响应面分析法优化微波辅助提取荷叶多酚的工艺研究

响应面分析法优化微波辅助提取荷叶多酚的工艺研究 响应面分析法优化微波辅助提取荷叶多酚的工艺研究 摘 要：文章在微波辅助条件下采用响应面分析法优化对荷叶多酚的提取工艺进行优化研究。在单因素实验的基础上，用Plackett-Burman设计对影响荷叶多酚得率的因素进行了评价并筛选出具有影响最显著的三个因子；通过响应面法（RSM）最终确定的最佳提取条件为：液固比为53:1、乙醇体积分数为33%、微波作用时间为180s。在此最佳提取工艺条件下荷叶多酚得率的预测值可达4.398%，实测值为 4.408%，相对误差为0.23%。 关键词：多酚；Plackett-Burman设计；响应面法 Study on the microwave-assisted extraction of polyphenols in lotus-leaf by response surface analysis ZHAO Bo, ZHAO Xiao-yun, LI Zhi-zhou School of Chemical & Environmental Sciences，Shaanxi University of technology Hanzhong Shaanxi 723001 Abstract: The optimization of microwave-assisted extraction of polyphenols in lotus-leaf by response surface analysis is researched in this paper. On the basis of single factor experiment, Plackett-Burman design was applied to evaluate the factors of the microwave-assisted extraction of polyphenols from lotus-leaf, and screened out the key factors; the optimization conditions of microwave-assisted extraction of polyphenols from lotus-leaf were determined finally by response surface analysis and the results showed that the optimum extraction conditions: the ratio of liquid-solid 53:1, ethanol volume fraction 33%, the microwave time 180s. Under such conditions, the predictive values of the rate of the polyphenols can reach 4.398%,and the measured values is 4.408%, the relative error is 0.23%. Keywords: polyphenols; Plackett-Burman design; response surface analysis 荷叶(Folium Nelumbinis)是睡莲科植物莲的叶片，1991年被国家卫生部列入第二批“既是食品又是药品”的名单中[1]。荷叶中含有的多酚类物质，具有生物抗氧化性、抗衰老降血脂、清暑利湿、凉血止血等功效[2]。荷叶已成为一种可以开发的新型药用资源。 响应面法(Response Surface Methodology)采用多元二次回归方法作为函数估计的工具,研究因子与响应值之间、因子与因子之间相互关系，是统计设计实验技术的合成。采用合理的实验设计，能以最经济的方式、用很少的时间对实验进行全面研究[3]。因而响应面法成为降低成本、优化加工条件的一种有效方法，已广泛地应用于农业、生物、食品等领域的研究[4-6]。本试验在单因素实验的基础上，首先应用Plackett-Burman设计[7-8]从影响提取的五个因素中筛选出影响最显著的三个因素，然后利用SAS8.1统计软件对影响最为显著的三个因素作了响应面优化，确定最佳提取工艺条件，以便改进荷叶多酚提取工艺，为规模化生产提供参考依据。 1实验部分 1.1 实验材料与主要仪器 主要原料及试剂：荷叶(产地：汉中)、没食子酸、三氯化铁、铁氰化钾、盐酸、甲醇、乙醇、丙酮等，均为分析纯（AR）； 主要仪器：WF-2000微波反应器(上海屹尧分析有限公司)；TU-1800型紫外分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；GR-200电子分析天平(日本-A&D公司)等。 