GB 18089-2000-T 蓝舌病微量血清中和试验及病毒分离和鉴定方法

GB/'r 18089-2000 前 言 蓝舌病(BLU)是一种绵羊、牛、山羊等反当动物的严重传染病，可通过检测血清中抗体的存在，确 定动物是否感染本病。按国际上通常的 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 ，琼脂免疫扩散试验和酶联免疫吸附试验用于蓝舌病的定 性，血清中和试验用于蓝舌病的定型。 本 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 根据国际常用的方法和我国多年的实践，采用鸡胚静脉接种是最为敏感、实用的病毒分离方 法 蓝R病病毒分离物可通过免疫荧光试验进行定性鉴定;用病毒中和试验进行定型鉴定。 本标准是在参考美国、澳大利亚实验室的检测规程和总结我国在这一领域多年研究和实践 经验 班主任工作经验交流宣传工作经验交流材料优秀班主任经验交流小学课改经验典型材料房地产总经理管理经验 的 基础上制定。 本标准的附录A是标准的附录 本标准由农业部提出。 本标准起草单位:中华人民共和国昆明出入境检验检疫局。 本标准主要起草人:石世匡、张晓丁、徐自忠、徐维加、周晓黎。 中华人民共和国国家标准 蓝舌病微量血清中和 试验及病毒分离和鉴定方法 GB/T 18089---2000 Micro-serum neutralization test,virus isolation and identification for Gluetongue 1 范围 本标准规定了蓝舌病微量血清中和试验及病毒分离和鉴定方法 本标准适用干动物感染蓝舌病病毒后中和抗体的检测及病毒分离和鉴定 2 引用标准 「列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版本均 为有效。所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。 GB/T 6682 --1992 分析实验室用水规格和试验方法(eqv ISO 3696:1987) 3 缩略语 3. 1 CPF致细胞病变作用。 3. 2 TCIn 半数组织培养感染量。 3.3 BLP乳糖蛋自陈缓冲肉汤。 3.4 SPF无特定病原体 4 原理 4.1 血清中和试验原理 特异性的血清中和抗体与病毒结合后，能使病毒失去对敏感细胞的感染能力，从而阻止病毒的繁 殖。这一反应不但表现为一种病毒只能被相应的免疫血清所中和，而且还表现在中和一定量的病毒，必 须有一定效价的免疫血清。中和试验以测定病毒的感染力为基础，必须选用对病毒敏感的细胞、动物或 鸡胚为实验 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 ，中和抗体滴度的判定以比较病毒受免疫血清中和后的残存感染力为依据。蓝舌病病毒 感染动物后，7夭左右出现中和抗体，中和抗体具有高度的型特异性，因此，可通过中和试验对蓝舌病病 毒进行定型鉴定。 4.2 病毒分离及鉴定原理 动物感染蓝舌病病毒后4天左右出现病毒血症，羊的病毒血症持续a周左右，牛的病毒血症待续8 周左右，病毒主要存在于动物的红细胞内.并能从精液排毒。在动物病毒血症期，可从其血液、精液和脏 器分离到病毒〔.用特异性荧光抗体做直接免疫荧光试验可对分离毒进行定性鉴定，用已知标准阳性血清 做病毒中和试验可对分离毒进行定型鉴定 国家质量技术监督局2000一叫一26批准 2000门0一01实施 GB/T 18089-2000 5 试剂和材料 本标准所用水应符合GB/T 6682中三级水(三蒸水)的规格。 本标准所用试剂配方见附录A(标准的附录) 下列试剂除特殊规定外，均指分析纯试剂。 5.1 病毒:蓝舌病病毒1-24血清型国际标准毒株，由国际兽疫局蓝舌病参考实验室提供。 5. 