IL_2免疫靶向脂质体的制备及稳定性研究

重庆医科大学学报2008年第33卷第8期 (JournalofChongqingMedicalUniversity2008.Vol.33No.8) 肝移植手术后,IL-2与IL-2受体(IL-2R)高表 达,两者结合并刺激T细胞克隆增殖是引发急性排 斥反应(Acuterejection,AR)的关键环节。抑制IL-2 产生及其与 IL-2R结合的措施均可干预急性排斥 反应。然而临床上应用的大多数抑制药物由于无选 择性,抑制过度或不足对患者都十分不利。 IL-2免疫脂质体是一种新型的靶向药物递送 载体[1](Drugdeliverysystem,DDS),利用该 DDS载 药,进入体内与 IL-2R靶向结合,竞争性抑制自分 泌IL-2与受体的结合,能有效干扰T细胞的活化和 增殖,从而预防或降低急性排斥反应的发生率。本 文就IL-2免疫脂质体的制备方法及稳定性进行了 探讨,成功制备结合率高、稳定性好的 IL-2免疫脂 质体,为下一步进行细胞学及动物实验奠定了良好 基础,同时也为进一步发展靶向DDS提供了实验数 据。 1 材料和方法 1.1 材料 蛋黄卵磷脂(上海试剂公司);胆固醇(广州天马试剂公 司);IL-2(PREROTECH);25%的戊二醛(上海生工试剂公 司);十一醛(上海晶纯试剂公司);吐温 -80(重庆川东化工 有限公司);磷脂酰乙醇胺;(4-马来酰亚胺苯基丁酸酯)-磷 脂酰乙醇胺(4-(p-maleimidophenylbutyrylphosphatidylethan- olamine,MPB-PE);琥珀酰亚胺 -S-乙酰硫代乙酸酯(Suc- cinimidylS-acetylthioacetate,SATA);SepharoseCM 聚糖凝 胶均购于美国 SIGMA公司;Bradford蛋白浓度测定试剂盒 (海门市碧云天生物技术研究所);其余试剂均为分析纯。真 空旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);KQ2200B型超声波 清洗器(昆山市超声仪器有限公司);318MC酶标仪(上海精 密仪器仪表有限公司)。 1.2 方法 1.2.1 戊二醛交联法制备 IL-2免疫脂质体 将适量卵磷 IL-2免疫靶向脂质体的制备及稳定性研究 朱 莉,胡春梅,赵俊义,潘黎军,王 驰 (重庆医科大学药学院药剂教研室,重庆 400016) 【摘 要】目的:寻求一种简便、快速、结合率高的制备白介素 -2(Interleukin-2,IL-2)免疫脂质体的方法。方法:分别用戊二醛 法、十一醛法、衍生化法制备IL-2免疫脂质体。对上述几种制备方法进行分析比较,Bradford比色法测定IL-2的结合效率;离心 加速实验考察脂质体稳定性。结果:十一醛法通过席夫碱一对一的结合IL-2和脂质体,不会引起IL-2、脂质体自身相互交联, 结合率高,稳定性好。结论:拟采用十一醛法作为后期细胞实验中IL-2免疫脂质体的制备方法。 【关键词】IL-2;免疫脂质体;制备;结合率;稳定性 【中图分类号】R392.33；R943 【文献标识码】A 【收稿日期】2007-11-13 PreparationofIL-2conjugatedimmunoliposomesandstudyonitsstability ZHULi,etal (DepartmentofPharmaceutics,CollegeofPharmacy,ChongqingMedicalUniversity) 【Abstract】Objective:TosearchforasimpleandrapidmethodofpreparatingtheIL-2conjugatedimmunoliposomeswithhigh conjugaterate.Methods:TheIL-2conjugatedimmunoliposomeswerepreparedbyGlutaraldhyde,UndecanalorDerivatization.All methodswereanalyzedandcompared.TheconjugaterateofIL-2wasdeterminedbyBradfordAssay.Centrifugalacceleration experimentservedtoprovetheliposomestability.Results:IL-2conjugatedliposomebyshiff’sbasethroughUndecanaldidn’t causeIL-2-selforliposme-selfinter-crosslink,andconjugateratewashighandstabilitywasgood.Conclution:Undecanalis suggestedtopreparetheIL-2conjugatedimmunoliposomesfortheanaphasecellexperiment. 【Keywords】IL-2;Immunoliposome;Preparation;Conjugaterate;Stability 作者介绍:朱 莉(1981- ),女,硕士, 研究方向:靶向制剂 通讯作者：王 驰,男,副教授,E-mail:Wchi639@163.com。 