巴氏毕赤酵母表达系统的特点及其研究进展

巴氏毕赤酵母 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达系统的特点及其研究进展 Ξ 隋少飞1 ,2 　陈松林1 (1中国水产科学研究院黄海水产研究所 ,青岛　266071 ;2中国海洋大学 ,青岛　266003) 摘 　要 : 　巴氏毕赤酵母表达系统具有真核生物表达的特点。本文综述了巴氏毕赤酵母菌及其表达载体的特 点以及外源基因在该系统中表达存在的一些问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 。 关键词 : 　巴氏毕赤酵母 　外源蛋白 　载体 　表达 Recent Advances and Character of Methylotrophic Yeast Pichia pastoris Expression System Sui Shaofei1 ,2 　Chen Songlin1 ( 1 Yellow Sea Fisheries Research Instit ute , Chinese Academy of Fishery Science , Qingdao 　266071 ; 2Ocean U niversity of China , Qingdao 　266003) Abstract : 　Pichia pastoris expression system is one of the eukaryotic expression systems which was widely applied and developed fast in recent years. Expression of the methanol inducible genes , expression vector , expression stains are re2 viewed in this paper. Key words : 　Pichia pastoris 　Foreign protein 　Vector 　Expression 　　酵母是生产真核异源蛋白的宿主菌 ,易于遗传 操作 ,兼有原核生物生长特性及真核蛋白的翻译后 加工修饰特点。酿酒酵母首先作为异源蛋白基因表 达系统并加以应用。酿酒酵母并非表达外源基因的 理想宿主菌。在众多酿酒酵母表达菌中 ,研究较为 透彻的是巴氏毕赤酵母 Pichia pastoris。近年来 ,随 着发酵方法的完备和甲醇调节型启动子的出现 ,毕 赤酵母以其独特的优势和潜力得到广泛利用。 1 　巴氏毕赤酵母在表达外源蛋白中的优点 1. 1 　以甲醇为碳源 在甲醇为主的培养基上快速生长 ,并达到很高 的浓度。其表达载体含特有的乙醇氧化酶 AOX1 基因启动子 ,能通过甲醇诱导 AOX1 调控外源基因 的表达。甲醇是醇氧化酶的诱导剂 ;而葡萄糖、乙 醇、甘油等是抑制剂。试验表明 :巴氏毕赤酵母在甲 醇为碳源的培养基上生长 ,醇氧化酶的蛋白占可溶 性蛋白的 35 % ,而生长在葡萄糖 ,乙醇或甘油培养 基上则检测不到这种酶[1 ] 。 1. 2 　高效表达 巴氏毕赤酵母生长快 ,能达到很高的细胞浓度 , 加上独具 AOXl 基因强启动子 ,是外源蛋白的理想 表达整体 ,外源蛋白表达量可达细胞总蛋白的 5 % ～40 % ,尤其是破伤风毒素蛋白的产量高达 12g/ L [2 ] 。 1. 3 　适于表达胞内或胞外外源蛋白[1 ] 1. 4 　高稳定性 插入该表达系统的外源基因不存在于自主复制 的表达载体中 ,是和表达载体一起整合到酵母染色 体上 ,随染色体一起复制和遗传 ,避免了外源基因的 丢失现象。 1. 5 　巴氏毕赤酵母能对所分泌的蛋白进行 N2、O2 糖基化修饰且糖基化程度适中 1. 6 　适应性强 ,易于处理 ,可以在廉价的非选择性 培养基中生长 ,略补充盐、维生素即可 1. 7 　可进行转录后修饰 类似高等真核生物可去除起始甲硫氨酸。