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开 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 报告 南昌大学医学院 科研型硕士学位研究生 开题报告 课题研究开题报告ppt课题开题报告格式污水处理厂开题报告研究生开题报告酒店vi设计开题报告 书 课题名称：​​​​​​​ 学科专业： 研 究 生： 导 师： 教授 起止时间： 开题日期： 研究生部 二----年----月 一、立题依据 1、选题的目的和意义 原发性肝癌严重威胁我国民众的健康，早期诊断与早期治疗是目前改善肝癌患者预后最有效的手段。原发性肝癌( primary liver cancer，PLC)是源于肝细胞或肝内胆管细胞的癌变，在世界消化系统恶性肿瘤中其死亡率列第三位，在国内列第二位，但在全球肝癌发病率中，我国是第一位[1]。近年来，肝癌防治有了长足的进步，但临床疗效仍不够理想。国内多中心大样本的资料统计显示[2]，包括早期肝癌在内的住院肝癌患者的5年生存率也只有32.5%，而占据相当比例的晚期肝癌1年生存率只有14.7%，3年生存率为0.3%，5年生存率为0，中位生存时间仅6个月。早期肝癌患者不管是手术治疗，还是其他疗法，都有较好的疗效，1、3、5 年生存率分别达到93.5 %、70.1 %和59.1 %[1]。因此，早期诊断与早期治疗是目前改善肝癌患者预后最有效的手段，探索与建立有效的早期肝癌的诊断 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 具有十分重要的意义。 肝癌标志物检测新技术的研究与应用对于肝癌的早期诊断具有重要意义，指数式扩增配体的系统进化技术在建立敏感而特异的肝癌标志物检测新技术中前景诱人。目前肝癌的定性诊断依赖血清标志物检测，定位诊断依赖影像学检查[3]。影像学诊断肝癌后，还需要检测肝癌血清标志物进一步印证，至于像影学诊断困难的小肝癌，标志物检测几乎是唯一的手段。目前尚无一种标志物检测能诊断所有肝癌，特别是早期肝癌。因此，寻找并建立敏感而特异的肝癌血清标志物检测新技术具有重要意义。指数式扩增配体的系统进化技术（Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）是一项新的组合化学技术，用于从库容巨大的单链随机寡核苷酸文库中筛选能与生物靶分子特异性结合的寡核苷酸（称为核酸适配子）。与传统的抗体相比，核酸适配子的靶分子更广泛，与靶分子结合的亲和力更大、特异性更好，性质更稳定，制备更简单，无批间差异，用于生物标志物检测前景十分诱人[4]。采用SELEX技术，筛选出肝癌标志物特异的核酸适配子，在此基础上建立高度敏感和特异的肝癌标志物检测新技术，将为肝癌，特别是早期肝癌的定性诊断开辟全新的途径，对于提高肝癌的诊断与治疗水平将发挥重要作用。 2、国内外研究现状 （1）肝癌血清标志物 现有的肝癌血清标志物在诊断肝癌，特别是早期肝癌的敏感性和/或特异性方面尚不能令人满意。AFP仍是目前肝癌定性诊断最广泛、最重要的指标[5]。尽管如此，AFP诊断肝癌有其不足：① 30%～40%的肝癌患者AFP 阴性，而小肝癌患者AFP阳性率不足40%[6]，非病毒感染引起的肝癌患者阳性率更低[8]；② 需除外由生殖系或其他可引起AFP升高的肿瘤；③ 30%左右的慢性肝炎、肝硬化也可有低浓度的AFP升高，而肝癌患者不少也表现为持续的低浓度升高，两者难以鉴别。维生素K缺乏或拮抗诱导蛋白II（PIVKA-II），也称异常凝血酶原，是独立于AFP的肝癌血清标志物，但其阳性率较低。国外学者报道PIVKA-II诊断肝细胞癌的敏感性为78%，假阳性率16%[7]。γ-谷氨酰转肽酶同工酶Ⅱ( GGT-Ⅱ)是另种肝癌标志物，用于肝癌的诊断敏感性可达70%左右，有10%左右的假阳性率[9]。上述3种经典的肝癌血清标志物是目前应用于临床的主要肝癌定性诊断标志物，但在敏感性和特异性方面均不够理想。 