文章编号:0253-3626(2008)08-1000-03论 著 1000— — 重庆医科大学学报2008年第33卷第8期 (JournalofChongqingMedicalUniversity2008.Vol.33No.8) 脂、磷脂酰乙醇胺、胆固醇、吐温 -80溶于氯仿当中,采用逆 向蒸发法制备空白脂质体。取空白脂质体1.0ml加入25%的 戊二醛 20μl,室温静置 2h,过量的戊二醛经透析去除,透析 时间2h。加入0.1mg/ml的IL-2溶液,4℃放置24h。2×104r/min 转速下,4℃离心30min,重复洗涤离心2次分离游离的IL-2, 收集沉淀脂质体重悬于Tris-HCl缓冲液中,置4℃冰箱保存[2]。 1.2.2 十一醛法制备 IL-2免疫脂质体 将适量十一醛(磷 脂胆碱 /十一醛质量比为 15∶1),卵磷脂,胆固醇,吐温 -80 溶于氯仿当中,采用逆向蒸发法制备十一醛脂质体。取1.0ml 该脂质体加入0.1mg/ml的IL-2溶液,4℃过夜。过Sepherose CM柱,收集脂质体部分,置4℃冰箱保存[3]。 1.2.3 衍生化法制备 IL-2免疫脂质体 制备含 MPB-PE的 脂质体:取适量 MPB-PE、卵磷脂、胆固醇、吐温 -80溶于氯 仿中,采用逆向蒸发法制备 MPB-PE脂质体。SATA修饰 IL-2:将 IL-2与 SATA溶于二甲基甲酰胺(IL-2与 SATA的 摩尔比和体积比分别为 1∶20,1∶100),25℃下反应 25min, 未反应的 SATA通过透析去除[4]。制备 IL-2免疫脂质体:将 SATA-IL-2加入 1.0ml含 MPB-PE的脂质体中(脂质与 IL-2 的摩尔比为290∶1),充氮气,4℃下反应过夜。过Sepherose CM柱,收集脂质体部分,置4℃冰箱保存。 1.2.4 IL-2活性检测 IL-2标准曲线的绘制:用Bradford比 色法 [5]制备 IL-2标准曲线,得标准曲线方程 y=0.018 5x×0.0325,r=0.9991(n=3),表明在 0.001~0.1mg/ml的浓 度范围内,线性关系良好。免疫脂质体中IL-2的检测:3种方 法制备的 IL-2免疫脂质体各取一份,用 Bradford比色法测 定样本吸光度,根据IL-2标准曲线算出各样本中IL-2浓度。 1.2.5 IL-2免疫脂质体稳定性考察 将样品于(4±2)℃,相 对湿度(75±5)%条件下放置 1、2、3、4、5、6周观察有无分 层、凝聚等现象。并采用离心加速试验[6],测定脂质体中 IL-2 离心前后吸光度的变化。根据公式KE=(A。-A)/A。计算稳 定性参数 KE(A0:离心前脂质体中 IL-2的吸光度值,A:离心 后脂质体中 IL-2的吸光度值),KE值越小,IL-2免疫脂质体 越稳定。 2 结 果 2.1 不同制备方法的比较 本实验对戊二醛法、十一醛法和衍生化法制备 IL-2免疫脂质体进行了比较。以戊二醛法制备IL-2 免疫脂质体时,随着戊二醛浓度的增加IL-2偶联效 率也不断提高。但如果戊二醛浓度过大,会引起脂 质体,IL-2自身相互交联,还会破坏脂质体的形态[7]。 选用一定浓度的戊二醛(1ml脂质体加25%的戊二醛 20μl)可取得相对满意的效果。十一醛法采用一定比 例的磷脂胆碱/十一醛制备脂质体,使脂质体表面获 得功能性的醛基,可直接与IL-2中的氨基形成席夫 碱而交联,这样可完全避免脂质体,IL-2自身相互交 联。衍生化法先用SATA对IL-2进行修饰,这样IL-2 就能直接和脂质体上的MPB-PE结合,可通过调节 MPB-PE的量来调节IL-2的量。 2.2 不同制备方法的IL-2结合率(见表1) 2.3 稳定性考察结果 十一醛法和衍生化法制备的 IL-2脂质体于 (4±2)℃放置 1、2、3、4、5、6周后均未见分层、凝聚 等现象,仍为均匀混悬液,稳定性良好;而戊二醛法 制备的IL-2脂质体于第4周出现白色絮状漂浮物, 且随时间延长而增多,但轻轻摇晃又可重新混悬。各 图1 衍生化法制备IL-2免疫脂质体 方法 结合脂质体的IL-2(mg/ml) IL-2结合率 戊二醛法 0.012 19.7% 十一醛法 0.037 57.6% 衍生化法 0.042 59.2% 表1 不同制备方法的IL-2结合率（n=3） 图2 3种方法制备的IL-2免疫脂质体稳定考察结果（n=3） KE time(周) 1001— — 重庆医科大学学报2008年第33卷第8期 (JournalofChongqingMedicalUniversity2008.Vol.33No.8) 完善,更具有实时性、实用性、真实性、新颖性,也能 够使用户更加方便地检索信息。此外,如何与现有 的HIS或LIS系统集成,实现实时自动提示警告,更 好地为临床服务,也需要进一步探索。 参 考 文 献 [1] 贺 勇,涂植光.药物对实验室检验项目的干扰[J].国外医学 临床生物化学与检验学分册,2003;24(2):122-123. 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