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双水相萃取B.ppt

双水相萃取B

长大08级生物工程班
2011-04-09 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《双水相萃取Bppt》,可适用于高等教育领域

双水相萃取双水相萃取双水相的形成双水相的形成双水相系统(aqueoustwophasesystem,ATPS)PEG=聚已二醇(polyethyleneglycol)Kpi=磷酸钾DX=葡聚糖(dextran)、Pro如何分布、影响因素、应用ATPS相图ATPS相图双节线(binodal):图中的曲线。双节线以下的区域为均相区,以上的区域为两相区即ATPS。系线(tieline):双节线上两点的直线。系线反映的信息A杠杆规则:系线上各点均为分成组成相同而体积不同的两相。两相体积近似服从杠杆规则B性质差异:系线的长度是衡量两相间相对差别的尺度,系线越长,两相间的性质差别越大反之则越小C临界点(criticalpoint):当系线长度趋于零时,两相差别消失,任何溶质在两相中的分配系数均为。如K点。双水相萃取的理论基础双水相萃取的理论基础)分配系数m)m贡献因子me、mb和ma分别为静电、疏水和亲和作用对溶质m的贡献静电作用非电解质型溶质:电中性蛋白质的m:式中,M:溶质分子量:溶质在上下两相表面自由能的差,Jmol。意义:A不受静电作用的影响(因不带电)B一般>不同溶质lnm随M而CATPS不同,同一溶质的也就不同m随ATPS不同而改变。图是不同pro在pH为各pro的pI的ATPS中的m,道南电位(,Donnanpotential)实际ATPS中有电解质,当这些离子在两相中m),将两相间产生电位差带电pro的m:意义:A荷电溶质的分配系数的对数与溶质的净电荷数成正比B由于同一ATPS中添加不同的盐产生的不同,故m与Zpro的关系因盐而异。疏水作用相间疏水因子(HF,hydrophobicfactor)PEGDX和PEGKPi等ATPS上相(PEG相)疏水性较大,相间的疏水性差用HF表示HF可通过测定疏水性已知的aa在其pI处的maa测算:RHaa相对疏水性(relativehydrophobicity)是通过测定aa在水和已醇中溶解度的差别确定的,并设疏水性最小的Gly的RH=所以,上式中的B为:mGly为Gly分配系数所以,pH=pL时aa在ATPS中的分配系数与其RH值呈线性关系,直线的斜率就是该双水相系统的HF值图为测定实例Pro表面疏水性(HFS,HFofsurface)利用上式可确定不同ATPS的HF值如在pH=pI的ATPS中,pro的m与HF值之间呈线性关系,则直线的斜率定义为该蛋白质的HFS图为蛋白质的m与HF的实测关系图。图的结果示:pro的HFS随NaCl浓度的增大而增大。将盐对pro的HF影响上式得:其中HFSsalt为盐增加而引起的HFS值增量。因此m的一般形式影响物质分配平衡的因素影响物质分配平衡的因素)成相聚合物浓度和分子量分子量M:若降低聚合物的M则pro分配于富含该聚合物的相中。如PEGDX系统若降低DX的M则m减小。这一规律具有普遍意义。成相系统的总浓度:增大时,系统远离临界点,系线长度增加,两相性质的差别(疏水性等)增大,蛋白质分子的分配系数将偏离临界点处的值(m=),即大于或小于因此,成相物质的总浓度越高,系线越长,蛋白质越容易分配于其中的某一相存在问题:当系线长度增加时,系统的表面张力增大,可能导致溶质在界面上的吸附这种现象在处理含细胞和固体微粒的料液时尤为严重,细胞或固体微粒容易集中在界面上,给萃取操作带来因难,但对于可溶性蛋白质这种界面吸附现象很少发生,一般可不考虑。)盐:图为各种离子在PEFDX系统中的m图示:HPO和HPO(HPO)离子在PEGDX系统的m小,因此利用pH>的磷酸盐buffer很容易改变,使带负电pro有较高的mHFS:盐的种类和浓度影响pro的HFS,从而影响pro的m。当盐的浓度很大时(如>moldm),由于强烈的盐析蛋白质的溶解度达到极限表现分配系数增大此时m与pro浓度有关。利用这一特点通过调节ATPS盐浓度可选择性萃取不同的pro。不良影响:改变各相中成相物质的组成和相体积比。如PEGKpi系统中上、下相(或称轻重组)的PEG和磷钾浓度。(pH–pI)value)、pHvalueAlnmpro(Z)lnmlnm(pH–pI)valueB交错分配法(crosspartitioning):当加入不同种类的盐时由于相间电位不同lnm–pH关系曲线也不一样。但在pro的pI处由于Z=m应相同即两条关系曲线交于一点。