1.2 实验方法 1.2.1 没食子酸 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 曲线的绘制 精确量取没食子酸50mg，配制浓度为0.05mg/mL的标准溶液，分别移取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL置于25mL棕色量瓶中，依次加入0.5mL浓度为0.100mol/LFeCl3溶液、0.5mL浓度为0.008mol/L K3Fe(CN)6溶液和0.5mL浓度为0.1mol/L的盐酸溶液，蒸馏水定容，摇匀，静置15min后用紫外可见分光光度计在695nm处测定吸光值，并绘制标准曲线[9]，采用二次回归得回归线性方程为:y=0.3653x+0.0171，R2=0.9993 式中：y—表示吸光度;x—表示没食子酸浓度(μg/mL)。 1.2.2 荷叶多酚的提取流程 新鲜荷叶→除去叶柄清洗→切碎→60℃干燥 →粉碎→筛分(0.3mm)→微波提取→过滤→荷叶多酚提取液→浓缩→低温烘干→荷叶粗多酚 1.2.3荷叶多酚含量的测定 准确称取1.000g荷叶干粉，按照一定的料液比加入不同体积分数的溶剂，控制提取温度，在一定微波功率下提取一定时间后离心，加水定容至100mL。然后取0.1mL上述溶液，采用1.2.1的方法测定荷叶多酚含量。 荷叶多酚得率(%)=(提取的荷叶多酚的质量/荷叶干粉的质量)×100% 2结果与分析 2.1 提取剂的选择 分别选用体积分数为20%的甲醇、乙醇、丙酮溶液和蒸馏水作为萃取剂，每种溶剂平行3组。在微波功率为300W、温度为60℃、微波作用时间为150s、液固比为50:1，按照1.2.3的方法进行最佳提取溶剂的选择试验，结果取平均值。试验结果见图1所示。由图1可知，20%甲醇溶液提取效果最佳，20%乙醇和丙酮溶液次之，水的提取效果最差。但考虑到甲醇和丙酮的毒性较大，提取后去除不完全会对人体造成不良影响，而水的提取效果又太差，因此从安全、简便角度考虑，实验选用乙醇溶液作为荷叶多酚的提取溶剂。 2.2单因素试验 2.2.1 液固比对荷叶多酚提取效果的影响 固定微波功率为300W、温度为60℃、乙醇体积分数为20%、微波作用时间为150s。每个液固比平行3份，结果取平均值。不同液固比对荷叶多酚提取效果的影响见图2所示。由图2可知，液固比的增大对提高多酚得率的影响较为显著，在20:1～50:1之间，多酚得率呈上升局势，而在50:1～70:1之间则多酚得率下降。所以最适提取固液比为50:1。 图1 不同提取剂对荷叶多酚得率的影响 图2 液固比对荷叶多酚得率的影响 2.2.2 乙醇体积分数对荷叶多酚提取效果的影响 固定液固比50:1、微波功率为300W、温度为60℃和微波作用时间为150s，改变提取剂浓度，每个浓度平行3份，结果取平均值。不同乙醇体积分数对荷叶多酚提取效果的影响见图3所示。由图3可知，随着乙醇体积分数的增加，荷叶多酚得率提高，当乙醇浓度为30%时，多酚得率达到最大值。但超过30%后，荷叶多酚提取率却下降。所以本实验确定提取剂浓度为30%。 2.2.3微波功率对提取效果的影响 固定乙醇体积分数为30%、温度为60℃、液固比50:1、微波作用时间为150s，研究微波功率对多酚提取率的影响。每个微波功率平行3组，结果取平均值。不同微波功率对荷叶多酚提取效果的影响见图4所示。由图4可知，多酚得率随着微波功率的提高而增加，而超过一定值后又呈下降趋势。故此选择最佳微波功率为500W。 图3 乙醇体积分数对荷叶多酚得率的影响 图4 微波功率对荷叶多酚得率的影响 2.2.4 微波作用时间对荷叶多酚提取效果的影响 固定微波功率为500W、温度为60℃、乙醇体积分数为30%、液固比为50:1，研究提取时间对多酚得率的影响。每个微波作用时间平行3组，结果取平均值。不同微波作用时间对荷叶多酚提取效果的影响见图5所示。由图5可知，随着时间延长多酚得率逐渐增大，180s时最高，之后多酚得率又下降。因此微波时间选用180s比较适宜。 2.2.5 提取次数对荷叶多酚提取效果的影响 固定微波功率为500W、乙醇体积分数为30%、液固比为50：1、微波作用时间为180s。多次提取、离心后合并滤液，测定多酚含量，平行3组实验，结果取平均值。不同提取次数对荷叶多酚提取效果的影响见图6所示。由图6可知，提取次数超过2次后，多酚得率没有明显变化，从成本角度考虑，选择提取次数为2次较为合适。 图5 微波作用时间对荷叶多酚得率的影响 图6 提取次数对荷叶多酚得率的影响 2.2 Plackett-Burman设计确定关键影响因子 2.2.1 Plackett-Burman试验设计处理及响应值 在单因素试验的基础上，对上述5个因素进行考察，每个因素取低水平“-1”和高水平“1”。另设3个虚拟列以考察实验误差，设计实验次数N=12的Plackett-Burman实验[10]，以多酚得率Y1为响应值，每个实验进行3次重复,结果取平均值。Plackett-Burman试验设计及结果见表1。 