引物设计的原则

引物设计的原则 Primer designPrimer design andand Software applicationSoftware application 徐文忠 PCR反应五要素：（1）酶（2） dNTP （3）模板（4）Mg2+ （5）引物引物引物：是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用 P C R就可将模板D N A在体外大量扩增。设计引物应遵循...

Primer designPrimer design andand Software applicationSoftware application 徐文忠 PCR反应五要素：（1）酶（2） dNTP （3）模板（4）Mg2+ （5）引物引物引物：是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用 P C R就可将模板D N A在体外大量扩增。设计引物应遵循以下原则： ① 引物长度 ② 引物扩增跨度 ③ 引物碱基 ④ 避免引物内部出现二级结构 ⑤ 引物的额外序列 ⑥ 退火温度 ⑦ 引物的3’末端核苷酸组成 ⑧ 引物的特异性 ⑨ 最好学会使用design software ① 引物长度 • 寡核苷酸引物长度为15~30 bp，一般为20～27 mer。 • 每增加一个核苷酸，引物特异性提高4倍。 • 引物的有效长度：Ln=2（G+C）+（A+T），Ln值不能大于38，因为>38时，最适延伸温度会超过Taq DNA聚合酶的最适温度（74℃)，不能保证产物的特异性。 ②引物扩增跨度 • 以200～500 bp为宜，特定条件下可扩增长至10 kb的片段，甚至更长。 • 预期产物的特定长度经常取决于应用的需要。 ③引物碱基 • G+C含量一般为40%～60%。 G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 ④避免引物内部出现二级结构 • 包括引物自身二聚体、发卡结构、引物间二聚体等。这些因素会影响引物和模板的结合从而影响引物效率。 • 对于引物的3’末端形成的二聚体，应控制其∆G大于- 5.0 kcal/mol或少于三个连续的碱基互补，因为此种情形的引物二聚体有进一步形成更稳定结构的可能性，引物中间或5’端的要求可适当放宽。 • 引物自身形成的发卡结构，也以3’端或近3’端对引物- 模板结合影响更大；影响发卡结构的稳定性的因素除了碱基互补配对的键能之外，与茎环结构形式亦有很大的关系。应尽量避免3’末端有发卡结构的引物。 ⑤引物的额外序列 • 若有额外的序列信息要加到引物中，例如T7 RNA聚合酶结合位点、限制酶切位点或者GC发夹结构可以使用加长的引物。 • 一般说来，引物5’端添加无关序列不会影响引物特异序列的退火。有时候，引物中添加了大量与模板不配对的碱基，可以在较低退火温度的条件下进行4 到5个扩增循环；然后在假定引物5’端序列已经加入到模板中，计算得出的退火温度下进行其余的循环。 ⑥退火温度引物的另一个重要参数是熔解温度（Tm）。这是当 50％的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度。 Tm对于设定PCR退火温度是必需的。在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。合理的退火温度从55℃到70℃。退火温度一般设定比引物的Tm低5℃。 Tm值（解链温度）=4(G+C)＋2(A+T) 复性温度=Tm值－(5～10℃) 在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。 ⑦引物的3’末端核苷酸组成 • 引物3’末端和模板的碱基完全配对对于获得好的结果是非常重要的，而引物3’末端最后5到6个核苷酸的错配应尽可能的少。如果3’末端的错配过多，反应几乎注定要失败。 • 引物3’末端的另一个问题是防止一对引物内的同源性。尤其是在3’末端不能互补。引物间的互补将导致不想要的引物双链体的出现，从而影响扩增成功。 • 寡核苷酸3′末端最后5个核苷酸的稳定性小于－9 kcal/mol 的，通常就是专一性的探针或引物。寡核苷酸3′末端越不稳定，假引发的可能性越低。 • 需要注意的是，引物3’末端应尽量避免T。实验证明，以 T结尾的引物即使与T, G或C错配仍可有效延伸。 • 3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C 富集序列区错误引发。 ⑧引物的特异性 • 引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。 • 引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。 • 特别是3’端不能出现同源。 ⑨最好学会使用design software Primer Primer 5； Oligo 6； DNA star； Vector NT； Online　design 等等。 Primer Primer 5 DNAMAN Vector NTI Suite 7 今天介绍的软件： Primer Primer 5 引物设计——正向引物、反向引物； ——引物间配对（互补）、引物内配对情况； ——引物与全序列的配对情况。获得最佳引物对 DNAMAN DNA序列翻译；同源分析；亲疏水性分析；图谱绘制（限制性位点、片段元件成分等）。 Vector NTI Suite 7 系统分析软件：序列输入同源分析比较图谱绘制（需要提供序列） GOOD Christmas day GOOD Christmas day GOOD Christmas day GOOD Christmas day GOOD Christmas day GOOD Christmas day GOOD Christmas day GOOD Christmas day GOOD Christmas day GOOD Christmas day mer: An abbreviated form of the word oligomer reserved for special use. It is always preceded by the length of the oligomer. For example an oligomer that is 25 nucleotides long can be referred to as a 25-mer. An oligomer that is 17 nucleotides long is referred to as a 17-mer.

                    本文档为【引物设计的原则】，请使用软件OFFICE或WPS软件打开。作品中的文字与图均可以修改和编辑，
                    图片更改请在作品中右键图片并更换，文字修改请直接点击文字进行修改，也可以新增和删除文档中的内容。 
 该文档来自用户分享，如有侵权行为请发邮件ishare@vip.sina.com联系网站客服，我们会及时删除。

                    [版权声明] 本站所有资料为用户分享产生，若发现您的权利被侵害，请联系客服邮件isharekefu@iask.cn，我们尽快处理。

                    本作品所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权，请谨慎使用。

                    网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽..)目的在于配合国家政策宣传，仅限个人学习分享使用，禁止用于任何广告和商用目的。
                

下载需要：免费已有0 人下载

立即下载

引物设计的原则

你可能还喜欢