避免Ξ 国家自然科学基金资助项目 (40376047) 通讯作者 :陈松林 生物技术通报 ·综述与专论·　　　　　　　　　B IO TECHNOL O G Y　BULL ETIN 　　　　　　　　2004 年第 3 期 在药物使用中引起免疫反应。此外 ,也可在 N2乙酰 化、C2甲基化和十四酰化中起作用 ,对位于膜上的细 胞进行蛋白表达有重要作用。 2 　宿主菌株 P. pastoris 属子囊菌类 ,为单倍体 ,可以作为 DNA 转化的宿主菌。这个体系以营养缺陷突变株 (缺乏组氨酸脱氢酶) 为基础 ,表达株均来源于 NR2 RL2Y 11430。现在使用较多的是 GSl15 , 另有 X233 和 KM71 也发展成为 DNA 转化的宿主菌。它们多 数具有一个或多个营养缺陷型突变 ,以利于表达载 体的转化筛选。 巴氏毕赤酵母以甲醇作为唯一的能源和碳源 , 甲醇能够迅速诱导其合成大量的乙醇氧化酶 (AOX) 。在巴氏毕赤酵母中有两个基因编码 AOX , 约占全部可溶性蛋白质的 30 %以上。AOXl 基因严 格受甲醇的诱导和调控 ,AOX2 基因与 AOXl 基因序 列 ,有 92 %的同源性 ;其编码蛋白质有 97 %的同源 性[3 ] 。AOXl 基因的编码产物在氧化过程中起重要 作用。 2. 1 　宿主菌株的类型 根据对甲醇利用的情况 , P. pastoris 可划分为 3 种表型。多数菌株含有 AOXl 和 AOX2 基因 ,在含 甲醇的培养基中生长速率与野生型类似 ,称为甲醇 利用正表型 (Mut + ) ,如 GS115 (his4) ;当 AOXl 被其 它基因取代 ,则需依赖 AOX2 ,尽管 AOX2 与 AOXl 有 97 %的同源性 ,但其甲醇代谢速度慢 ,称为甲醇利 用慢表型 ( Mut s ) , 如 KM71 ( his4 arg4 aoxlΔ: : AR G4) ;当 AOX基因全部缺失 ,则不能利用甲醇 ,称 为甲醇利用负表型 (Mut - ) ,如 MC10023 ( his4 arg4 aoxlA : :SAR G4 aox2Δ: : Phis4) 。后两者表达外源蛋 白有时优于野生株 ,且需甲醇较少。三型菌株在 AOXl 启动子调控下均可诱导异源蛋白的表达。对 这 3 种菌株的进一步改造 ,可得到其它衍生的宿主 菌 ,目前不同基因型已达 10 几种。 2. 2 　酵母细胞的培养与诱导 以甲醇诱导强启动子 AOX1 而起始基因转录这 一特性对于 P. pastoris 利用生产外源蛋白是十分重 要的。有些重组蛋白对细胞有毒性作用 ,在大容量、 高密度培养过程中 ,需要将细胞扩增阶段与表达阶 段分开。其它表达系统需极高浓度的抑制物来阻遏 表达 ,诱导前又需将之去除。对于 P. pastoris 来说 , 在生物量扩增阶段 ,只需少量的抑制物 ,通常为甘 油 ,既可以满足细胞生长又能有效抑制外源基因表 达 ;在表达阶段 ,只需让细胞耗尽剩余的甘油 ,再加 入甲醇诱导即可。这样高密度连续培养可以提高表 达量。 3 　酵母表达载体 3. 1 　载体的结构特点 用于转化适合酵母宿主细胞的表达载体均为大 肠杆菌和酵母菌的“穿梭”质粒。它是由来自酵母的 部分基因序列和细菌的部分基因序列所组成。其原 核部分主要包括可以在大肠杆菌中复制的起始序列 (Ori)和特定的抗性基因序列。这两部分主要是作 为在大肠杆菌宿主中的增殖和筛选组分。酵母部分 包括酵母转化子的筛选组分 ,主要是与宿主互补的 营养缺陷型基因序列 (如 : His4 基因序列) 或特定的 抗生素抗性基因序列 (如 :抗 zeocin 的基因序列) ,以 及编码特定蛋白的基因启动子和终止子序列。后两 者之间为多克隆位点。通常外源编码序列的第一个 A TG与 AOXl 的 A TG距离越近 ,表达效果越好。该 位点通常与大多数多克隆位点的第一个限制性酶切 位点一致。 各种质粒按实际需要可构建成具备不同功能的 载体。如为了分泌外源蛋白 ,在多克隆位点的前面 还有一段分泌信号和前导序列 ,其编码信号肽的 DNA 序列已和表达 框架 财政支出绩效评价指标框架幼儿园园本课程框架学校德育工作框架世界古代史知识框架质量保证体系框架图 一起构建到载体中 ,所以外 源蛋白在酵母分泌表达时可以使用异源信号肽或酵 母自身信号肽。