2 对照血清:蓝舌病标准阳性血清、阴性血清，由国际兽疫局蓝舌病参考实验室提供或者按国际兽疫 局规定的方法制备及认定 53 被检血清。 5.4 细胞:Csi, BHKz,或Vero 5. 5 培养液:199培养基中加10%无蓝舌病病毒抗体的胎牛血清(经56'C , 30 min灭能)，含青霉素200 IU/ml、链霉素200 Ixg/mI 5.6 维持液和稀释液:199培养基中加2%无蓝舌病病毒抗体的胎牛血清，含青霉素200工U /ml、链霉 素200 vg/mL, 5.7 细胞分散液、液体石蜡、乳糖蛋白陈缓冲肉汤((BLP)、 R酸缓冲甘油、0. 01 mol/L PBS(pH=7. 2), 5. 8 荧光标记的蓝舌病病毒抗体。 5.9 10.11 H龄SPF鸡胚。 :，; 器械和设备 鸡胚开孔器、照蛋箱或照蛋灯、乳钵或组织捣碎器、擦镜纸 超声波裂解器、倒置显微镜、荧光显微镜 微型振荡器、二氧化碳培养箱、孵化器、冰箱(-20'C保存 血清，一70 C保存种毒)。 6. 3 96孔组织培养板，单头和多头微量移液器(20^-200 1A)及滴头 7 蓝舌病微t血清中和试验 7. 1 病毒繁殖 将蓝舌病病毒1一24 (BLU V 1一24)血清型分别接种BHK,,或Ver。细胞单层，37'C吸附1h后加入 维持液，置5%二氧化碳培养箱于37C培养，接种24 h后逐日观察。待CPE达75%以上，收获病毒培养 物，冻融1次或置冰浴中用超声波处理(40 uA,l min), 2 000 r/min离心20 min，分装小瓶，每瓶1 ml， 置一70C保存备用。 了2 毒价测定 将各型病毒在96孔板上作101-10-11稀释，每个稀释度作8孔，每孔病毒悬液为50川，加入细胞 悬液100川(3X10'个细胞/ml)每块板设8孔细胞对照。置5%二氧化碳培养箱于37℃培养，从72- 168 h逐日观察 记录 混凝土 养护记录下载土方回填监理旁站记录免费下载集备记录下载集备记录下载集备记录下载 CPE 按Karber方法计算出各型病毒的TCIDso/50 pLo 7. 3 试验程序 7.3.1蓝舌病标准阳性血清、阴性血清、被检血清经56'C 30 min灭能 7. 3.2 对照设立 一 细胞对照:设4孔正常细胞对照，每孔加细胞悬液100 IL (3 X 10'个细胞/ml,),稀释液 100 pI。 — 阴性对照:设4孔阴性对照，每孔加阴性血清和100 TCIDzo/50 pL病毒悬液各50川，再加入 细胞悬液100 pL(3X10‘个细胞/ml)。 -一 病毒回归对照:将各型病毒稀释成1 000,100,10,1 TCID;o/50川，每个稀释度作4孔，每孔加 人病毒悬液50 iil，再加入细胞悬液100 p,<3 X 10'个细胞/ml,)，每孔补充稀释液50 Id-, GB/T 18089-2000 一阳性对照:将阳性血清分别作1 : 4,1 : 8,1 : 16稀释，每个稀释度作4孔，每孔加各稀释度阳 性血清和100 T('11),,,/50 VI病毒悬液各50 1,I，再加入细胞悬液100 1,L (3 X 105个细胞/ml) 血清毒性对照 每份被检血清须按稀释度各设 一孔毒性对照.每孔加各稀释度血清50 1,L,稀 释液50川 和细胞悬液100川.(3X10"个细胞/ml) 7.4 中和试验 7.4. 1 将疮份被检血清作1:4,1:8,1:16稀释，每个稀释度作5个孔，每孔加各稀释度血清50 1,I 7.4.2 第1孔作为血清毒性对照，加入稀释液50 1,I和细胞悬液 第2-4孔为正式试验孔，每孔加入病毒悬液50 1,1,(100 100 1,I, (3 X 10'个细胞/ml) 7.4. 3 TCID;O/50 1,L)，振荡3一5 mm;置 37〔中和1 h,加细胞悬液1001,1,(3X10'个细胞/ml) 7.4.4 置5Y, 7. 5 结果判定 氧化碳培养箱于37 C培养7天 24 h后逐日观察CPE并进行记录。 