所以,通过测定不同盐类存在下lnm–pH曲线的交点,可测定蛋白质细胞器以及微粒的pI。CpH影响磷酸盐解离:即影响PEGKpi系统的相间电位和蛋白质的分配系数。对某些pro,pH的很小变化会使m改变~个数量级。)温度温度影响小,一般温度改变不影响产物的萃取。大规模操作一般在室温下进行,不需冷却。这是基于:()成相聚合物PEG对蛋白质有稳定作用,常温下蛋白质不会发生变性()常温下溶液粘度较低,容易相分离()常温操作节省冷却费用体系的选择和优化体系的选择和优化)体系选择的原则:基本公式:根据目标pro和共存杂质的HFSMpIZ等的差别,综合利用静电、疏水和添加适当种类和浓度的盐可选择性萃取目标产物。若目标产物与杂蛋白的表面疏水性HFS相差较大充分发挥盐析作用提高成相系统的浓度(系线长度)增大ATPS的HF也是选择性萃取的重要手段。改变系线长度还可以使细胞碎片选择性分配与于PEG盐系统的下相采用M较大的PEG可降低pro的m使萃取到PEG相的pro总量减少从而提高目标蛋白质的选择性。例如采用PEGKpi系统,可从细胞匀浆液中将半乳酸糖苷提纯倍,而使用低分子量PEG时,萃取的选择性降低此外,在磷酸盐存在下于pH的范围内调节pH也可提高目标产物的萃取选择性在上述理论基础上,设计合理的试验,可确定最佳萃取系统双水相萃取放大容易:一般ml离心管的实验结果可直接放大到工业规模因此,常利用多组ml刻度离心管,进行分配平衡实验具体实验步骤如下()配制一系列不同浓度、pH及离子强度的双水相,每个双水相改变一个参数其中pH通常用磷酸盐缓冲液或氨酸调节()加入料液,再加水使整个系统质量达到~g离心管封口后充分混合()在~g下离心~min,使两相完全分离()小心地用吸管或移液管将上相和下相分别吸出,测定上、下相中目标产物的浓度或生物活性,计算分配系数上、下两相中目标产物的总量应与加入量对比以检验是否存在沉淀或界面吸附现象并可确认浓度或活性测定中产生的系统误差。应用应用)蛋白质、酶的纯化)多肽的分离纯化)核酸的分离纯化)、病毒、细胞、细胞器的分离双水相萃取的优点()两相界面张力小(~mN·m)有助于强化相际间传质但同时会影响体系分相自然分相时间一般为~min()体系所需设备简单可采用原有有机溶剂萃取生产所使用的混合、离心与分离设备此外可以运用现有萃取原理按比例放大试验参数这非常适用于工业生产国外已实现了计算机控制的连续化生产()安全无毒或低毒()操作条件温和整个操作在常温常压下进行()能够运用反应–萃取耦合技术将制备过程与产物提取在双水相体系中同时进行这可以有效解决产物积聚导致产率降低的问题还可以简化工艺流程。但是传统的双水相体系粘度大不利于生产并且成本较高需要开发廉价的新型双水相系统。亲和双水相萃取体系是在成相聚合物(如PEG、葡聚糖等)上耦联特定的亲和配基。常用配基有金属亲和配基型、染料亲和配基型和生物亲和配基型。亲和双水相萃取技术的发展可以大大提高从复杂基质中提取目标产物的选择性为高纯高附加值生物活性物质的提取提供了一个有效的解决方案。聚合物–无机盐双水相体系成本相对较低体系粘度小但是该体系不适用于在高盐浓度下易失活的生物活性物质而且高盐浓度的废水不能直接排放在实际应用中受到环保限制。表面活性剂双水相体系与传统双水相体系相比具有含水量更高(可达ww)生物活性物质不易变性失活两相分离更容易成相物质用量更少且可循环利用等独特的优点是一种具有发展前景的、经济、简单的双水相体系。离子液体是一种可替代传统挥发性有机溶剂的绿色溶剂它具有良好的物理化学稳定性几乎没有蒸气压无可燃性具有溶剂和催化剂的双重功效许多有机或无机离子在其中都具有良好的溶解性可通过改变阴阳离子组合进行优化设计。将离子液体应用于双水相技术无疑会拓宽双水相体系的应用范围形成新型“绿色萃取技术”。尽管离子液体具有许多独特的性质目前和传统的有机溶剂法相比生产消耗较高但是随着离子液体生产成本下降该技术将逐步满足工业需求。有机小分子–盐双水相体系最大的优点是成相物质价格低廉后续分离操作简单非常具有开发价值与应用前景。不同双水相体系除了拥有共有的特点外还具备各自的优势与不足只有深入研究不同体系的特点综合考虑被萃物性质、双水相体系特点、实效与成本等因素开发与目标萃取物相适应的双水相体系才能加快该技术在工业生产中的应新型双水相体系由物科衡算得出的系统中各部分物质的数量之间的关系。设系统中某组分的分子分数为如将系统分为分子分数各为x、x的两部分则它们的摩尔数n与n间必定遵守下列关系:nn=(xx)(xx)此关系犹如以x为支点以xx与xx为臂长的杠杆的计算公式。

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