Diagenode Magnetic MeDIP Kit 中文操作手册
Kit 操作原理:
Kit 组成: (MagMeDIP 48 reactions)
Kit 组成: (MagMeDIP 10 reactions)
额外 DNA 纯化步骤: (DNA Elution Module 15 反应) 需额外购买
其他所需器械与材料:
Step1: Binding antibodies to hydroxymethylated DNA and bead washes
1. IP 样本配制 (不含抗体及磁珠)
2. 95oC 加热 3 分钟
3. 快速移至冰上 (冰水为佳) 冷却
4. 4oC spin down 样本至管底
5. 每个样本取出 7.5ul 做为 INPUT 样本至新的管子中
将 INPUT 样本储存于 4oC 冰箱中, 作为 control 之用
6. 将剩余的样本取 75ul 至 kit 附的 200ul 之 8 连管中, 并保存于 4oC 环境中
7. 以纯水将 MagBuffer A 1:5 稀释成 bead wash buffer, 每个 IP 样本需准备 100ul
的 bead wash buffer (MagBuffer A 1:5)
8. 以 pipette 将 bead 悬浮, 取 11ul/IP 至新管中
随时以 pipette 将磁珠保持悬浮状态
保持 bead 于 4oC 环境中操作, 并且避免磁珠干燥, 否则会影响实验结果
9. 将磁珠中多余的液体去除
两种 spin down 方式可选择:
利用磁力架吸附磁珠于管壁, 去除上清液
以 1,300 转离心 5 分钟后, 去除上清液
10. 以冰的 bead wash buffer 清洗磁珠, 方法为: 管中加入 22ul bead wash buffer
后将磁珠悬浮于 buffer 中, 1,300 转离心 5 分钟去除上清液, 一共清洗两次
随时以 pipette 将磁珠保持悬浮状态, 每个样本中磁珠加入量若差异过大,
将会使实验的再现性降低
11. 清洗 2 次后, 再用 22ul bead wash buffer 悬浮磁珠, 并将磁珠置于冰上
切勿冰冻磁珠
12. 以纯水将 1ul 抗体 1:2 稀释
稀释过后的抗体 (2ul)可以做 6 个 IP 实验
13. 取一新的管子, 置备 antibody mix, 试剂加入的次序依序为: 抗体, MagBuffer
A, 水, 最后再加 MagBuffer C
请仅准备被当天所需要的 antibody mix
用剩下的抗体请丢弃
请切记稀释抗体是最关键的一个步骤
14. 将配好的 antibody mix 取 5ul 加入含 75ul IP 样本的 200ul 之 8 连管中
15. 取 20ul 磁珠加入 8 连管中 (最后每个 IP 样本体积为 100ul)
16. 4oC 培养于 40rpm 转速的样本转轮上 overnight
Step2: Washes
17. 将 MagWash buffer 及磁力架置于冰上, 清洗磁珠时最好于冰上或于冷房中
操作
18. 将 8 连管从转轮上取下置于磁力架上, 静置 1 分钟后将上清液移除
19. 以 100ul 冰的 MagWash buffer 1 清洗样本, 步骤如下: 加入 buffer, 盖上管盖,
将 8 连管上下倒置使磁珠悬浮, 4oC 培养于 40rpm 转速的样本转轮上 4 分钟,
再静置于磁力架上 1 分钟后去除 buffer. 共 3 次
于处理期间, 不要扰动吸附于管壁上的磁珠
随时注意管盖上是否有残留磁珠, 若有磁珠残留需 spin down 使磁珠从管盖
上脱离
20. 以 100ul 冰的 MagWash buffer 2 清洗样本, 步骤如下: 加入 buffer, 盖上管盖,
将 8 连管上下倒置使磁珠悬浮, 4oC 培养于 40rpm 转速的样本转轮上 4 分钟,
再静置于磁力架上 1 分钟后去除 buffer. 共 1 次
21. 清洗完毕后, 用 p200 pipette 将所有 wash buffer 吸除, 并将磁珠置于冰上
Step3: DNA isolation
注: 若 IP 样本只进行 qPCR 实验, 请续接步骤 22
注: 若进行 Microarray, ChIP-seq 实验, 请接续 Elution Module protocol 步骤 1
23. 取出 INPUT 样本, spin down 后与 IP 样本同步进行以下步骤
24. 100ul DIB buffer 配置方法: 加 1ul proteinase K 到 100ul DIB buffer 中
每一 IP 样本需 100ul DIB buffer
每一 INPUT 样本需 92.5ul DIB buffer
25. 将 8 连管从磁力架上取下, 每一 IP 样本加入 100ul DIB buffer, 悬浮磁珠后将
样本移至新的 1.5ml 管中
26. 每一 INPUT 样本加入 92.5ul DIB buffer
27. 55oC 培养 IP & INPUT 样本 15 分钟
28. 再以 100oC 培养 IP & INPUT 样本 15 分钟
29. 将所有样本转移至 1.5ml 新管中
30. 4oC 14,000rpm 离心 5 分钟
31. 将上清液移至新管, 保存于-20oC, 此 DNA 可直接进行 qPCR 实验
Step4: Quantitative PCR & data analysis
32. 以 SYBR PCR Green master mix准备 qPCR master mix准备: qPCR mix (总反应体
积 25ul/反应)
水 6.50ul
Master mix (例如 SYBR PCR Green master mix) 12.5ul
Primer pair 1.00ul
IP DNA or INPUT 样本 5ul
33. 当 PCR 完成后分析果
Step5: Quantitative PCR & data interpretation
34. 基因上特定 loci 的 hydroxymethyl DNA 经免疫沉淀方法富集下来之后, 可以
利用 qPCR 的结果计算出 IP efficiency: % [meDNA-IP/Total input]
35.
计算公式
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为:
% [meDNA-IP/Total input] = 2^ {[Ct (10% input) – 3.32] – Ct (meDNA-IP)]} x 100%
此公式中的 2 是 AE (amplification efficiency); Ct (meDNA-IP) 及 Ct (10%input)则
是代表 methylated DNA 及 INPUT DNA 在 qPCR 反应在对数期呈现的 Ct 值. 3.32
则为 INPUT DNA 因稀释了 10 倍的补偿因子. 回收率 = % [meDNA-IP/Total input]