0.003 12 0.354±0.002 0.304±0.001 15 0.351±0.001 0.302±0.002 表 4 紫外光对黑色素稳定性影响 Table 4 Effects of UV-light on stability of the melanin 照射时间（min） Irradiation time (min) A286 残存率（%） Survival rate (%) 0 0.330±0.001 100 20 0.329±0.003 99.7 40 0.327±0.002 99.1 60 0.328±0.002 99.4 80 0.326±0.004 98.8 100 0.327±0.003 99.1 120 0.328±0.002 99.4 2.3.4 糖类对黑色素稳定性的影响：蔗糖、葡萄糖、 乳糖及麦芽糖溶液对黑色素稳定且具有明显的增 色作用，其中葡萄糖和麦芽糖浓度分别在 0.5%和 0.25%时增色作用最大（表 6）。 2.3.5 氧化剂、还原剂对黑色素稳定性的影响：由 于黑色素结构中正醌和邻苯二酚多聚物部分间的电 子离域使其产生很多半醌自由基，从而表现出一定 表 5 金属离子对黑色素稳定性的影响 Table 5 Effects of metal ions on stability of the melanin 浓度（mol/L） Concentration (mol/L) 金属离子 Metal ion 0.0000 0.0125 0.0250 Mg2+ 0.228±0.002 － － Cu2+ 0.228±0.002 － － Al3+ 0.228±0.002 － － Zn2+ 0.228±0.002 － － Ca2+ 0.228±0.002 － － Fe3+ 0.228±0.002 － － Na+ 0.228±0.002 0.233±0.002 0.231±0.002 K+ 0.228±0.002 0.233±0.002 0.232±0.002 注：“－”表示沉淀 . Note: “－”, deposit. 的氧化还原性（Riley 1997）。随着 H2O2 浓度的增 加和时间的延长，黑色素溶液的吸光度呈下降趋 势，浓度 3%，1.5h 后残存率达 83.6%（表 7），因 此黑色素易被 H2O2 氧化褪色，在使用过程中应避 免其与强氧化剂接触。随着 Na2SO3 溶液浓度的增 加，黑色素的吸光度略有减小，当 Na2SO3 溶液浓 度为 0.2mol/L 时，1h 后残存率达 96.3%（表 8）， 表明该黑色素具有良好的耐还原性。 2.3.6 食品添加剂对黑色素稳定性的影响：向黑色 素溶液中加入一定量的食品添加剂，70min 后，苯 甲酸钠、柠檬酸钠、柠檬酸、Vit C 的残存率分别为 101.8%、98.2%、44.3%、44.3%，表明苯甲酸钠、 柠檬酸钠对该黑色素有增色或护色作用；而该黑色 素对柠檬酸、Vit C 不稳定（表 9）。 258 Mycosystema http://journals.im.ac.cn/jwxtcn 表 6 糖对黑色素稳定性的影响 Table 6 Effects of different sugars on stability of the melanin 浓度（%） Concentration (%) 蔗糖 Sucrose 葡萄糖 Glucose 乳糖 Lactose 麦芽糖 Maltose 0.00 0.228±0.001 0.228±0.002 0.228±0.003 0.228±0.002 0.25 0.226±0.003 0.226±0.004 0.231±0.001 0.299±0.002 0.50 0.234±0.002 0.250±0.001 0.232±0.001 0.231±0.003 1.00 0.241±0.003 0.240±0.004 0.241±0.003 0.245±0.003 2.00 0.271±0.004 0.245±0.002 0.245±0.002 0.242±0.001 表 7 H2O2对黑色素稳定性的影响 Table 7 Effects of H2O2 on stability of the melanin 时间 Time (h) 浓度（%） Concentration (%) 0h 0.5h 1.5h 残存率（%） Survival rate (%) 0.0 0.228±0.001 0.228±0.003 0.228±0.001 100 0.5 0.224±0.002 0.216±0.002 0.209±0.001 93.3 1.0 0.221±0.002 0.205±0.003 0.197±0.004 89.1 1.5 0.218±0.004 0.204±0.004 0.195±0.003 89.4 2.0 0.214±0.003 0.202±0.004 0.193±0.002 90.2 3.0 0.214±0.003 0.189±0.001 0.179±0.002 83.6 表 8 Na2SO3对黑色素稳定性的影响 Table 8 Effects of Na2SO3 on stability of the melanin 时间 Time (h) 浓度（mol/L） Concentration (mol/L) 0h 0.5h 1.0h 残存率（%） Survival rate (%) 0 0.228±0.001 0.228±0.002 0.228±0.004 100 0.0125 0.239±0.002 0.231±0.003 0.231±0.004 96.7 0.025 0.239±0.003 0.231±0.001 0.231±0.003 96.7 