表1 N=12的Plackett-Burman试验设计及结果 实验号 液固比(mL/g)X1 乙醇体积分数(%)X2 微波功率(W)X3 微波作用时间(s)X4 提取次数(次)X5 X6 X7 X8 Y1 1 1(70) -1(10) 1(300) -1(120) -1(1) -1 1 1 3.529 2 1 1(50) -1(700) 1(240) -1 -1 -1 1 3.421 3 -1(30) 1 1 -1 1(3) -1 -1 -1 3.486 4 1 -1 1 1 -1 1 -1 -1 3.518 5 1 1 -1 1 1 -1 1 -1 3.691 6 1 1 1 -1 1 1 -1 1 3.425 7 -1 1 1 1 -1 1 1 -1 3.688 8 -1 -1 1 1 1 -1 1 1 4.409 9 -1 -1 -1 1 1 1 -1 1 4.455 10 1 -1 -1 -1 1 1 1 -1 3.667 11 -1 1 -1 -1 -1 1 1 1 3.938 12 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 3.859 2.2.2 显著影响因子的确立 利用SAS8.1 软件对Plackett-Burman实验结果进行回归模型方差分析, 所得回归方程达到显著(P=0.025187<0.05)，决定系数R2=97.47%，表明本实验97.47%的数据变异性可以用此回归模型来解释。实验回归方程系数显著性见表2： 表2 回归方程显着性检验表 因子 F值 P值 显着性 X1液固比(mL/g) 47.921 0.00618 显著 X2乙醇体积分数(%) 22.94435 0.017306 显著 X3微波功率(W) 6.836604 0.079363 不显著 X4微波作用时间(s) 11.72202 0.041728 显著 X5提取次数(次) 9.993206 0.050824 不显著 表2表明，X1、X2、X4三个因子的P值<0.05，因此，在用微波法提取荷叶多酚的工艺中，显着影响因子重要性排序为：液固比>乙醇体积分数>微波作用时间。 2.3 响应面法分析法优化工艺 根据Box-Benhnken的中心组合设计原理[11-12]，选取上述试验确定的液固比、乙醇体积分数、微波作用时间三个主要影响因素为自变量，分别以x1、x2、x3表示，并以+1、0、-1分别代表自变量的高、中、低水平，按方程xi=(Xi-Xo)/X对自变量进行编码。其中，xi为自变量的编码值，Xi为自变量的真实值，Xo为试验中心点处自变量的真实值，X为自变量的变化步长。 采用三因素三水平的响应面分析方法进行试验设计，试验因数水平及编码见表3。 表3 试验因数水平及编码 变量 代码 编码水平 编码 未编码 -1 0 1 液固比(mL/g) x1 X1 30 50 70 乙醇体积分数(%) x2 X2 10 30 50 微波作用时间(s) X3 X3 120 180 240 编码值与真实值之间的关系为:x1=(X1-50)/20，x2=(X2-30)/20，x3=(X3-180)/60 2.3.1 响应面分析 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 及结果 为了研究方便，以下实验均进行单次提取，以三次试验所得多酚得率的平均值为响应值(Y1),响应面实验设计与结果见表4所示。 表4 响应面实验设计及结果 试验号 x1 x2 x3 Y1 1 -1 -1 0 3.592 2 -1 1 0 3.877 3 1 -1 0 3.769 4 1 1 0 3.857 5 0 -1 -1 3.621 6 0 -1 1 3.710 7 0 1 -1 4.013 8 0 1 1 3.958 9 -1 0 -1 3.920 10 1 0 -1 4.099 11 -1 0 1 3.902 12 1 0 1 4.091 13 0 0 0 4.385 14 0 0 0 4.384 15 0 0 0 4.383 对表4实验结果用SAS8.1统计软件包进行方差分析，结果见表5。各因素经回归拟合后得回归方程为：Y1=4.384+0.065625x1+0.126625x2+0.001x3-0.216375x12-0.04925x1x2+0.0025 x1x3 -0.393875x22-0.036x2x3-0.164625x32。其决定系数R2=0.9843，试验值与预测值高度拟合。 表5 回归方程方差分析 方差来源 DF SS MS F Pr >F x1 1 0.065625 0.019319 3.396995 0.019314 x2 1 0.126625 0.019319 6.554582 0.001239 x3 1 0.001 0.019319 0.051764 0.960721 x12 1 -0.216375 0.028436 -7.60916 0.000623 x1x2 1 -0.04925 0.027321 -1.80267 0.131305 x1x3 1 0.0025 0.027321 0.091506 0.930643 x22 1 -0.393875 0.028436 -13.8512 0.0001 x2x3 1 -0.036 0.027321 -1.31769 0.244751 x32 1 -0.164625 0.028436 -5.78929 0.002165 模型 9 0.933757 0.103751 34.7498 0.000556 误差 5 0.014928 0.002986 总计 14 0.948685 表5数据显示，液固比、乙醇体积分数的“Pr>F”值小于0.05，表明其影响显著，但微波作用时间的“Pr>F”值大于0.05表明其影响不显著。