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免疫共沉淀 Diagenode Magnetic MeDIP Kit 中文操作手册 Kit 操作原理: Kit 组成: (MagMeDIP 48 reactions) Kit 组成: (MagMeDIP 10 reactions) 额外 DNA 纯化步骤: (DNA Elution Module 15 反应) 需额外购买 其他所需器械与材料: Step1: Binding a...

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Diagenode Magnetic MeDIP Kit 中文操作手册 Kit 操作原理: Kit 组成: (MagMeDIP 48 reactions) Kit 组成: (MagMeDIP 10 reactions) 额外 DNA 纯化步骤: (DNA Elution Module 15 反应) 需额外购买 其他所需器械与材料: Step1: Binding antibodies to hydroxymethylated DNA and bead washes 1. IP 样本配制 (不含抗体及磁珠) 2. 95oC 加热 3 分钟 3. 快速移至冰上 (冰水为佳) 冷却 4. 4oC spin down 样本至管底 5. 每个样本取出 7.5ul 做为 INPUT 样本至新的管子中  将 INPUT 样本储存于 4oC 冰箱中, 作为 control 之用 6. 将剩余的样本取 75ul 至 kit 附的 200ul 之 8 连管中, 并保存于 4oC 环境中 7. 以纯水将 MagBuffer A 1:5 稀释成 bead wash buffer, 每个 IP 样本需准备 100ul 的 bead wash buffer (MagBuffer A 1:5) 8. 以 pipette 将 bead 悬浮, 取 11ul/IP 至新管中  随时以 pipette 将磁珠保持悬浮状态  保持 bead 于 4oC 环境中操作, 并且避免磁珠干燥, 否则会影响实验结果 9. 将磁珠中多余的液体去除 两种 spin down 方式可选择:  利用磁力架吸附磁珠于管壁, 去除上清液  以 1,300 转离心 5 分钟后, 去除上清液 10. 以冰的 bead wash buffer 清洗磁珠, 方法为: 管中加入 22ul bead wash buffer 后将磁珠悬浮于 buffer 中, 1,300 转离心 5 分钟去除上清液, 一共清洗两次  随时以 pipette 将磁珠保持悬浮状态, 每个样本中磁珠加入量若差异过大, 将会使实验的再现性降低 11. 清洗 2 次后, 再用 22ul bead wash buffer 悬浮磁珠, 并将磁珠置于冰上  切勿冰冻磁珠 12. 以纯水将 1ul 抗体 1:2 稀释  稀释过后的抗体 (2ul)可以做 6 个 IP 实验 13. 取一新的管子, 置备 antibody mix, 试剂加入的次序依序为: 抗体, MagBuffer A, 水, 最后再加 MagBuffer C  请仅准备被当天所需要的 antibody mix  用剩下的抗体请丢弃  请切记稀释抗体是最关键的一个步骤 14. 将配好的 antibody mix 取 5ul 加入含 75ul IP 样本的 200ul 之 8 连管中 15. 取 20ul 磁珠加入 8 连管中 (最后每个 IP 样本体积为 100ul) 16. 4oC 培养于 40rpm 转速的样本转轮上 overnight Step2: Washes 17. 将 MagWash buffer 及磁力架置于冰上, 清洗磁珠时最好于冰上或于冷房中 操作 18. 将 8 连管从转轮上取下置于磁力架上, 静置 1 分钟后将上清液移除 19. 以 100ul 冰的 MagWash buffer 1 清洗样本, 步骤如下: 加入 buffer, 盖上管盖, 将 8 连管上下倒置使磁珠悬浮, 4oC 培养于 40rpm 转速的样本转轮上 4 分钟, 再静置于磁力架上 1 分钟后去除 buffer. 共 3 次  于处理期间, 不要扰动吸附于管壁上的磁珠  随时注意管盖上是否有残留磁珠, 若有磁珠残留需 spin down 使磁珠从管盖 上脱离 20. 以 100ul 冰的 MagWash buffer 2 清洗样本, 步骤如下: 加入 buffer, 盖上管盖, 将 8 连管上下倒置使磁珠悬浮, 4oC 培养于 40rpm 转速的样本转轮上 4 分钟, 再静置于磁力架上 1 分钟后去除 buffer. 共 1 次 21. 清洗完毕后, 用 p200 pipette 将所有 wash buffer 吸除, 并将磁珠置于冰上 Step3: DNA isolation 注: 若 IP 样本只进行 qPCR 实验, 请续接步骤 22 注: 若进行 Microarray, ChIP-seq 实验, 请接续 Elution Module protocol 步骤 1 23. 取出 INPUT 样本, spin down 后与 IP 样本同步进行以下步骤 24. 100ul DIB buffer 配置方法: 加 1ul proteinase K 到 100ul DIB buffer 中  每一 IP 样本需 100ul DIB buffer  每一 INPUT 样本需 92.5ul DIB buffer 25. 将 8 连管从磁力架上取下, 每一 IP 样本加入 100ul DIB buffer, 悬浮磁珠后将 样本移至新的 1.5ml 管中 26. 每一 INPUT 样本加入 92.5ul DIB buffer 27. 55oC 培养 IP & INPUT 样本 15 分钟 28. 再以 100oC 培养 IP & INPUT 样本 15 分钟 29. 将所有样本转移至 1.5ml 新管中 30. 4oC 14,000rpm 离心 5 分钟 31. 将上清液移至新管, 保存于-20oC, 此 DNA 可直接进行 qPCR 实验 Step4: Quantitative PCR & data analysis 32. 以 SYBR PCR Green master mix准备 qPCR master mix准备: qPCR mix (总反应体 积 25ul/反应)  水 6.50ul  Master mix (例如 SYBR PCR Green master mix) 12.5ul  Primer pair 1.00ul  IP DNA or INPUT 样本 5ul 33. 当 PCR 完成后分析果 Step5: Quantitative PCR & data interpretation 34. 基因上特定 loci 的 hydroxymethyl DNA 经免疫沉淀方法富集下来之后, 可以 利用 qPCR 的结果计算出 IP efficiency: % [meDNA-IP/Total input] 35. 计算公式 六西格玛计算公式下载结构力学静力计算公式下载重复性计算公式下载六西格玛计算公式下载年假计算公式 为: % [meDNA-IP/Total input] = 2^ {[Ct (10% input) – 3.32] – Ct (meDNA-IP)]} x 100% 此公式中的 2 是 AE (amplification efficiency); Ct (meDNA-IP) 及 Ct (10%input)则 是代表 methylated DNA 及 INPUT DNA 在 qPCR 反应在对数期呈现的 Ct 值. 3.32 则为 INPUT DNA 因稀释了 10 倍的补偿因子. 回收率 = % [meDNA-IP/Total input]
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