木质素木聚糖化学结构研究

Vol. 22, No. 4 , 2007 中 国 造 纸 学 报 Transactions of China Pulp and Paper .^};;>ss}av 二研究论文器 、cccccccc沪 木素一木聚糖轰合体化学结构的研究 杨海涛 谢益民 (山东轻工业学院山东省制浆造纸科学与技术重点实验室，山东济南，250353) 摘 要:在木聚糖存在的条件下，以木素前驱物一松柏醇葡萄糖贰作为起始物在多种酶(p-葡萄糖贰酶、葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物 酶)的协同作用下，生物合成出木素脱氢聚合物(DHP)与木聚糖的复合体(简称DHPXC)。对其进行酶降解处理除去游离的木聚糖，并 对与木素有连接的木聚糖分子链进行切短.得到水不溶部分(简称DHPXC-IS )。利用高分辨率的固体和液体13 C-NMR对分离产物进行 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 ，结果表明，在木聚糖存在下，DHP生成过程中与木聚糖之间主要以苯甲醚键和醋键的形式连接。生成的木素主要以户0-4,月担、 -5和户1为主，有一定量以a-04连接，含有少量的松柏醇/醛结构，另外还存在少量香草醛结构及a位带有亚甲基结构的苯丙烷结构和 醚化5一，结构。 关健词:DHP;木聚糖;13 C标记;13 C-NMR 中图分类号:TS71 文献标识码:A 文童编号:1000-6842(2007)04-0001-04 纤维素、半纤维素和木素是构成植物原料的主要 成分，纤维素是构成植物细胞壁的骨架物质，木素和半 纤维素的混合物填充于微细纤维之间。现已经证明， 木素和碳水化合物之间存在着化学键，形成木素和碳 水化合物的复合体[‘]，简称为LCC ( lignin carbohydrate complex) , LCC中的某些连接键在碱法蒸煮中相当稳 定〔2-4l。因此，碱法纸浆中仍存在LCC结构，LCC的存 在阻碍制浆和漂白过程中化学药剂对木素的进一步降 解作用[51。因此，分析LCC的结构对制浆漂白技术的 发展有重要意义。 传统方法分析木素及LCC的结构一般采用物理 研磨和化学提取的方法，一般不可避免会使一部分分 离产物的结构发生改变，其次，分离出的样品不能代表 植物体内整体或浆料中残余木素和LCC的结构。故 从20世纪80年代开始，人们试图用’3 C-NMR分析法 研究木素结构及LCC之间的连接键，但由于木素大分 子和碳水化合物的成分相当复杂，从一般的‘3 C-NMR 图上很难分辨出木素和碳水化合物之间的连接，从而 要结合一些特殊的分析方法以确定木素和碳水化合物 两种大分子之间起架桥作用的化学键形态，并进一步 定性或定量分析木素侧链碳原子上LC键的比例。 本实验模拟植物体内木素在细胞壁中的沉积过 程，在木聚糖存在的条件下，以木素前驱物— 松柏醇 葡萄糖贰[6〕作为起始物在多种酶(18一葡萄糖贰酶、葡 萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶)的协同作用下，生物 合成出木素脱氢聚合物(DHP)与木聚糖的复合体，简 称DHPXC ;对合成出的木素一木聚糖复合体进行酶降 解处理除去游离的木聚糖，并对与木素有连接的木聚 糖进行分子链的切短，然后利用高分辨率的固体和液 体，3 C-NMR对结构进行分析。 1 实验方法 1.1松柏醇葡萄糖贰一【a一 13C1的制备 按参考文献「6]的方法，合成木素的前驱物松柏 醇葡萄糖贰{。一，3c,3。 1. 2 DHPXC的制备 将溶解在0. 2 mol/L醋酸钠/醋酸缓冲溶液(PH 值5. 0, 100mL)中的松柏醇-13-D-葡萄糖贰(1. 5g)溶 液滴加到溶有辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶和/6-葡 萄糖贰酶的木聚糖胶体溶液中，加完后，将体系保持在 室温下反应10 d。反应结束后离心分离，沉淀部分用 水清洗数次，真空干燥，得DHPXC。