维生素A、D、E的检测

中华人民共和国国家标准 GB 5413.9—2010 中华人民共和国卫生部 发布 2010-03-26 发布 2010-06-01 实施 食品安全国家标准 婴幼儿食品和乳品中维生素 A、D、E 的 测定 National food safety standard Determination of vitamin A, D, E in foods for infants and young children, milk and milk products GB 5413.9—2010 I 前 言 本标准代替GB/T 5413.9-1997《婴幼儿配方食品和乳粉 维生素A、D、E的测定》。 本标准与GB/T 5413.9-1997相比，主要变化如下： ——抗氧化剂由原来的焦性没食子酸改为抗坏血酸； ——将处理方法中的加热回流改为恒温皂化操作； ——增加了标准溶液的校正； ——将原有的单点定量改为标准曲线法； ——增加了维生素D回收率的测定； ——将计算公式进行修改。 本标准附录A为 规范 编程规范下载gsp规范下载钢格栅规范下载警徽规范下载建设厅规范下载 性附录，附录B为资料性附录。 本标准所代替标准的历次版本发布情况为： ——GB 5413-1985、GB/T 5413.9-1997。 GB 5413.9—2010 1 食品安全国家标准 婴幼儿食品和乳品中维生素 A、D、E 的测定 1 范围 本标准规定了婴幼儿食品和乳品中维生素A、D、E的测定方法。 本标准适用于婴幼儿食品和乳品中维生素A、D、E的测定。 2 规范性引用文件 本标准中引用的文件对于本标准的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本 适用于本标准。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本标准。 3 原理 试样皂化后，经石油醚萃取，维生素A、E用反相色谱法分离，外标法定量；维生素D用正相色谱 法净化后，反相色谱法分离，外标法定量。 4 试剂和材料 除非另有规定，本方法所用试剂均为分析纯或以上规格，水为GB/T 6682规定的一级水。 4.1 α-淀粉酶：酶活力≥1.5 U/mg。 4.2 无水硫酸钠。 4.3 异丙醇：色谱纯。 4.4 乙醇：色谱纯。 4.5 氢氧化钾水溶液：称取固体氢氧化钾 250 g，加入 200 mL 水溶解。 4.6 石油醚：沸程 30 ℃～60 ℃。 4.7 甲醇：色谱纯。 4.8 正己烷：色谱纯。 4.9 环己烷：色谱纯。 4.10 维生素 C 的乙醇溶液（15 g/L）。 4.11 维生素 A、D、E 标准溶液 4.11.1 维生素 A 标准储备液（视黄醇）（100 μg/mL）：精确称取 10 mg 的维生素 A 标准品，用乙醇 （4.4）溶解并定容于 100 mL 棕色容量瓶中。 GB 5413.9—2010 2 4.11.2 维生素 E 标准储备液（α-生育酚）（500 μg/mL）：精确称取 50 mg 的维生素 E 标准品，用乙 醇（4.4）溶解并定容于 100 mL 棕色容量瓶中。 4.11.3 维生素 D2 标准储备液（100 μg/mL）：精确称取 10 mg 的维生素 D2 标准品，用乙醇（4.4）溶 解并定容于 100 mL 棕色容量瓶中。 4.11.4 维生素 D3标准储备液（100 μg/mL）：精确称取 10 mg 的维生素 D3 标准品，用乙醇（4.4）溶 解并定容于 100 mL 棕色容量瓶中。 注：维生素A、D、E标准储备液均须-10℃以下避光储存。标准工作液临用前配制。标准储备溶液用前需校正，见附 录A。 5 仪器和设备 5.1 高效液相色谱仪，带紫外检测器。 5.2 旋转蒸发器。 5.3 恒温磁力搅拌器：20 ℃～80 ℃。 5.4 氮吹仪。 5.5 离心机：转速≥5000 转/分钟。 5.6 培养箱：60 ℃±2 ℃。 5.7 天平：感量为 0.1 mg。 6 分析步骤 6.1 试样处理 6.1.1 含淀粉的试样 称取混合均匀的固体试样约5 g或液体试样约50 g（精确到0.1 mg）于250 mL三角瓶中，加入l g α- 淀粉酶（4.1），固体试样需用约50 mL 45 ℃～50 ℃的水使其溶解，混合均匀后充氮，盖上瓶塞，置于 60 ℃±2 ℃培养箱（5.6）内培养30 min。 6.1.2 不含淀粉的试样 称取混合均匀的固体试样约10 g或液体试样约50 g（精确到0.1 mg）于250 mL三角瓶中，固体试样 需用约50 mL 45 ℃～50 ℃水使其溶解，混合均匀。 6.2 测定维生素 D 的试样需要同时做回收率实验。 6.3 待测液的制备 6.3.1 皂化：于上述处理的试样溶液中加入约 100 mL 维生素 C 的乙醇溶液（4.10），充分混匀后加 25 mL 氢氧化钾水溶液（4.5）混匀，放入磁力搅拌棒，充氮排出空气，盖上胶塞。1000 mL 的烧杯中加 入约 300 mL 的水，将烧杯放在恒温磁力搅拌器（5.3）上，当水温控制在 53 ℃ ±2 ℃时，将三角瓶放入 烧杯中，磁力搅拌皂化约 45 min 后，取出立刻冷却到室温。 6.3.2 提取：用少量的水将皂化液全部转入 500 mL 分液漏斗中，加入 100 mL 石油醚（4.6），轻轻摇 动，排气后盖好瓶塞，室温下振荡约 10 min 后静置分层，将水相转入另一 500 mL 分液漏斗中，按上述 方法进行第二次萃取。