ReverTra Ace qPCR RT Kit

08-03 ReverTra Ace®qPCR RT Kit (Code No.:FSQ-101) 使用 说明书 房屋状态说明书下载罗氏说明书下载焊机说明书下载罗氏说明书下载GGD说明书下载 科研用 TOYOBO CO., LTD. Life Science Department OSAKA JAPAN 目 录 【1】 前言 .......................................................... 1 【2】 产品内容 ...................................................... 2 【3】 其他必需品 .................................................... 3 【4】 使用方法 ...................................................... 4 【5】 相关操作步骤 .................................................. 5 【6】 常见问题 ...................................................... 8 【7】 相关产品 ...................................................... 9 【 注意 】 本试剂盒中所含的试剂均为科研用试剂。请勿作为诊断、临床试剂用。在使用时， 请严格遵守实验室的一般注意事项，适当使用保护用品，安全操作。 【1】 前言 ReverTra Ace® qPCR RT Kit 是基于制作 Realtime PCR 用模板 cDNA 的目 的而开发的高效率且使用简单方便的逆转录反应试剂盒。本产品采用了本公司高 性能逆转录酶 ReverTra Ace®和作为 Realtime PCR 目标的短链 cDNA 合成的最优 化反应成分，能够高效率地合成适用于 Realtime PCR 的 cDNA 模板。此外，本 产品简化了试剂盒的构成并且拥有快速的反应操作的特点，能够在短时间内简单 方便地进行 cDNA 合成。 *本产品的试剂盒内没有添附 Realtime PCR 试剂。关于 Realtime PCR 产品，推荐使用本 公司的 Realtime PCR 用试剂 Realtime PCR Master Mix 系列。（详情请参考[7]相关产品的内 容）。 ◆本产品的特征◆ 1. 对应各种不同长度目标片段的高效率逆转录 ReverTra Ace® qPCR RT Kit采用了最适合于Realtime PCR用 cDNA合成的 反应缓冲液，和以最恰当比例混合的 Primer 混合液，对于各种不同长度的目标 片段，不用摸索条件就能够进行高效率的逆转录反应。 2. 反应时间短、操作简单方便 ReverTra Ace® qPCR RT Kit 只需要 15 分钟的逆转录反应，就能够对各种 长度的目标片段进行高效率的逆转录反应。此外，在 Realtime PCR 的过程中， 会自动清除抑制反应的残留 RNA，无须另外进行 RNase H 处理（专利申请中）。 3. 提高了与Realtime PCR试剂的兼容性 ReverTra Ace® qPCR RT Kit采用了对于Realtime PCR反应体系的影响程度 最小的成分，即使在 PCR 反应中添加了最多 20%液量的逆转录反应液，也能表 现出良好的反应曲线（已通过使用本公司的 Realtime PCR Master Mix 确认）。最 适合用于表达量较少的 mRNA 的高灵敏度 检测 工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训 。 http://www.bio-toyobo.cn 1 东洋纺（上海）生物科技有限公司 【2】 产品内容 ‹ 本产品包含以下几种试剂，每 10μl 反应体系可使用 200 次。 所有试剂请均保存在-20°C 条件下。 试剂名 保存条件 容量 5× RT Buffer (Reaction Buffer + MgCl2 + dNTPs) -20°C 400μl Enzyme Mix (ReverTra Ace® reverse transcriptase + RNase Inhibitor) -20°C 100μl Primer Mix (Random Primer + Oligo(dT) Primer) -20°C 100μl Nuclease-free Water -20°C 1000μl x2 5×RT Buffer 含有反应缓冲液、MgCl2、dNTPs 等 5 倍浓度的逆转录反应液 Buffer。溶解 时，可能会出现白色沉淀，但不影响其品质。请使用振荡器等仪器使其混合均匀， 等完全溶解之后再使用。 Enzyme Mix 含有本公司高性能逆转录酶 ReverTra Ace®和 RNase Inhibitor 的混合酶液。 Primer Mix 含有 Random Primer 和 Oligo(dT) Primer 的混合引物，以最恰当的比例混合， 对于各种不同长度的目标片段都能进行高效率的逆转录反应。 Nuclease-free Water Nuclease-free 级别的灭菌蒸馏水。为避免影响聚合酶的活性，未经过 DEPC 处理。 垂询电话：021-58794900 2 【3】 其他必需品 ‹ 除本产品之外，请再准备以下几种试剂和仪器。 ・Thermal cycler和Incubator 本产品的建议使用温度为37°C、98°C、以及65°C，请准备好符合条件的相 关仪器。 ・Nuclease-free Water 本产品已添附可使用200次的Nuclease-free Water，此外请再准备一些 Nuclease-free Water，以便在稀释模板RNA时使用。推荐使用未经过DEPC处理的 Nuclease-free Water。也可以使用经DEPC处理过的水，但残留的DEPC会抑制反 应的进行，因此请使用高压灭菌器彻底清除DEPC之后再使用。此外，为防止核 酸的混入，用于逆转录反应和PCR反应的Nuclease-free Water，建议和用于其它 实验的Nuclease-free Water分开保存，避免共用。 ・Total RNA 使用本产品，可以把Total RNA直接作为模板使用。从组织、培养细胞等得 到Total RNA中，作为表达分析对象的mRNA的含量通常为1-2%。除了进行检测 表达量极低的目标之外，通常情况下都可以明显地检测到作为模板的Total RNA。 通过AGPC(Acid Guanidium - Phenol - Chloroform)法等提纯的Total RNA中， 混有基因组DNA。对于在检测的目标中存在很多假基因的情况，以及跨内含子 位置不能 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 引物的情况，可能是因为由混入的基因组DNA产生的假阳性信号 引起的。请采取必要的措施（如：DNase I等）清除基因组DNA。 ・poly(A)+ RNA (mRNA) 利用poly(A)+ RNA和Oligo(dT)杂交后，选择性地分离出仅有poly(A)+末端的 mRNA。在提纯过程中浓缩mRNA，是为了在高灵敏度下能够检测mRNA。但是， 与Total RNA相比mRNA更容易受到RNase的分解，也不能以ribosomal RNA为内 参来进行相对定量。 http://www.bio-toyobo.cn 3 东洋纺（上海）生物科技有限公司 【4】 使用方法 (1)RNA的变性 把RNA在65°C条件下进行5分钟后，立即放于冰上冷却。 ・在经过以上步骤的处理后，对于容易形成高级结构的RNA可以提高逆转录的效率。 ・在进行以上步骤处理的时候，请不要添加5×RT Buffer和酶。 (2)反应液的配制 反应液组成 Nuclease-free Water up to 10μl 5×RT Buffer 2μl RT Enzyme Mix 0.5μl Primer Mix 0.5μl RNA 0.5pg-1μg Total volume 10μl ・除了在本试剂盒内添附的Primer Mix之外，也可以使用基因特异性引物(Gene Specific Primer)。此时，在反应体系中添加的最终浓度为0.5pmol/μl （每10μl反应体系添加 5mpol）。 (3)逆转录反应 在37°C条件下，进行15分钟的逆转录反应。 ↓ 在98°C条件下，进行5分钟的酶失活反应。 ↓ 反应结束之后，请保存于4°C或者-20°C条件下。在进行Realtime PCR反应时， 请在作为模板的反应液内直接添加或者稀释之后添加。 ・此温度条件是最适合本试剂盒组成成分的条件，一旦改变此温度条件，除了影响酶 的活性之外，对引物的退火效率、RNA的清除效率、以及逆转录反应后的酶失活效 率等也会产生很大的影响。摸索条件的时候，请一定要基于此温度条件来进行实验。 ・把逆转录反应液添加到Realtime PCR反应液内时，请不要超过20%的量。添加过量 的逆转录反应液，会降低PCR的反应效率，不能进行准确的定量。 ・在使用基因特异性引物的情况下，特别是使用保持同一配对的逆转录引物和PCR引 物的时候，在逆转录反应时的非特异性退火是导致PCR非特异性扩增产物产生的原 因。此时，提高逆转录反应的温度(至42—50°C)可得到改善。 垂询电话：021-58794900 4 【5】 相关操作步骤 1. Total RNA的DNase I处理 在通过AGPC法等提纯的Total RNA内混有基因组DNA，可能会发生由基因 组DNA产生假阳性信号的情况(请参考p3)，请根据以下的方法清除基因组DNA。 (1)反应液的配制和反应 反应液组成（例） Nuclease-free Water up to 10μl Total RNA(<10μg) xμl 10×DNase I Buffer 1μl (10mM Tris-Cl,pH7.6,2.5mM MgCl2,0.5mM CaCl2) RNase-free DNase I(10U/μl) 0.5μl Total volume 10μl 配制好以上的反应混合液后，置于冰上反应10－30分钟。 (2)提纯（可使用一般的提纯试剂盒） 在反应液内添加100μl的Nuclease-free Water、100μl的TE饱和苯酚，用vortex使 其充分混合后，置于冰上5分钟 ↓ 12,000rpm、5分钟的离心后，回收上清液。 ↓ 添加100μl的氯仿后使其混合。 ↓ 12,000rpm、5分钟的离心后，回收上清液。 ↓ 添加100μl的5M醋酸铵、200μl的异丙醇， 使其混合后置于-20°C条件下30分钟。 ↓ 12,000rpm、5分钟的离心后，弃上清液。 ↓ 在沉淀中加入70%乙醇。 ↓ 12,000rpm、5分钟的离心后，弃上清液。 ↓ 在沉淀中加入适量的Nuclease-free Water，使其溶解。 http://www.bio-toyobo.cn 5 东洋纺（上海）生物科技有限公司 2. Poly(A)+ RNA提纯法 在进行检测表达量较少的遗传基因时，从Total RNA中提取poly(A)+ RNA作 为模板使用，可以提高灵敏度。