整体模型的“Pr>F”值小于0.01，表明该二次方程模型高度显著。 2.3.2 因素间的交互影响 采用Statistica6.0软件处理得响应面分析结果见图7-9。图7-9直观给出了各个因子交互作用的响应面的3D和等高线分析图。从响应面的最高点和等值线可以看出在所选的范围内存在极值，即是响应面的最高点同时也是底面上等值线最小椭圆的中心点。 图7为x1（液固比）和x2（乙醇体积分数）对Y1(多酚得率)的响应曲面图,固定x2, Y1随着x1的增加而增大, 达到峰值后又下降；固定x1, Y1随着x3的增加也出现先增大后减小的趋势，但变化相对明显。故在提取过程中尽量考虑液固比的影响。图8为x1和x3(微波作用时间)对Y1的响应面图，随着x1和x3的增大, Y1呈现先达到最大值后又下降的趋势，但变化趋势均不明显，交互作用不显著。其结果与表5数据分析结果相吻合。图9为x2和x3对Y1的响应曲面图,保持x2为一定值, 随着x3的增加, Y1也出现先增大后减小的趋势但变化不太明显。保持x3为一定值时, 随着x2的增加Y1增大, 达到峰值后又逐渐下降且变化相对明显。 图7 Y1=f(x1、x2)的响应面和等高线分析图　 图8　Y1 =f(x1、x3)的响应面和等高线分析图 图9 Y1=f(x2、x3)的响应面和等高线分析图 2.3.3 提取工艺条件的确定 为了进一步确证最佳点的值，对回归方程取一阶偏导数等于零解方程组得x1=0.1343、 x2=0.1529、x3=-0.0126，即荷叶多酚的最佳提取条件为液固比为52.69:1、乙醇体积分数为33.06%、微波作用时间为179.96s，荷叶多酚得率理论值可达4.398%。为检验响应曲面法所得结果的可靠性，采用上述优化提取条件进行微波提取，考虑到实际操作的便利，将提取工艺参数修正为：液固比为53:1、乙醇体积分数为33 %、微波作用时间为180s，实际荷叶多酚得率4.408%，与理论预测值相比，其相对误差为0.23%。因此，基于响应曲面法所得的优化提取工艺参数准确可靠，具有实用价值。 3 结论 1）本实验以乙醇为提取剂，通过单因素实验对影响荷叶多酚提取的五个因素—液固比、乙醇体积分数、微波作用时间、微波功率及提取次数进行了考察,利用Plackett-Burman设计筛选出三个主要影响因子：液固比、乙醇体积分数和提微波作用时间。然后通过响应面分析法对各因素的最佳水平范围及其交互作用进行了研究和探讨，确定出单次提取的最佳提取条件为：液固比为53:1、乙醇体积分数为33 %、微波作用时间为180s。实验值与理论值相对误差为0.23%，故响应面法确定的工艺条件准确可靠、具有实际应用价值。 2）结合单因素实验及实际情况，本实验最终确定进行2次提取，平行3组实验，结果取平均值，荷叶多酚得率为4.573% 。 参考文献 [1]丁芳林,彭书练.超声提取荷叶黄酮工艺研究[J].湖南农业科学,2007,(6):175-177. [2]刘树兴,赵芳.荷叶功能成分研究进展[J].食品工业科技,2008,29(4):321-324. [3]凌静娜,陈定玲,金礼国.响应面法优化超声提取八角茴香油工艺[J].浙江科技学院学报, 2009,21(2),110-114. [4]逯家辉,董媛,张益波.响应面法优化桑黄菌丝体多糖超声波提取工艺的研究[J].林产化学与工业,2009,29(2):63-68. [5]颜克亮,许威,吴航军.响应面法优化白腐菌Pleurotus ostreatus降解六氯苯[J].环境污染与防治, 2009,31(8):21-27. [6]谢定,钟海雁,崔涛.响应面法优化水晶梨果醋发酵工艺条件[J].中国食品学报,2009,(2):92- 98. [7]王允祥,陆兆新,吕凤霞.翅鳞伞深层发酵胞外多糖优化研究[J].生物工程学报, 2004,20(3): 414-421. [8]杨冀艳,胡磊,许杨.Plackett-Burman设计和响应面法优化荷叶总黄酮的提取工艺[J].食品科学,2009,30(6):29-33. [9]刘莹,熊富良,张雪琼等.叶下珠中鞣质的含量测定[J].医药导报,2007,26(10): 1222-1223. [10]刘建忠,熊亚红,翁丽萍.生物过程的优化[J].中山大学学报(自然科学版),2002,S1(41):132- 137. [11]沈其君主编.SAS 统计分析[M] .南京:东南大学出版社,2001,95-124. [12]杨文雄,.高彦祥.响应面法及其在食品工业中的应用[J].中国食品添加剂,2005,(2):68-71.