Glypican-3是一种新的肝癌标志物，在早期肝癌和分化较好的肝癌中其敏感性均优于AFP。据新近的文献报道，Glypican-3可表达于肝细胞癌、大肠癌、甲状腺癌等癌组织中[10,11]，而Llovet等[12]证实在早期肝癌组织中，Glypican-3表达率100%，其他良性肝病和正常肝组织中表达率为0；在AFP常为阴性的高分化肝癌及小肝癌患者检出率也较高[13]。因此，Glypican-3是一个具有良好潜在应用价值的早期肝癌诊断指标。Glypican-3属硫酸类肝素多糖蛋白，存在于细胞膜上，是一种胚胎蛋白。胞膜上的Glypican-3蛋白在358位与359位氨基酸之间发生自发性切割后，其N端分泌到血清中而成为可溶性Glypican-3，因而可以作为肝癌的血清标志物[14]。目前报道的血清Glypican-3检测采用免疫学方法，诊断肝癌的敏感性并不十分理想，阳性率不高[6,15]。本研究采用SELEX技术筛查Glypican-3的高度特异的核酸适配子，借助核酸适配子用于检测比抗体更为敏感的优势，建立比现有方法更敏感的检测新技术，将提高Glypican-3诊断肝癌尤其是早期肝癌的敏感性。 （2）SELEX技术与核酸适配子 SELEX技术是一项新的组合化学技术，它利用体外化学合成大容量的随机寡核苷酸文库与靶分子相互作用，从中筛选出与靶分子特异结合的寡核苷酸，并结合PCR体外扩增技术，使其达到指数级富集，最终进化成为高亲和力、高特异性的寡核苷酸适配子。SELEX技术的出现，为生物界、医药界提供了一种全新的检测手段，且经近20年的发展，SELEX技术已进入了较成熟的阶段。 核酸适配子靶分子广，其丰富的立体构象几乎可与自然界存在的所有类型的分子结合。当寡核苷酸的随机区域的长度为30个核苷酸左右，文库的容量能达到1014-15。单链寡核苷酸的一个独特表现是容易形成各种形状的二级结构和三级结构，如发卡、口袋、假结、G四聚体等，这些结构热力学上非常稳定。多达1014以上的随机寡核苷酸几乎涵盖了所有可能的立体构象，可与自然界存在的几乎所有种类的分子特异性结合。目前，SELEX技术筛选的靶分子包括核酸结合蛋白（如HIV-1 Rev蛋白）、非核酸结合蛋白（如各种细胞因子）、小分子有机物（如氨基酸）、金属离子、染料、完整的细胞、病毒、孢子等。 核酸适配子特异性强，亲和力大，优于抗体甚至天然配基。核酸适配子只识别与其互补的空间结构，且适配子经多次筛选获得，更保证了其与靶分子间的高特异性和高亲和力，几乎可以完全避免非特异性结合。核酸适配子与靶分子结合的解离常数( Kd) 可以达到纳摩，甚至皮摩水平，且能够分辨出靶分子结构上细微的差别，比如相差一个甲基或一个羟基，或D/L镜像体之间的区别等，具有比抗体或其他类型配基更高的亲和力和特异性。例如，茶碱与其他黄嘌呤类似物咖啡因、可可碱的结构非常相似，茶碱单抗与后二者均有交叉反应，而核酸适配子只特异结合茶碱，与其他两种物质无明显反应，与茶碱的亲和力比咖啡因高10 000倍。 核酸适配子与抗体相比，技术上有许多优势。SELEX技术为体外筛选，不需经过体内（细胞及动物）系统，特性可根据要求而改变；筛选出的核酸适配子由体外合成，在质量、数量和时间上有保证；可以在合成时精确、定点、随意连接上其他功能基团和分子，如荧光素、生物素及酶等；寡核苷酸适配子变性与复性可逆，且速度快，可反复使用、长期保存和室温运输；不受被检蛋白的免疫原性强弱的限制。 （3）核酸适配子与疾病诊断 核酸适配子除应用于基础研究、药物筛选外，在人类疾病的临床诊断与治疗等方面也显示出良好的应用前景[16]。Xu等[17]证明用核酸适配子检测细胞因子其敏感性和特异性均高于ELISA法，且相对检测范围更广；McCauley等[18]研制出核酸适配子型生物传感器阵列，能特异且定量检测出与血清或细胞提取物混合的3种肿瘤标记物，敏感性与特异性俱佳；Kazunori等[19]筛选到的两种DNA适配子与VEGF-165高度亲和，达nmol浓度，且不与其结构极其相似的VEGF-121结合，这为某些肿瘤的诊断提供了新的重要手段。 