当病毒对照在100^-300TCIDs?/50川一出现CPE,阳性、阴性、正常细胞、血清毒性对照全部成立 时，才能进行判定。判定时间为72^ 168 h被检血清孔50%出现保护判为阳性，低于50%判为阴性。当 某份血清的某 一稀释度出现5000或50%以上保护时，该血清稀释度即为该份血清的中和抗体滴度。当 中和抗体滴度乒1:8时判为阳性。 试验结果记录: 出现("PE记为:十; 无(一PE记为:一。 8 蓝舌病病毒分离 8.1 样品 肝素抗凝血(每5m工血液用1。工U肝素)、脏器(脾、肝、’肾、淋巴结)、精液、库嚎。用于病毒分离的 样品须置冷藏容器保存，在24h内送到实验室，并立即进行处理 8门.1 血液样品制备 取肝素杭凝血5 m工，用PBS洗涤血样3-4次，每次2 000 r/min离心10 min，弃上清液后加入倍 量BLP,置冰浴中用超声波处理((40 uA,I min)后，经处理的样品当天使用，使用前置4〔保存，剩余样 品置-70 C保存备用。 8.1.2 组织样品制备 无菌采集动物脾、淋巴结、肝、肾各5 g,剪碎后加入BIT 10 ml(含青霉素2 000 IU/m工、链霉素 2 000 p.g/ml.),置乳钵中研磨，置4'C冰箱浸提4h，取上清液5 ml用超声波裂解处理(100 uA, I 2 min)或冻融二次，3 000 r/min离心20 min，取上清液使用，使用前置4C保存，剩余样品置-70'C保存 备用。 8.1.3 精液样品制备 取精液样品I m工，取0. 5 m工用BIT作1:5稀释后，3 000 r/min低温离心20 min，弃 匕清液，再 用BLP作1，5稀释，充分混匀，置冰浴中用超声波处理(100 uA,l^ 2 min), 3 000 r/min离心20 min, 取卜清液使用，使用前置4〔保存，剩余样品置一70 C保存备用。 8.1.4 库嵘样品制备 取200-300个库蝶盛于小试管中，加入含青霉素2 000 IU/ml、链霉素2 000 pg/ml的BLP 3- Sm工J，粉冰浴中研磨虫体，3 000 r/min离心20 min,取上清液使用，使用前置4C保存，剩余样品置 一70 C保存备用。 R一9 AHF静脉接种 8. 2. 1 选择10-一 11日龄发育良好的SPF鸡胚，在照蛋灯卜标记静脉位置和开孔区，用开孔器开窗备 用。 cB/T 18089-2000 8.2.2 在无菌条件下，每份样品接种5个鸡胚，每个鸡胚接种。. 1 ml -，接种后用擦镜纸封口，W.33. 5c 培养 8.2.3 逐日观察并记录,48 h内死亡的鸡胚为非特异性死亡，将48 h后死亡的鸡胚收置4 C'冰箱保 存，于接种后第6天同未死亡鸡胚一起收毒。 8.2.4 收毒 在无菌条件下，用碘酒、酒精棉球对鸡胚气室处进行消毒，凿开蛋壳，按常规方法剪破壳 膜、尿囊膜、羊膜后，取出胚体，置平皿中，在每个胚体上取若干组织块(有病变时，取病变组织)，置组织 捣碎器或乳钵中研磨后，按1:5加入BLP(含青霉素2 000几J /ml、链霉素2 000 I g/m工)，置4C冰箱 浸提4h，当口使用，剩余样品置一70'C保存备用。 8.3 接种敏感细胞盲传 8. 3.1 按常规方法制备Cais。细胞单层 8. 3. 2 将收获的鸡胚上清液，接种细胞单层.每份病料接种两管.每管接种。.1 ml，置25'C培养，第二 天换液后，培养7天 B-3.3 按常规方法制备BHK.或Ver。细胞单层。 8.3.4 第7天用吸管吹下被接种的Cfi?。细胞。 a.3 .5 将吹下的Cep,。细胞悬液接种于BHK:或Ver。细胞单层，37'C吸附1h后，加入维持液置37 C培 养，24 1:后逐日观察细胞病变，连续观察7天。 9 蓝舌病病毒鉴定 9.1 荧光抗体试验(直接法) 9.飞.1 闷珍接种的BHK?或Ver。细胞培养物冻融一次，l 000 r/min离心10 min，取上清液接种于带有 玻片的21孔组织培养板的BHK,,或Ver。