用二氯乙烷/乙醇 (2:1，体积比)混合液在搅拌下充分洗涤所得DHPXC, 以除去游离的DHP，而后将其放人8 mol/L尿素的硼 酸/硼砂缓冲液(PH值8.8，约30mL)中，通过48 h的 搅拌和离心分离进一步除去游离DHP和残余酶蛋白 收稿日期:2007-03-26(修改稿) 本课题获国家自然科学基金(30471365)，教育部博士点基金(20020561022)以及山东省中青年科学家奖励基金(04BS05005)的资助。 作者简介:杨海涛，男;博士;主要从事植物纤维资源化学的研究。 E-mail: yanghaitaao@ sohu. com 万方数据 中 国 造 纸 学 报 第22卷 第4期 质，而后用去离子水充分洗涤得精制DHPXC备用。 1. 3 DHPXC的酶降解处理 将木聚糖酶(鲁中协牌，30000U/g)溶解到含 90mL蒸馏水中，溶液经过G3砂芯漏斗过滤以除去水 不溶物，然后稀释至130mL备用。 将130mL上述酶溶液加到已干燥的DHPXC (a- 气标记和未标记样品各0. 7 g)中，而后将试样置入 50℃振荡水浴中水解24 h。反应结束后，离心分离，得 到水溶解部分和水不溶解部分，其中水不溶解部分以 DHPXC-IS记，干燥备用。 1.4 高分辨率固体"C-NMR分析 采用带固体探头的VARIAN Infinityplus-400型核 磁共振仪，并用常规交叉极化(CP)和魔角旋转(MAS ) 法在100. 5 MH:下对样品(DHPXC)进行‘3C连续扫描 得到’3 C-NMR谱图。实验条件:室温，转速7. OkHz，接 触时间3. Oms，接受时间50. 0 N,s，扫描宽度25. OkHz, 脉冲迟滞2. Os，扫描次数4331次。 1.5液体，3C -NMR分析 将样品(DHPXC-IS )溶于DMSO-d6中，用币5 mm 的试样管在150. 9MH:观测频率下，采用BRUKER ad- vance-600核磁共振仪上进行碳谱扫描，约10000次。 实验条件:温度50T，扫描范围S二0-200，脉冲迟滞 时间I.758, 基结构中C，的共振信号，由峰的强度可知，经过酶反 应及多次洗涤后，产物中还含有一定量的木糖。 且--J一--上--曰‘- 且 ~J.J 一 -J--曰‘--土--书 】 月 月一一」一 一一一」L一 ， . 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 6 图1 DHPXC的CP/MAS'3 C-NMR图 表1 DfIPXC的CP/MAS '3 C-NMR谱图分析 峰 号 化学位移占 DHPXC-Copt. DHPXC-[。一，3C] 官能团归属 151.8 152.9 G结构中的f'3和C4，松 伯醛a-C 2 147.3 147.9 3 144.6 145 131.9 131.7 G结构中的C3 "C4和Cs, 阿魏酸a-C 松柏醇结构a-C, G结构 中与具有HC =C结构的 C。相连的C, 5 102 102.5 木糖基的C, 不明显 2 结果与讨论 2.1 DHPXC的固体，3 C-NMR分析 图1为不带标记DHPXC和侧链a位带”C标记 的DHPXC的CP/MAS '3 C-NMR谱图，表1为其所含 结构单元所对应的化学位移和官能团归属。为了便于 分析，以化学位移S二55.9处的甲氧基峰为基准来对 谱图中其他峰的强度进行比较。图中，#1 (S二152.9) 主要来自含松柏醛结构的a-C及愈创木基中C3和C4 共振信号的叠加，#2临=147.9)和#3临=145)均来自 愈创木基C3,C;和CS及阿魏酸结构中a-C的共振信 号的叠加，从峰的强度及标记后信号的加强，可知阿魏 酸结构在该DHP中有一定的比例，说明松柏醇在过氧 化物酶的催化作用下Y一位碳原子被氧化为竣基。通 过比较谱图DHPXC-Cont.和DHPXC-[ a-13 C ]，发现在 S二131.7("4)处有一弱信号经过”C标记后得到较大 加强，该信号被认为是松柏醇结构a-C和愈创木基中 与具有HC =C结构的C。相连的C，的共振信号的叠 加，其信号增强部分主要来自松柏醇结构中的a-C，其 增强的幅度之大说明DHPXC中含有较多的松柏醇结 构。在3二102.5处(*5)有一强的单峰，该信号为木糖 C. (AP)，与糖类有苯甲 醚键连接的C.,C邵带a- CO的,6-0-4) Ca(,G-0-4)，Ca(与碳水 化合物发生醋化)，木糖 结构的C,和C, 户1结构的C。