本研究拟采用SELEX技术，筛选Glypican-3特异性核酸适配子，在此基础上采用实时荧光定量PCR技术，定量检测各种肝病患者的血清Glypican-3水平，探讨其对早期肝癌的诊断价值，为早期肝癌的定性诊断的开展全新的途径。 参考文献： 1.​ 刘厚钰. 原发性肝癌. 人民卫生出版社, 2005, 450. 2.​ 杨秉辉, 夏景林, 黄力文, 等. 我国肝癌“临床相”30年的变迁──原发性肝癌3250例的对比研究. 中华医学杂志, 2003, 83(12):1053-1057. 3.​ 杨秉辉. 原发性肝癌的诊断: 从临床到亚临床. 中华消化杂志, 2003, 23(6):325- 326. 4.​ Bowser MT. SELEX: just another separation? Analyst. 2005,130(2):128-30. 5.​ Yao DF, Dong ZZ, Yao M. Specific molecular markers in hepatocellular carcinoma. Hepatobiliary Pancreat Dis Int. 2007 Jun;6(3):241-7. 6.​ 周伟, 郭霞, 曹志刚, 等. 血清Glypican-3检测在肝癌诊断中的临床意义. 肿瘤,2007,27(9):679-682. 7.​ Beale G, Chattopadhyay D, Gray J, et al. AFP, PIVKAII, GP3, SCCA-1 and follisatin as surveillance biomarkers for hepatocellular cancer in non-alcoholic and alcoholic fatty liver disease. BMC Cancer. 2008 Jul 18;8:200. 8.​ Murugavel KG, Mathews S, Javanthi V, et al. Alpha-fetoprotein as a tumor marker in hepatocellular carcinoma: investigations in south Indian subjects with hepatotropic virus and aflatoxin etiologies. Int J Infect Dis. 2008 Nov;12(6): e71-6. 9.​ 倪润洲, 黄介飞, 张沛云, 等. 单抗免疫酶斑点法检测GGT-II在肝癌诊断中的价值. 癌症, 2004,23(1):66-68. 10.​ 袁东红, 孟存英, 刘杰, 等. Glypican-3在多种肿瘤中的表达. 细胞与分子免疫学杂志, 2008,24(5). 11.​ Yamanaka K, Ito Y, Miyoshi E, et al. Immunohistochemical study of Glypican3 in thyroid cancer. 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Nucleic Acids Symp Ser(Oxf). 2007;( 51):399-400. 二、研究内容、研究目标和拟解决的关键问题 1、研究内容 （1）筛查Glypican-3的核酸适配子：采用SELEX技术，以纯化的Glypican-3蛋白为靶标，筛查出一组特异性核酸适配子。 （2）制备单一的核酸适配子：采用单链构象多态性（SSCP）分析技术，对筛选出的核酸适配子进行20%的聚丙烯酰胺凝胶电泳，逐一切下主要条带进行洗脱并PCR扩增，制备一组单一适配子文库。 （3）分析各核酸适配子的亲和力：采用实时荧光定量PCR定量测定各适配子与Glypican-3蛋白结合的程度，并比较各适配子亲和力大小。 （4）分析各核酸适配子的特异性：采用实时荧光定量PCR定量测定各适配子与各种肝病患者血清及献血员血清的结合程度，并比较各适配子特异性的强弱。 （5）分析核酸适配子对早期肝癌的诊断价值：选择特异性强、亲和力大的核酸适配子与各种肝病患者及正常对照（献血员）的血清混合反应，采用实时荧光定量PCR分别定量检测其中的Glypican-3水平，计算单一和组合适配子检测Glypican-3诊断早期肝癌的敏感度、特异度和诊断符合率。 2、研究目标 筛选出与Glypican-3蛋白结合特异性强、亲和力大的核酸适配子，建立起以核酸适配子为基础的血清Glypican-3水平实时荧光定量PCR检测新方法，为早期肝癌的诊断建立一种敏感而特异的新技术。 3、拟解决的关键问题 （1）SELEX筛选效率低的问题：SELEX技术的问题之一是筛选效果较低，可能筛不到理想的适配子。为此，本研究设计寡核苷酸的随机区为40个核苷酸，以保证文库容量足够大（理论上可达1024种随机核苷酸）。 （2）在核酸适配子群中找出理想的适配子的问题： SELEX所筛到适配子有多种不同的单链随机寡核苷酸组成，常用克隆分离后测定适配子与靶分子的亲和力来找出理想的适配子，存在工作量大、费用高的问题。为此，本研究引入简单的SSCP分析技术分离各种适配子，寻找理想的适配子。 （3）核酸适配子的价值鉴定问题：所筛选的适配子必须经过验证，证明具有临床实用价值，才有必要作进一步的克隆、测序、构象分析等这些后续研究，否则大量人力、物力被浪费。为此，本项目应用血清标本直接鉴定所筛选适配子的临床实用价值，节约人力、物力，也为后续有选择性深入分析核酸适配子提供了基础。 三、 拟采取的研究方法、技术路线、实验 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 及可行性分析 （一）研究方法 采用导师所带领的课题组已建立的一套适配子筛选、分离、鉴定和定量PCR检测技术。 （二）技术路线和步骤 （1）单链随机寡核苷酸文库及引物的合成：沿用以往本课题组所设计的文库及引物，由生物试剂公司合成，上游引物5’端标记生物素。 （2）SELEX筛选：将2mmol的单链随机寡核苷酸文库与结合缓冲液混合，加入Glypican-3蛋白，37℃孵育40min。然后硝酸纤维素膜过滤，用冲洗缓冲液洗去未结合的单链随机寡核苷酸，再用洗脱缓冲液洗脱下与Glypican-3蛋白结合的单链随机寡核苷酸，经酚/氯仿抽提、乙醇沉淀，溶于TE缓冲液，紫外分光法测定其浓度。 （3）亚文库的制备：采用不对称PCR扩增上述洗脱的单链随机寡核苷酸，上游引物与下游引物的浓度比为20∶1，循环30次。将PCR产物与链亲和素包被的磁珠进行作用，3’端带有生物素的双链PCR产物与磁珠结合，再用0.15mol/L的NaOH使之解链，带有生物素的一条链留在磁珠上，而不带生物素的另一条链解离出来，经酚/氯仿抽提、乙醇沉淀，溶于TE缓冲液，测定其浓度，作为下一轮SELEX筛选文库。 （4）SELEX筛选的终止：重复上述第2、3步，并计算每轮筛选单链随机寡核苷酸与靶分子的结合率（结合率=洗脱的寡核苷酸量/投入筛选的寡核苷酸量×100%），当连续3轮筛选结合率不再提高时终止筛选。PCR扩增最后一轮筛选后的随机寡核苷酸，即为核酸适配子群文库。 （5）PCR-SSCP技术制备单一适配子文库：稀释适配子文库，进行对称PCR扩增，产物与变性缓冲液混合后直接进行20%的聚丙烯酰胺凝胶电泳，溴化乙锭染色，并逐一切下主要条带进行洗脱与PCR扩增，产物送生物试剂公司测序，序列与设计文库相符者为适配子，合成备用。 （6）核酸适配子的特异性分析：将各单一适配子分别与牛血清蛋白和Glypican-3蛋白混合，37℃孵育40min，使适配子与靶分子充分结合，然后硝酸纤维素膜过滤，结合缓冲液充分洗涤，将滤膜剪碎置小离心管内，加热洗脱结合核酸作为模板进行实时荧光定量PCR定量检测，比较各适配子的检出量，与牛血清蛋白结合越少特异性越好。 （7）核酸适配子的亲和力分析：将各单一适配子与梯度Glypican-3蛋白在结合缓冲液中混合，37℃孵育40min，使适配子与靶分子充分结合，然后硝酸纤维素膜过滤，结合缓冲液充分洗涤，将滤膜剪碎置小离心管内，加热洗脱结合核酸作为模板进行实时荧光定量PCR定量检测，比较各适配子的检出量，计算Kd值。 （8）核酸适配子对肝癌诊断价值的分析：选择特异性强、亲和力大的核酸适配子分别与110例肝病患者或献血员的血清逐一混合（早期肝癌20例、进展期肝癌30例、慢性肝炎20例、肝硬化20例、献血员20例），温育，硝酸纤维素膜过滤，充分洗涤，将滤膜剪碎置小离心管内，加热洗脱，抽提核酸适配子作为模板进行实时荧光定量PCR定量检测，以受试者工作特征（ROC）曲线分析结果，计算出核酸适配子诊断早期肝癌的敏感性、特异性和诊断符合率。 四、统计学处理 临床样本结合率采用方差分析，统计指标以x±s表示，p<0.05有统计学意义；作受试者工作特征曲线（ROC），初步确定诊断HCC的结合率临界值，并计算特异性、敏感性、诊断符合率、阳性预测值和阴性预测值。以上统计分析均采用SPSS12.0软件包完成。 五、可行性分析 1、选题可行：肝癌发病率及病死率均居恶性肿瘤前列，唯有早期诊断、早期治疗方能改善其预后。目前肝癌的定性诊断主要依赖血清标志物检测，但现有肝癌血清标志物的单一或联合检测诊断肝癌，特别是早期肝癌，存在敏感性低或特异性差或效率低等问题，不能很好地满足临床需要，探索敏感而特异的肝癌血清标志物检测新技术，开辟新的诊断途径，是亟待解决的问题。 2、实验技术可行：SELEX技术自诞生起，技术上不断完善和成熟，本课题组已建立起一套适配子筛选、分离、鉴定和应用技术。单链随机寡核酸文库巨大的库容、丰富的构象为筛选到特异性强、亲和力大的核酸适配子奠定了客观基础；在基础研究、药物筛选、临床检测中的成功应用，其实际可行性得到证实。本研究选用稳定性好的DNA文库而非RNA文库，降低了实验操作的要求，更具临床应用价值。 六、 本项目创新点及特色 1、以SELEX技术筛选Glypican-3的核酸适配子未见报道：登录http://www.ncbi.nlm.nih.gov/，选择PubMed数据库，以“Glypican-3 and SELEX”、“Glypican-3 and aptamer”为检索词，均未检索到任何文献。 2、适配子数据库中未检索到Glypican-3适配子的记录：由The Elington Lab建立的适配子数据库（http://aptamer.icmb.utexas.edu.）中收集了1990~2006年公开发表的SELEX筛得的适配子，免费向公众开放，在“Target name”中输入检索词“Glypican”或“hepatocellular carcinoma”均未检出任何记录，而以“liver cancer”为检索词只得一篇关于用核酸适配子筛选老鼠肝脏X受体的文献（X受体是调节体内胆固醇水平的核激素受体）。 七、时间进度 时间 研究内容 2008.12~2009.01 1.​ 合成单链寡核苷酸文库及引物； 1.​ 完成适配子的筛选。 2009.01~2009.04 1.​ 制备单一适配子文库； 1.​ 分析各适配子的特异性； 1.​ 分析各适配子的亲和力； 1.​ 撰写初步研究 论文 政研论文下载论文大学下载论文大学下载关于长拳的论文浙大论文封面下载 。 2009.05~2009.09 1.​ 收集各种肝病患者及献血员的血清； 1.​ 鉴定适配子对肝癌的诊断价值； 1.​ 总结分析，撰写论文。 八、预期结果 筛选出肝癌血清标志物Glypican-3的核酸适配子，其特异性强、亲和力大，初步建立起一项敏感而特异的肝癌实验诊断新技术。 九、经费预算及来源 经费预算共计来源于研究生课题经费以及导师的科研经费 支 出 项 金额（万元） 支 出 说 明 SELEX筛选费 2.8 购买PCR试剂、合成随机寡核苷酸文库及PCR引物、等 一般试剂费 0.2 购买电泳试剂及其他试剂 实验器材费 0.4 购买吸头、PCR管、分离磁珠、滤膜等实验消耗材料 核酸测序费 0.3 用于所分离适配子的测序 论文资料、答辩费 0.3 包括论文发表、文印等 其它费用 0.1 难以预计的费用 合计 4.1