细胞单层 每份样品接种两孔，同时设阳性、阴性对照，37 C吸 附Ih后加入维持液，置37℃培养72 h, 9.1.2 取{}}培养板中的玻片，用。. 01 mol/l, PBS漂洗一次，预冷丙酮固定15 min 9.1.3 侮片滴加荧光标记的蓝舌病病毒抗体，使其覆盖于玻片，置暗湿盒中于37℃作用30 min, 9.1.4 用。.0l mol/l, PBS洗片三次，再用蒸馏水洗片一次。 9.1.5 风干.用碳酸缓冲甘油封片，荧光显微镜检查。 91.6 结果判定:在阳性对照细胞浆内呈现颗粒状的黄绿色荧光，阴性对照应无荧光或无特异性荧光 时，细胞浆内发现颗粒状的黄绿色荧光者即可判为阳性 9.2 病毒中和试验 9.2.1 病毒繁殖 收获在BHK:或Ver。细胞上出现CPE的病毒悬液，复壮一代，待CPE达85%以_L. 收获病毒培养物冻融1次，2 000 r/min离心20 min，分装置一70'C保存备用。 9. 2.2 毒价测定:方法同蓝舌病微量血清中和试验 9.2.3按Karber方法计算出TCID,,o/50 1,l，用100 TCID?/50 1,I蓝舌病病毒分离毒株分别与不同血 清型的蓝舌病病毒标准阳性血清(效价不低于I:32)作微量中和试验 9. 2.4 试验在96孔组织培养板上进行，阳性血清、阴性血清经56'C 30 min灭能。各型阳性血清作 1，10稀释 9.2.5 操作步骤 9. 2. 5. 1 对照设立 一一细胞对照:设4孔正常细胞对照，每孔加细胞悬液100 1,L ( 3 X 10'个细胞/ML)、稀释液 100 1,1。 阴性对照:设4孔阴性对照 每孔加阴性血清和100 TCIDso/50月 病毒悬液各50川，再加入 细胞悬液100 1,1,(3X 105个细胞/ml)。 病毒回归对照:将被鉴定病毒稀释成1 000,100,10,1 TCID5,/50川一，每个稀释度作4孔，每孔 Gs/T 18089-2000 加入病毒悬液50川一，再加入细胞悬液100川一((3X105个细胞/m工)，补充稀释液50川。 9.2.5.2 正式试验 每个血清型作4孔，每孔加1:10稀释的阳性血清和100 TCID,S,/50川病毒各50川，振荡3一， mm，置37 0(、中和Ih，加入细胞悬液100 IA, (3 X 10'个细胞/-I)。 9.2.5.3 结果判定 按照蓝舌病微量血清中和试验方法7. 5进行判定:判定时间从72-168 h。经1:10稀释的蓝舌病 某型标准阳性血清能与病毒中和，使50%以上的细胞不出现CPE者判为阳性，即为所鉴定病毒的血清 型 GB/T 18089 - 2000 附 录 A (标准的附录) 溶 液 配 方 营养液 1”培养基 加入含10%无蓝舌病病毒抗体胎牛血清;抽滤除菌 维持液:199培养基，加入含2%无蓝舌病病毒抗体胎牛血清;抽滤除菌。 细胞分散液: 胰酶 2. 509; 乙二胺四乙酸二钠((EDTA) 0. 20 g; 无钙镁PBS 1 000 ml; 抽滤除菌 乳糖蛋自陈缓冲肉汤(BLP) 。)磷酸二氢钠(无水) 4. 60 g; 三蒸水 500 ml。 h) Ni,HPO(无水) 9. 40 g; 三蒸水 1 000 ml; 工作液: ??? ? ? ? ﹂ ? ? ? AQ a液 b液 蛋白膝 乳糖 l0磅15 min高压灭菌或抽滤除菌 A5 ().01 mot /L PBS pH7. 2-7. 4 磷酸氢二钠 磷酸二氢钠 氯化钠 蒸馏水 A6 碳酸缓冲甘油 “)。·5 mol/l, pH9. 5碳酸缓冲液 碳酸氢钠 碳酸钠(无水) 蒸馏水 b)甘油 1份碳酸缓冲液加9份甘油混合即成 220 ml 780 ml 2. 00 g ; 1009; 1. 19 g; 0. 22 g; 8.50 g; 1 000 MI ，70 g; .609; 100 ml 注:实验所用试剂除有特殊规定外，均需高压灭菌