和Ca，木 糖CSC'(-5，,0-1，Y-C- 4)，肉桂醇y-C 甲氧基 未知 11 264 26 乙酞基的一CH, 12 21.9 21.2 11 26.4 26 12 21.9 注 G指愈创木基结构。 从图1还可以看到，经过13 C标记的DHPXC谱图 中在S二86.5("6)处有一较强的增强信号，该信号来 自口尹结构中a-C、带a-CO的户0-4结构中的户C及 与糖类有苯甲醚键连接的a-C的共振信号，其增强部 分来自标记后的。-C，从而说明该物质中有相当一部 分木素侧链a位碳原子同碳水化合物(主要是木糖) 是通过醚键连接的〔7-81。另外，在5=74.8{*7)处也有 一强的共振峰，经过”C标记后该处信号有所增强，该 信号除了来自木糖结构的C3和C,的共振信号以外， 万方数据 第22卷 第4期 木素一木聚糖复合体化学结构的研究 表2 DHPXC-IS的’' C -NMR分析 峰号 化学位移占 Dl-1PXC-IS-Coat. DHPXC4S "'C 官能团归属 194.0 194.0 190.7 170.2 150.0 147.4 144 130.4 129.4 191 170.5 168 154.0 150.0 147.4 144.0 130.5 129.1 123.0 118.9 115.2 111.6 102.1 97.9 87.2 85.2 83.7 a-CO，松柏醛中的 y-CHO a-CHO 脂肪酸中的C =0 芳香酸中的C =0 松柏醛Ca G结构中的C3 /C4 G结构中的C3/C5 醚化的5-5'C4/C4' C结构中的C, 松柏醇结构Ca G结构中的C6 G结构中的CS C6 (Q-5) s结构中的C c结构中的C,/C, 木糖C, Ca (p-5) C,(口-0) 与木聚糖有苯甲醚键 连接的C.,Cp(带。-CO 的尹-0-4) Cv,s (a-0-4) ,Co俩0-4) 未知 木糖C3 Co (/3-0-4，苏型) a木糖CZ，与糖有醋键 连接的C} Ca (Q-0-4,赤型) 木糖C， C.,(脚，介1，松柏醇) C y (P-0-4) ? ? ? ?? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 相当部分来自庄0-4结构中的a-C及与碳水化合物有 酷键连接的a-C的共振信号，从信号的强度可看出该 物质中木素尽0-4结构占多数，从而再次证明滴加法 合成的木素J主要结构为户0-4结构。信号#8(S= 63.5)来自木糖Cs -18-1结构的a-C//3-C和10一结构-18- 1结构尹-0-4结构及肉桂醇结构中的y-C的共振信号 的叠加。在r3=26("11)和c6=21.2(#12)的高场处有 两微弱信号，它们来自乙酞基中甲基碳的共振信号。 2.2 DHPXC-IS '3C -NMR分析 图2为DHPXC酶降解产物中DHPXC-IS的”C- NMR图。表2为其所含结构单元对应的化学位移和 官能团归属。为便于分析，以样品中含量较稳定的甲 氧基峰(*30,5二55.8)作为对比基准。比较图2中 DHPXC-IS-font.和DHPXC-IS- '3 C谱图，可以发现经 过‘3c标记后在8二191低场处有一个十分微弱的信号 得到大幅度增强，很明显该信号来自含a-CHO的香兰 素结构。#3 (s=170.2)处为含有一coo一结构及脂肪 族乙酞基中醋类默基碳的共振信号，从吸收峰的强度 可以看出其含量很少。在S二154(#5)处的信号尖锐 而且得到加强，其加强部分主要来自松柏醛结构。-C 的共振，从该峰的强度可知松柏醛结构单元在水不溶 组分中有较高的含量。区域S二144一150与8=101- 123内的信号均来自愈创木基环上的碳原子，在带”C 标记样品的谱图中其强度大小几乎没有变化，说明在 DHPXC-IS中木素含量基本相同，其中#8 (s二144)来 自醚化5一结构的C4/C4'。共振信号#10主要来自松 柏醇结构的a-C渭-C，其信号的加强来源于同位素标 记的松柏醇结构的。