0.05 0.240±0.004 0.233±0.001 0.231±0.003 96.3 0.1 0.246±0.002 0.236±0.004 0.234±0.002 95.1 0.2 0.242±0.003 0.235±0.003 0.233±0.001 96.3 表 9 食品添加剂对黑色素稳定性的影响 Table 9 Effects of food additive on stability of the melanin 时间 Time (min) 食品添加剂 Food additive 0min 40min 70min 残存率（%） Survival rate (%) 苯甲酸钠 Sodium benzoate 0.228±0.001 0.231±0.004 0.232±0.001 101.8 柠檬酸钠 Sodium citrate 0.228±0.003 0.213±0.002 0.224±0.001 98.2 柠檬酸 Citric acid 0.228±0.003 0.186±0.001 0.101±0.003 44.3 维生素 C Vitamin C 0.228±0.004 0.189±0.002 0.101±0.002 44.3 Vol.29 No.2 259 菌物学报 2.4 YM421 黑色素抗氧化活性 2.4.1 YM421 黑色素还原力的测定：一些生物活性 物质的抗氧化能力与还原力之间有着直接的关系 （Bougatef et al. 2009）。Fe3+还原为 Fe2+通常被用来 衡量活性物质给电子能力的大小，通过提供氢原子 来打断自由基链式反应来显示其抗氧化活性 （Ronge et al. 2007），同时也是多酚类物质之所以 具有抗氧化性的重要机理之一（Dorman et al. 2003）。随着浓度的增加，YM421 黑色素的还原能 力呈上升趋势并呈现出良好的线性关系（y = 0.0016x + 0.2287，R2 = 0.9627）（图 2）。该黑色素 与 Vit C 的 EC50 值（吸光度为 0.5 时的浓度）分别 为 169.6µg/mL 与 31.88µg/mL，表明 YM421 黑色素 具有一定的还原能力，但还原能力弱于 Vit C。 图 2 黑色素的还原能力 Fig. 2 The reducing power of the melanin. 图 3 黑色素清除·OH 效果 Fig. 3 The effect of scavenging ·OH radical by the melanin. 2.4.2 YM421 黑色素对·OH 的清除作用：酚羟基具 有很强的提供质子的能力，羟基越多，提供的氢离 子越多，能与更多的活性自由基结合，而且羟基上 氧原子的 p-π 共轭效应使生成的自由基更稳定（陈 琪等 2003）。YM421 黑色素对·OH 的清除作用随着 浓度的增加而增强（图 3），并且表现出良好的量 效关系（y = 0.1358x + 1.055，R2 = 0.9877）。该黑 色素在浓度为 350µg/mL 时对·OH 的清除率达到 48.59%，与 Vit C 的 IC50值（清除率为 50%时的浓 度）分别为 360.4µg/mL 与 183µg/mL，表明 YM421 黑色素对·OH 的清除作用弱于 Vit C。 3 讨论 近年来随着人们对合成色素安全性问题认识 的加深，天然色素将逐渐替代合成色素。对 Plectania sp. YM421黑色素的研究发现，该黑色素 与Wang et al.（2006）报道的桂花种子黑色素性质 相似，在pH≥6时稳定，表明该黑色素可望用于偏 碱性食品中；同时该黑色素表现出的糖稳定性以及 光稳定性，表明该黑色素可用于食品着色剂以及有 利于延长食品的货架期。 活性氧簇（ROS）和自由基是造成 DNA、蛋 白质和脂肪细胞分子氧化损伤的主要原因。当生物 体内受大量刺激超过生物体内抗氧化能力时，开始 产生 ROS，并将导致大量的病理生理现象产生 （Droge 2002）。合成抗氧化剂由于其安全性问题 将逐渐被天然抗氧化剂所替代。本研究中 Plectania sp. YM421 黑色素抗氧化活性表明该黑色素具有 还原力以及清除羟基自由基的能力。该黑色素有望 作为天然的抗氧化剂广泛应用于保健食品、化妆 品、医药等行业。 [REFERENCES] Alois AB, Michael HW, 1986. Biosynthesis and functions of fungal melanins. Annual Review of Phytopathology, 24: 411-451 Bougatef A, Hajji M, Balti R, Lassoued I, Ellouz YT, Nasri M, 2009. Antioxidant and free radical-scavenging activities of smooth hound (Mustelus mustelus) muscle protein hydrolysates obtained by gastrointestinal proteases. Food Chemistry, 114(4): 1190-1205 Chen Q, Wang BC, Tang CH, Duan CR, 2003. The relation between 260 Mycosystema http://journals.im.ac.cn/jwxtcn structure and antioxygenic activity of flavonoid. 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