CICIM-CU 菌种保藏规程
砂土管保藏法
砂土管保藏法是载体保藏法的一种。将培养好的微生物细胞或孢子用无菌水制成悬浮液,注入灭菌的砂
土管中混合均匀,或直接将成熟孢子刮下接种于灭菌的砂土管中,使微生物细胞或孢子吸附在砂土载上,
将管中水分抽干后熔封管口或置干燥器中于 4~6℃或室温进行保存的一种菌种保藏方法。
操作步骤如下:
1 砂土管制备
将河沙用 60 目过筛,弃去大颗粒及杂质,再用 80 目过筛,去掉细沙。用吸铁石吸去铁质,放入容器
中用 10%盐酸浸泡,如河沙中有机物较多可用 20%盐酸浸泡。24 小时后倒去盐酸,用水洗泡数次至中性,
将沙子烘干或晒干。
另取地面下 40~60cm 非耕作层贫瘠且粘性较小的土,研碎,100 目过筛,水洗至中性,烘干。
将处理后的沙、土按质量比 2∶1 混合。混匀的砂土分装入保藏管中,高度为 1cm 左右,旋松管盖,
121℃湿热灭菌 30min。
随机抽取灭菌后的砂土管若干支,无菌条件下取少许砂土至营养肉汁培养基或 PDA 培养基中。30℃培
养 24 小时,检查无微生物生长后方可使用。
2 斜面培养物的制备
3 制备菌悬液
向培养好的斜面培养物中注入 3~5mL 无菌水,洗下细胞或孢子制成菌悬液。用无菌吸管吸取菌悬液,
均匀滴入砂土管中,每管 0.2~0.5mL。放线菌和霉菌可直接挑取孢子拌入砂土管中。
4 干燥
真空抽去砂土管中水分。使用玻璃真空干燥器
5 保藏
将砂土管用火焰熔封后,存放于低温(4~6℃)干燥处保藏.每隔半年检查一次菌种存活性及纯度。或将
砂土管直接用牛皮纸或塑料纸包好,置干燥器内保存。
保藏时间 2~10 年。
6 恢复培养
无菌条件下打开砂土管,取部分砂土粒于适宜的斜面培养基上,长出菌落后再转接一次。或取砂土粒
于适宜的液体培养基中,增殖培养后再转接斜面。
7 抽样检查
每半年抽样检查一次菌种的存活情况和相关性质的稳定情况。
-70℃低温冷冻保藏
将菌种保藏在-70℃冰箱中以减缓细胞的生理活动进行冷冻的一种保藏方法。
操作步骤如下:
1 保藏管的准备
保藏管于 121℃下高压灭菌 15-20 分钟,备用。
2 保护剂的选择和准备
选用 30%甘油作为保护剂
3 微生物保藏物的准备
在最适宜的培养条件下将细胞培养至静止期或成熟期,进行纯度检查后(参见科技部自然科技资源平
台联合管理办公室文件《微生物菌种纯度检测技术规程》(试行)),与保护剂混合均匀,分装。采用较
长的毛细滴管,直接滴入安瓿管底部,注意不要溅污上部管壁,每管分装量约 0.1-0.2 毫升,若是球形安瓿
管,装量为半个球部。若是液体培养的微生物,应离心去除培养基,然后将培养物与保护剂混匀,再分装
于安瓿管中。分装安瓿管时间尽量要短,最好在 1-2 小时内分装完毕并预冻。分装时应注意在无菌条件下
操作。
4 冻结保藏
将安瓿管或塑料冻存管置于-70℃冰箱中保藏。
5 复苏方法
从冰箱中取出安瓿管或塑料冻存管,立即取少许冻结物至适宜的培养基上进行培养。
冷冻干燥保藏
1 菌株的获取
2 基本形态的描述
形态描述包括培养特征等(详见微生物菌种资源共性描述
表
关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf
及细菌菌种资源描述
规范
编程规范下载gsp规范下载钢格栅规范下载警徽规范下载建设厅规范下载
)。
3 冷冻干燥保藏技术
流程
快递问题件怎么处理流程河南自建厂房流程下载关于规范招聘需求审批流程制作流程表下载邮件下载流程设计
3.1 标签的准备
保藏菌种的标记方法,为管外侧标记
3.2 保护剂的选择和准备
保护剂:10%脱脂乳或 10%蔗糖。
(常用保护剂及制备方法见附件)
3.3 菌种的准备
3.3.1 菌液的准备
在所保藏菌种的最适培养条件下将细胞培养至对数末期,进行纯度检查后与保护剂混合均匀,分装。
纯度检查参见《微生物菌种纯度检测技术规程》。
3.3.2 用斜面培养物制备菌液
取 1~2ml 保护剂,加到试管斜面培养物上,用较长的滴管轻轻涂擦斜面,制备均匀的细胞悬液,注
意不宜泡沫过多或刺挖琼脂。然后尽快分装到试管中。
3.3.3 用液体培养物制备菌液
离心收集液体培养物中的菌体,弃去上清液,加入保护剂(每毫升培养物加 1~2ml)。将培养物与
保护剂混匀,分装试管。
3.4 预冻
将菌种放入-70℃冰箱预冻。预冻速度控制在每分钟下降 1℃,使样品冻结到-35℃~-40℃。
3.5 冷冻干燥
采用冷冻干燥机进行冷冻干燥。
将预冻后的样品迅速置于已充分预冷地冷冻干燥机样品舱内,关闭放气阀,打开真空泵开始冷冻干燥,
接近干燥完成时,适当升温(按冷冻干燥机地具体要求进行操作),确认冷冻干燥完毕后,缓慢打开放气
阀,取出样品安瓿管置于干燥器内,备用。冷冻干燥时间一般为 8~20h。
判断冷冻干燥已完成的指标:
-安瓿管内冻干物呈酥松块状或松散片状。
-真空度接近空载时的最高值。
-冷冻干燥机显示的样品温度与舱内温度接近
-蒸馏水对照管中的水分已完全挥发掉或 1%~2%氯化钴的对照管已呈深蓝色。
3.6 保藏
将试管内菌体装入菌种保藏管(制备方法见示范),低温避光保藏。
4 质量检查
保藏半年后随机抽取 10%保藏物,检查其存活率。
附件:常用保护剂及制备方法
1 常用保护剂类型及种类
1.1 酸性化合物
谷氨酸、天门冬氨酸、苹果酸等
1.2 中性化合物
葡萄糖、乳糖、蔗糖、棉子糖、山梨醇、肌醇等
1.3 高分子物质及其分解物
白蛋白、明胶、各种胨、藻类等
1.4 天然混合物
脱脂乳、血清等
1.5 其它
抗坏血酸、羟胺等
2 保护剂的制备
2.1 脱脂乳的准备
2.1.1 直接采用牛奶作为保护剂时,一般采用离心法去除上层油脂,分装后用高压法灭菌,高压法一般在
116℃灭菌 20min,取出后置于 37℃保温箱中培养 24h 做无菌检验,检验无菌后置 4℃冰箱中备用。
2.1.2 将脱脂奶粉溶于蒸馏水,浓度为 20%(W/V),然后 116℃高温灭菌 15~20min。灭菌后于 37
℃培养 24h,检查是否灭菌彻底,检验无菌后置 4℃冰箱备用。
2.1.3
江南大学中国高校工业微生物资源和信息中心
2006 年 8 月 29 日