有研究表明 ,自身信号肽可能要优 于异源信号肽[1 ] 。在载体中加入酿酒酵母的分泌信 号和前导肽序列 (α因子)构建分泌型载体 ,一方面可 以减轻宿主细胞的代谢负荷 ,另一方面可以减少宿 主细胞蛋白水解酶对外源蛋白质的降解。但是外源 蛋白在酵母系统中表达时选择一个合适的信号肽是 相当复杂的。 作为表达型载体 ,需要一个强启动元件 ,人们根 据不同酵母菌的研究已发现了多个可以利用的强启 动子。最早成功应用的启动子是 AOXl。对于异源 蛋白在大体积、高密度发酵罐中的培养 , P. pastoris 酵母 PAOX1得到了有效、广泛的应用。PAOX1中负责 甲醇诱导和甘油去抑制的顺式作用调控序列在 2 生物技术通报 Biotechnology 　Bulletin 　　　　　　　　　　2004 年第 3 期 942bp 的启动子片段中 (位于 AOX1 基因转录起始 位点的上游) 。 尽管许多蛋白已利用 PAOX1进行了成功表达 ,但 在某些情况下 ,该启动子仍不太恰当、方便。例如 , 在烧瓶中培养 ,甲醇易快速蒸发 ,难以检测甲醇浓 度 ,且重复添加甲醇 ,其操作也很麻烦 ;另外 ,大量甲 醇存在大容积、高密度的发酵罐中培养 ,有时可能成 为火灾的隐患 ,而且不宜于食品等蛋白生产 ,这些缺 点使 AOXl 启动子应用受限。因此 ,那些不需甲醇 诱导的启动子得到青睐 ,包括 GAP、FLDl、PEX8、 YPTl 等多种。 3. 2 　载体的类型 酵母表达系统的载体主要分为附加型和整合 型。 附加型载体由于含有来自酵母天然质粒 2μ复 制起始点序列 ,能够独立于酵母染色体外自主复制 , 拷贝数通常可达 30 以上。但是不稳定 ,在传代过程 中易丢失 ,影响重组菌的稳定性和表达量。因此 ,利 用这种质粒 ,必需通过筛选以分离稳定的整合子。 巴氏毕赤酵母表达系统所用载体为整合型载 体。整合型载体导入酵母宿主细胞后与酵母细胞染 色体基因组 DNA 整合 ,为保证蛋白生产菌株的稳定 性 ,表达载体经过不同的酶切 ,线性化后 ,整合于酵 母基因组中的 AOXl 或 HIS4 基因的位置 ,能在酵母 中稳定存在。整合的方式可以是单一交叉插入 ,亦 可双重交叉替换 ,一般来说前一种方式更容易发生 , 其表型为 Mut + (甲基营养利用型) 。双重交叉替换 时 ,表达菌中的 AOX1 基因缺失 ,迫使它们不得不依 靠转录调控弱的 AOX2 基因 ,AOX2 基因对甲醇的 代谢能力下降 ,导致菌株表型为 Mut s (甲基营养缓慢 型) 。但有时却能比野生型宿主菌表达更高水平的 外源蛋白 ,尤其是用摇瓶培养时[4 ] 。 尽管整合型载体稳定性高 ,但是基因的拷贝数 量低。许多实例都证实 ,单拷贝表达单元就足已达 到最佳的生产水平 ,特异地增加拷贝数对生产无明 显效果。然而在有些实例中 ,单拷贝整合体产生令 人失望的表达产量[1 ] ,相比之下多拷贝数表达单元 ( > 10)对高效发达却可产生令人满意的结果。多拷 贝单元可以通过整合时的重复发生得以实现。构建 含多拷贝外源基因表达盒的 P. pastoris 菌株的方法 有 : (1) 通过 SDS2PA GE、免疫印迹、菌株斑点杂交、 不断提高抗生素浓度的方法鉴定转化菌中仅占百分 之几的天然存在的多拷贝菌株。(2) 将多拷贝表达 盒插入到载体质粒中进行转化 ,或者将目的基因的 DNA 片段在体外连接成串联体后再转化酵母菌。 (3) 现在又建立了一种新的方法 : 多重转化筛选 法[5 ] 。无论天然形成 ,还是转化前人为构建的多拷 贝基因 ,在酵母生长、繁殖及发酵罐生产的选择压力 下均可稳定存在。但是在一些很少的实例中 ,增加 拷贝数对蛋白质的表达产量反而会有副作用。由此 可见 ,基因拷贝数的多少在表达中的作用是难以预 料的 ,具有实际意义的解决方法是通过检测蛋白质 的表达量来作为判断的有力依据。 3. 3 　载体的选择标志 酵母表达载体的选择标志基因不多 ,主要包括 his4、G418、urs4、zeocin、Shble 等 ;新的标志基因有 adel、arg4、ura3 等。在表达某些蛋白 (特别是复杂蛋 白)时常需多个选择标志。 