-C，从图中信号强弱可知在DH- PHC-IS物质中含有大量的松柏醇结构，另外也说明了 采用滴加法制备的DHP中与a-C相接的双键含量仍 然比较多，这方面与天然木素结构有一定的差异。 从图2发现，经过‘3c,同位素标记后S二85.1- 87.8间的信号增加幅度最大，来自月一结构(`17沂二 2 3 4 5 6 7 8 9 to 11 12 13 14 15 16 17 18 19 97.9 87.8 85.1 94.0 75.6 74.2 81.1 79.6 ?5.， 74.2 72.8 ? ? ? ? ? ? ? ? ? 71.5 65.9 63.4 61.7 60.4 55.8 5心.仑 29.2 20.7 14 飞1 71.7 65.9 63.4 61.9 60.2 55.9 53.9 32.0 29.2 21 14 11 -OCH, C, ('s尹10-5) G结构中的。-CH2- G结构中的P-CH,- -CH3(乙酞基) -CH,，饱和烷基 一CH、，饱和烷基 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 注 G指愈创木基结构。 图2 DHPXC-IS的‘'C -NMR图 87.8)和PP结构(#16,5 =85. 1)的a-C得到大幅度增 加，说明/3-5结构和10-10结构在该物质结构中的含量较 大。"1R{fs =84)来自与糖类以苯甲醚键连接结构的a-C 和带a-CO的丹0-4结构的产C共振信号的叠加，从其 强度可以推知物质结构中木素与木聚糖之间有一部分 万方数据 中 国 造 纸 学 报 第22卷 第4期 3 结 论 3.1在木聚糖存在下，松柏醇葡萄糖贰能与木聚糖发 生共聚形成DHP和木聚糖的复合体(DHPXC )，通过 高分辨率的固体和液态’3 C -NMR分析，证实在木聚糖 存在下，DHP生成过程中与木聚糖之间主要以苯甲醚 键和醋键的形式连接。 3.2 DHPXC中生成的木素主要以户0-4,刀尹、口-5 和庄1为主，有一定量以a-0-4连接，含有少量的松柏 醇/醛结构，另外还存在少量香草醛结构及a位带有 亚甲基结构的苯丙烷结构和醚化5-5’结构。 参 考 文 献 [1〕 [2] 杨椒慈.植物纤维化学〔M].第三版 中国轻工业出版社，2001 张陶芸 木素聚糖复合体对黑液性质的影响【J].西南造纸， 2005,34(3) :27 刘鑫宇，蒲俊文，金小娟，等.三倍体毛白杨不同制浆方法浆中残 留木素结构的变化〔J].木材加工机械，2004(5) :9 余家莺.纸浆中残余木素的化学结构【J7.中国造纸学报，1998, 13:72 吴淑芳，尤纪雪，李忠正.木聚糖酶对马尾松KP浆漂白机理的探 索[J]纤维素科学与技术，2000,8(3):43 Yimin Xie, Danielle R Robert, Noritsugu Terashima. Selective Carbon 13 enrichment of side chain carbons of ginkgo lignin Traced场Carbon 13 Nuclear Magnetic Resonance[J〕 Plant physiol. Biochem. 1994, 32(2):234 顾瑞军，谢益民，曾绍琼，等.稻秆木素侧链的’3C同位素示踪 及固体，3 C-NMR分析[J].高等学校化学学报，2002,23(6):1073 顾瑞军，谢益民.木素一碳水化合物复合体的形成机理及化学结构 的研究(I )- 综纤维素存在下DHP的合成「J].造纸科学与 技术，2001(5) :1 ? ? ? ? ， ?? ? ?? ? ? ? ? ? ? ??? ? ? ?? ?? ?? ?? ?? ?、 ? ? ? ? ? ? ?? ? ? ? ? ? ?? ? ? ?? ? ? ? ?? ? ??? ??? ? 以苯甲醚键连接a020伍=81.1)则来自a-0-4结构“担- C和户0-4结构中户C信号重叠，其信号增强部分来自 与之对应结构中a-C的信号的增强，可以看出样品中木 素结构单元之间有一定量以a-0-4的结构形式连接。 通过对"23(8=74.2)和#25(8 =71.5)峰位的分析，进一 步确知木素结构单元之间连接的主要形式是,8-0- 4结 构，因为8 = 74. 