合并醚液，用水洗至近中性。醚液通过无水硫酸钠过滤脱水，滤液收入 500 mL GB 5413.9—2010 3 圆底烧瓶中，于旋转蒸发器上在 40 ℃±2 ℃充氮条件下蒸至近干（绝不允许蒸干）。残渣用石油醚转移 至 10 mL 容量瓶中，定容。 6.3.3 从上述容量瓶中准确移取 2.0 mL 石油醚溶液放入试管 A 中，再准确移取 7.0 mL 石油醚溶液放 入另一试管 B 中，将试管置于 40 ℃±2 ℃的氮吹仪（5.4）中，将试管 A 和 B 中的石油醚吹干。向试管 A 中加 5.0 mL 甲醇（4.7），振荡溶解残渣。向试管 B 中加 2.0 mL 正己烷（4.8），振荡溶解残渣。再 将试管 A 和试管 B 以不低于 5000 转/分钟的速度离心 10 min，取出静置至室温后待测。A 管用来测定 维生素 A、E，B 管用来测定维生素 D。 6.4 测定 6.4.1 维生素 A、E的测定 6.4.1.1 色谱参考条件 色谱柱：C18柱，250 mm ×4.6 mm，5 μm，或具同等性能的色谱柱。 流动相：甲醇（4.7）。 流速：1.0 mL/min。 检测波长：维生素A：325 nm；维生素E：294 nm。 柱温：35 ℃±1 ℃。 进样量：20 μL。 6.4.1.2 维生素 A、E 标准曲线的绘制 分别准确吸取维生素 A 标准储备液（4.11.1）0.50 mL、1.00 mL、1.50 mL、2.00 mL、2.50 mL 于 50 mL 棕色容量瓶中，用乙醇定容至刻度混匀。此标准系列工作液浓度分别为 1.00 μg/mL、2.00 μg/mL、 3.00 μg/mL、4.00 μg/mL、5.00 μg/mL。 分别准确吸取维生素 E 标准储备液（4.11.2）1.00 mL、2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL、5.00 mL 于 50 mL 棕色容量瓶中，用乙醇定容至刻度混匀。此标准系列工作液浓度分别为 10.0 μg/mL、20.0 μg/mL、 30.0 μg/mL、40.0 μg/mL、50.0 μg/mL。 分别将维生素 A、E 标准工作液注入液相色谱仪中（色谱图参见附录 B），得到峰高(或峰面积)。 以峰高(或峰面积)为纵坐标，以维生素 A、E 标准工作液浓度为横坐标分别绘制维生素 A、E 标准曲线。 6.4.1.3 维生素 A、E 试样的测定 将试液（6.3.3中A管）注入液相色谱仪中，得到峰高(或峰面积)，根据各自标准曲线得到待测溶液 中维生素A、E的浓度。 6.4.2 维生素 D 的测定 6.4.2.1 维生素 D 待测液的净化 6.4.2.1.1 色谱参考条件。 色谱柱：硅胶柱，150 mm ×4.6 mm，或具同等性能的色谱柱。 流动相：环己烷（4.9）与正己烷（4.8）按体积比1：1混合，并按体积分数0.8 %加入异丙醇（4.3）。 流速：1 mL/min。 波长：264 nm。 柱温：35 ℃ ±1 ℃。 进样体积：500 μL。 6.4.2.1.2 取约0.5 mL维生素D3标准储备液（4.11.4）于10 mL具塞试管中，在40 ℃±2 ℃的氮吹仪（5.4） 上吹干。残渣用5 mL正己烷振荡溶解。取该溶液50 μL注入液相色谱仪中测定，确定维生素D保留时间。 然后将500 μL待测液（6.3.3中B管）注入液相色谱仪中，根据维生素D标准溶液保留时间收集维生素D 馏分于试管C中。将试管C置于40 ℃±2 ℃条件下的氮吹仪中吹干，取出准确加入1.0 mL甲醇（4.7），残 渣振荡溶解，即为维生素D测定液。 GB 5413.9—2010 4 6.4.2.2 维生素 D 测定液的测定 6.4.2.2.1 参考色谱条件 色谱柱：C18柱，250 mm ×4.6 mm，5μm，或具同等性能的色谱柱。 流动相：甲醇（4.7）。 流速：1 mL/min。 检测波长：264 nm。 柱温：35 ℃ ±1 ℃。 进样量：100 μL。 6.4.2.2.2 标准曲线的绘制 分别准确吸取维生素 D2（或 D3）标准储备液（4.11.3、4.11.4）0.20 mL、0.40 mL、0.60 mL、0.80 mL、 1.00 mL 于 100 棕色容量瓶中，用乙醇定容至刻度混匀。此标准系列工作液浓度分别为 0.200 μg/mL、 0.400 μg/mL、0.600 μg/mL、0.800 μg/mL、1.000 μg/mL。 分别将维生素 D2（或 D3）标准工作液注入液相色谱仪中，得到峰高（或峰面积)，参见附录 B。以 峰高(或峰面积)为纵坐标，以维生素 D2（或 D3）标准工作液浓度为横坐标分别绘制标准曲线。 6.4.2.2.3 维生素 D 试样的测定 吸取维生素D测定液（6.4.2.1中C管）100 μL注入液相色谱仪中（色谱图参见附录B），得到峰高（或 峰面积），根据标准曲线得到维生素D测定液中维生素D2（或D3）的浓度。 维生素 D 回收率测定结果记为回收率校正因子 f，代入测定结果计算公式（2），对维生素 D 含量 测定结果进行校正。 7 分析结果的表述 7.1 维生素 A 含量的计算 维生素 A 含量按（1）计算： m cX s 10052/10 ×××= ……………………………………………… ………………（1） 式中： X——试样中维生素A的含量，单位为微克每百克（μg/100 g）； C——从标准曲线得到的维生素 A 待测液的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）； m ——试样的质量，单位为克（g）。 