4 　外源蛋白在毕赤酵母中的表达 4. 1 　异源蛋白在酵母中表达的一般步骤 异源蛋白在酵母中表达包含四个步骤 : (1) 将编 码异源蛋白的 DNA 序列克隆进含有酵母启动子和 转录终止序列的表达框中。(2) 转化及在宿主中稳 定维持此 DNA 融合产物。(3)异源蛋白在特定培养 条件下合成。(4) 异源蛋白的纯化及其与天然产物 的比较。一般而言 ,所使用的启动子必须是可调控 的 ,这样 ,可以在诱导前维持培养基以一种非表达模 式 ,从而降低了在生长阶段选择非表达突变细胞的 机会。这种不利选择通常会在异源蛋白高度表达给 细胞造成重负时 ,及异源蛋白表现毒性时发生。 4. 2 　重组蛋白的翻译后修饰 毕赤酵母具有典型高等真核生物的许多翻译后 修饰功能[6 ] 。这些功能包括信号肽的加工、蛋白质 折叠、二硫键的形成和 O2及 N2糖基化、脂类添加等。 P. pastoris 可对分泌的蛋白进行 O2连接及 N2连接 的糖基化修饰。酵母的 O2连接寡糖则由单一甘露糖 残基组成。O2糖基化的氨基酸顺序各不相同 ,在不 同宿主中 ,O2连接寡糖可加在同一蛋白的不同残基 上。 真核细胞的 N2连接糖基化均起始于内质网 ,即 32004 年第 3 期 　　　　　　　隋少飞等 :巴氏毕赤酵母表达系统的特点及其研究进展 连接在脂质上的寡糖单位 Glc3 Man9 GlcNAc2 ( Glc 为 葡萄糖 , GlcNAc 为 N2乙酰葡萄糖胺)转移至 Asn2X2 Ser/ Thr 识别序列的天冬酰胺上。随后寡糖单位被 剪切为 Man8 GlcNAc2 。此时低等与高等真核细胞的 N2连接糖基化模式开始分化。在高尔基体中 ,酵母 通过增加甘露糖外链延长 N2连接寡糖单位 ;哺乳动 物则通过剪切和加成反应 ,产生 3 种类型寡糖 ,包括 Man5～6 GlcNAc2组成的高甘露糖型 ,几种不同糖组 成的混合型 ,或由两种糖组成的杂交型。 虽然毕赤酵母分泌的外源蛋白糖基化相对较 少 ,但在某些情况下 ,毕赤酵母也会分泌高糖基化的 外源蛋白。 蛋白质分泌过程中 ,还可折叠成二硫键或构成 双体 ,或切除导肽而形成成熟肽。由于毕赤酵母自 身分泌的蛋白质量很低 ,在培养基上清中 ,重组蛋白 的比重就相对很高 ,为蛋白质纯化建立基础。 5 　应用与前景 由于该表达系统的诸多优点 ,人们越来越多地 利用它作为外源基因的表达系统来生产目的蛋白。 自 l987 年 Gregg 等首次在毕赤酵母中表达乙型肝炎 表面抗原 ( HBsAg) 以来 ,国内外已有数百种外源蛋 白获得表达。有代表性的外源蛋白已经获得高效生 产 ,例如 : (1) 疫苗抗原类 ,破伤风毒素片段 C、乙肝 表面抗原、百日咳抗原 P69、HIV21 外膜糖蛋白 gPl20、登革热病毒 E 蛋白等[2 ,7～10 ] ; (2) 细胞因子 类 ,肿瘤坏死因子 ( TNF) 、表皮生长因子、内皮素抑 制因子、巨噬细胞抑制因子、人和鼠的内因子 等[11～15 ] ; (3)蛋白酶类 ,人溶菌酶、α2葡萄糖苷酶、乙 醛氧化酶、人胃促胰酶、人肝单胺氧化酶、人胎盘碱 性磷酸酶等[16～21 ] ; (4) 蛋白类激素 ,胰岛素前体、人 绒毛膜促性腺激素等[22 ,23 ] (5) 抗体及单链抗体、受 体等生物活性蛋白[24～26 ] 。 越来越多的外源蛋白成功表达的例子证明 ,巴 氏毕赤酵母表达系统是用来表达复杂真核蛋白的一 类较为理想的表达系统 ,在基因工程产品产业化生 产中具有很好的商业前景。近年来 ,随着对该甲醇 营养酵母分子遗传学研究和认识的进一步深入和实 践经验的不断积累 ,人们已经生产出更多更好的来 自人类、动物、植物和微生物的活性蛋白 ,对整个生 命科学和人类健康产生重要影响。同时我们也相 信 ,该表达系统必将在我国 21 世纪基因工程真核表 达产品产业化、商品化进程中 ,发挥越来越大的作 用。 参 考 文 献 1 　Romanos MA , Scorer CA , Clare JJ . 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