null第七章 PCR技术 第七章 PCR技术 Polymerase Chain Reaction
聚合酶链反应PCR技术PCR技术 PCR的基本原理
PCR的类型
PCR技术的应用DNA的复制DNA的复制解旋酶null引物酶引物酶nullDNA
聚合酶DNA
聚合酶nullDNA的变性与复性变性加热PCR的基本原理PCR的基本原理 PCR是由引物介导，聚合酶催化底物，在体外进行特异DNA扩增的一种方法。
全过程分为三步：
变性
退火
延伸PCR的基本原理PCR的基本原理PCR反应体系
PCR过程
PCR的特点标准的PCR反应体系
4种dNTP混合物 各200umol/L
引物 各10～100pmol
模板
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DNA 0.1～0.2ug
Taq DNA聚合酶 2.5u
缓冲液 含Mg2+ 1.5mmol/Lnull底物各种dNTP浓度应相同（20～200 umol/L）
浓度过低，反应速度较慢
浓度过高，影响特异性null引物设计的一般原则1、引物长度以16～36b为好2、碱基随机分布3、引物自身不能含有互补序列4、两个引物之间的互补或同源碱基小于4个5、引物3’端不能错配6、引物浓度在0.1～0.5 umol/L之间。null可以是DNA，也可以是RNA
可以是粗制品模板null很强的耐热稳定性
最适温度为75～80 ℃
无3’ 5’外切核酸酶活性，错配率为1／7500
发挥活性需要Mg2+
具有反转录活性
100ul反应液中加入1～2.5uTaq聚合酶为宜
保存温度小于－20 ℃Taq DNA聚合酶nullTris-HCl缓冲液（pH7.5），稳定pH值。
MgCl2(Mg2+) ：直接影响反应的特异性和产率。缓冲液PCR的基本原理PCR的基本原理PCR反应体系
PCR过程
PCR的特点DNA模板
DNA引物
dNTP
TaqDNA聚合酶
缓冲液PCR的基本原理PCR的基本原理PCR反应体系
PCR过程
PCR的特点PCR的基本原理PCR的基本原理PCR反应体系
PCR过程
PCR的特点 普通PCR反应的过程及条件：
变性 94 ℃ 5min
变性 94 ℃ 30s
复性 45～65 ℃ 30s 25～35个循环
延伸 72 ℃ 45s～8min
最后一次延伸 72 ℃ 7min
保存 4 ℃｝PCR的基本原理PCR的基本原理PCR反应条件
PCR过程
PCR的特点模板DNAPCR的基本原理PCR的基本原理PCR反应条件
PCR过程
PCR的特点PCR的基本原理PCR的基本原理PCR反应条件
PCR过程
PCR的特点引物1引物2Taq酶Taq酶PCR的基本原理PCR的基本原理PCR反应条件
PCR过程
PCR的特点第1轮结束第2轮开始PCR的基本原理PCR的基本原理PCR反应条件
PCR过程
PCR的特点TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理PCR的基本原理PCR反应条件
PCR过程
PCR的特点第2轮结束PCR的基本原理PCR的基本原理PCR反应条件
PCR过程
PCR的特点 第4轮扩增第5轮扩增PCR的基本原理PCR的基本原理PCR反应体系
PCR过程
PCR的特点电泳分析PCR的基本原理PCR的基本原理PCR反应体系
PCR过程
PCR的特点特异性强
灵敏度高
简便、快速
对标本的纯度要求低
PCR的类型PCR的类型1、普通PCR：使用离体模板DNA
2、原位PCR：使用细胞或组织的DNA，
可定位
3、反转录PCR：从mRNA开始，以cDNA为模板
（RT-PCR）
PCR的类型PCR的类型5、巢式PCR：多对引物介导，多次扩增
6、不对称PCR:两种引物使用不同的浓度
7、彩色PCR：将引物5’端用荧光物质标记4、反向PCR：
扩增已知序列两端的未知序列
PCR的应用PCR的应用1、基础研究
直接测序
构建cDNA文库
寻找新基因
标记DNA探针
PCR的应用PCR的应用2、检测致病菌
3、疾病诊断
4、法医
5、植物遗传育种
浙公网安备 33021202002483