2处为苏型户0-4结构中a-C的信号， 而8=71.5则来自赤型户0-4结构中a-C，其中以苏型 为主。"24(8=72.8)处的吸收峰来自a木糖的CZ及与 糖有醋键连接的C。信号的叠加，对比DHPXC-IS的标 记与未标记谱图可以看出，经过13c同位素标记后，该处 信号得到了一定程度的加强，说明复合物中有部分木素 与木聚糖以醋键的形式连接。 在8=60.4一63.4处的都为木素结构单元中y-C 的共振信号，通过分析可知#27为16一结构尹-1结构和 松柏醇结构中y-C信号的叠加峰，与此相对应的户0- 4结构中y-C由于其邻位C。上连有负电性氧原子导 致y-C上的电子云密度增加，致使y-C化学位移比R-5 和户1结构中的y-C要高一点，出现在8二61.7("28) 处。在DHPXC-IS-13 C中8 = 32 (#32)处看到增强的弱 信号来自愈创木基苯丙型结构的a一亚甲基，而且该类 型结构含量较低。图中8 =29以上高场信号来自木素 饱和侧链上/3-C和脂肪族酞基上的甲基。 上述结果证明在木聚糖存在下，DHP生成过程中 与木聚糖之间主要以苯甲醚键和醋键的形式连接。生 成的木素主要以尽0-4尹尹尹-5为主，有一定量以a- 0-4连接，含有少量的松柏醇/醛结构，另外还存在少 量香草醛结构及a位带有亚甲基结构的苯丙烷结构 和醚化5一’结构。 Study on the Chemical Structure of Xylan-lignin Complex YANG Hai-tao' ME Yi-min (Shandong Key Lab of Paper Science&Technology， Shandong Institute of Light Industry, Ji'nan, Shandong Province, 250353) (*E-mail: yanghaitaao@ sohu. com ) Abstract; Based on the synthesized coniferin and coniferin-[ a-" C ] which are lignin precursors, lignin aggradation process in the initial stage of cell wall development was simulated. The complex of dehydrogen polymer of ligin and xylan (DHPXC) was produced with coniferin as ligin precursor by biosynthesis process in the presence of peroxidase, glucose oxidase and /3-glucosidase. In order to raise the frequency of lignin-carbohydrate bonds, the DHPXCs were hydrolyzed with xylanase and the water-insoluble fraction(DHPXC-IS) was prepared. The "C-NMR spectrum‘DHPXC and DHPXC-IS proved DHP connects with xylan through benzyl ether linkage and ester linkage which mainly occurre at a-position. It was also proved that /3-0-4，月尹，P-5 and,6-1 are the main substructures in DHP. Moreover, there are also a few coniferyl alcohol and coniferyl aldehyde, vanillin, phenylpropane units with a-methylene and some etherified 5-5' substructure. Key words; DHP; xylan; 13C -isotopic tracer; 'sC-NMR (责任编挥:常 青) 万方数据