注：1 μg 视黄醇 = 3.33 IU 维生素 A。 以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。 7.2 维生素 D 含量的计算 维生素 D 含量按（2）计算： fm cX s × ××××= 100227/10 …………………………………………………………（2） 式中： X——试样中维生素D2（或D3）的含量，单位为微克每百克（μg/100 g）； cs——从标线得到的维生素 D2（或 D3）待测液的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）； m ——试样的质量，单位为克（g）； GB 5413.9—2010 5 f ——回收率校正因子。 注： 试样中维生素 D 的含量以维生素 D2和 D3的含量总和计。 以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。 7.3 维生素 E 含量 维生素 E 含量按（3）计算： 1000 10052/10 × ×××= m cX s ………………………………………………………（3） 式中： X——试样中维生素E（α-生育酚）的含量，单位为毫克每百克（ mg/100 g）； cs——从标准曲线得到的维生素 E 待测液的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）； m——试样的质量，单位为克（g）。 以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。 8 精密度 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值，维生素A、E不得超过算术平均值的5%，维 生素D不得超过算术平均值的10 %。 9 其他 本标准检出限：维生素 A 为 1 µg/100 g、维生素 E 为 10.00 µg/100 g、维生素 D 为 0.20 µg/100 g。 GB 5413.9—2010 6 附录 A （规范性附录） 标准溶液浓度校正方法 维生素A、D、E标准储备液配制后需要进行校正，具体操作如下： 分别取维生素A、D、E标准储备液若干微升，分别注入至含有3.00 mL乙醇的比色皿中，根据给定 波长测定各维生素的吸光值，按表A.1给定的条件进行测定，通过下列公式计算出该维生素的浓度。 表A.1 各维生素吸光值的测定条件 标准品 加入标准储备液的量 （μL） 比吸光系数 %1cmE 波长 λ（nm） 视黄醇（A） V 1835 325 α-生育酚（E） V 71 294 麦角钙化甾醇（D2） V 485 264 胆钙化醇（D3） V 462 264 浓度计算按式(4)： C = E A × 310 00.3 100 1 −×× V …………………………………………………………(4) 式中： C ——维生素A、D、E浓度，单位为克每毫升（g/mL）； A——维生素A、D、E的平均紫外吸光值； V——加入标准储备液的量，单位为微升（μL）； E——A、D、E维生素1 %比色光系数； 310 00.3 −×V ——标准储备液稀释倍数。 GB 5413.9—2010 7 附录 B （资料性附录） 标准品液相色谱图 B.1 维生素 A、E、D3、D2标准品液相色谱图 维生素 A、E、D3、D2 标准品液相色谱图见图 B.1～图 B.4。 AU 0.000 0.005 0.010 0.015 0.020 0.025 0.030 分钟 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00 15.00 16.00 17.00 维生 素A - 5. 15 8 图 B.1 维生素A标准品液相色谱图 AU 0.000 0.002 0.004 0.006 0.008 0.010 0.012 0.014 0.016 0.018 分钟 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00 15.00 16.00 维生 素E - 14 .0 59 图 B.2 维生素 E 标准品液相色谱图 GB 5413.9—2010 8 AU -0.0008 -0.0006 -0.0004 -0.0002 0.0000 0.0002 0.0004 0.0006 0.0008 0.0010 0.0012 0.0014 0.0016 0.0018 分钟 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00 15.00 16.00 维生 素D 3 - 1 1. 48 6 图 B.3 维生素D3标准品液相色谱图 AU 0.0000 0.0002 0.0004 0.0006 0.0008 0.0010 0.0012 0.0014 0.0016 0.0018 0.0020 0.0022 0.0024 0.0026 0.0028 0.0030 0.0032 分钟 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00 15.00 维 生 素 D 2 - 1 0. 38 4 图 B.4 维生素 D2标准品液相色谱图