在此介绍一个poly(A)+ RNA提纯法的例子：通过 使用Oligo(dT)结合磁珠的专用提纯试剂盒MagExtractor® -mRNA- (Code No. NPK-801)的方法。 (1)DNase I反应液的配制和提纯前的处理 反应液组成（例） MagExtractor® –mRNA- 溶出液 up to 100μl Total RNA(<100μg) xμl 10×DNase I Buffer 10μl RNase-free DNase I(10U/μl) 1μl Total volume 100μl 配制好以上的反应混合液后，置于冰上反应15分钟。 ↓ 在反应液内添加400μl的溶解液（含2-巯基乙醇）和800μl的吸附液。 (2)反应和提纯 在新的1.5ml离心管内加入250μl磁珠。 ↓ 使用磁力架Magical Trapper (Code No. MGS-101)或离心机等 进行固液分离（B/F分离）后，弃上清液。 ↓ 添加上述经过事先处理的Total RNA液。 ↓ 用vortex充分搅拌（至均匀程度）后，在室温下放置10分钟。 ↓ 进行固液分离（B/F分离）后，弃上清液。 ↓ 添加1ml的洗净液。 ↓ 用vortex充分搅拌（至均匀程度）。 ↓ 进行固液分离（B/F分离）后，弃上清液。 ↓ 添加1ml的洗净液。 ↓ （转下页） 垂询电话：021-58794900 6 （接上页） ↓ 用vortex充分搅拌（至均匀程度）。 ↓ 进行固液分离（B/F分离）后，弃上清液。 ↓ 添加1ml的洗净液。 ↓ 用vortex充分搅拌（至均匀程度）。 ↓ 进行固液分离（B/F分离）后，弃上清液。 ↓ 进行离心后，再弃上清液。 ↓ 添加适量的溶出液。 ↓ 用vortex充分搅拌（至均匀程度）。 ↓ 65°C、2分钟。 ↓ 用vortex充分搅拌（至均匀程度）。 ↓ 离心。 ↓ 进行固液分离（B/F分离）后，回收含有poly(A)+ RNA的上清液。 ・MagExtractor® -mRNA-的 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 操作，需要反复进行2次上述的提纯。经过2次反复提纯， 能够清除1次提纯未能完全清除的rRNA和基因组DNA。通常情况下，只需提纯1次，但如 需要获取高纯度的poly(A)+ RNA时，请进行2次提纯。 ・关于此提纯法的详细介绍参考MagExtractor® -mRNA-附带的使用说明书。 http://www.bio-toyobo.cn 7 东洋纺（上海）生物科技有限公司 【6】 常见问题 1.在Realtime PCR时检测无信号，或者信号出现延迟。 原因 对策 RNA的纯度较低 可能是由于配制RNA时残留的杂质抑制了逆转录反应。请重新提纯模板RNA。 RNA被降解 RNA 可能是被混入的RNase降解。请重新配制 RNA。此外，低浓度的RNA保存时，除更容易 被RNase降解外，由于被反应容器吸附，实际的 RNA的量会有所减少。建议避免把使用过的低 浓度RNA冻结保存后再使用，最好每次使用时 直接从高浓度的保存液稀释。 RNA的量过多或者过少 经确认，使用本产品时，添加1pg-2μg范围的 RNA的量都能够进行稳定有效的逆转录反应。 但是由于RNA的种类和品质等的不同，可以进 行反应的RNA的量可能会有所改变。请适当增 减模板RNA的添加量。 反应温度不当 改变反应条件会对引物的退火效率、酶的活性、 逆转录后的酶失活、模板RNA的清除效率等多 方面产生影响。在进行实验时，请务必要按照 本使用说明书上记载的条件来设定反应温度。 逆转录反应液的添加量过多 经确认，使用本产品时，即使在PCR反应液内 添加最多20%的逆转录反应液也能表现出良好 的反应曲线。但是使用不同的PCR试剂，可能 会使表达量降低。请减少逆转录反应液的添加 量。 2. 在Realtime PCR时检测到非特异性的信号。 原因 对策 发生引物的非特异性退火的 情况（使用遗传基因特异性引 物时） 使用遗传基因特异性引物进行逆转录时，引物 的非特异性退火是在PCR时出现非特异性信号 的重要因素。提高逆转录反应的温度，可以有 效地提高退火的特异性。请把反应温度设定在 42°C-50°C的范围内。 垂询电话：021-58794900 8 http://www.bio-toyobo.cn 9 【7】 相关产品 Realtime PCR 试剂 品名 规格 Code No. Realtime PCR用Master Mix (Probe Assay用) Realtime PCR Master Mix 1ml x1 1ml x5 QPK-101T QPK-101 Realtime PCR用Master Mix (SYBR® Green Assay用) SYBR® Green Realtime PCR Master Mix 1ml x1 1ml x5 QPK-201T QPK-201 配置 RNA 的相关试剂 产品名 规格 Code No. 利用磁珠简单方便地提纯mRNA的试剂盒 MagExtractor® -mRNA- 5次 NPK-801 利用磁珠简单方便地提纯Total RNA的试剂盒 MagExtractor® -RNA- 100次 NPK-201 通过磁珠简单地进行提纯的专用磁力架 Magical Trapper 1个 MGS-101 One-step PCR 试剂 产品名 规格 Code No. One-step Realtime PCR用Master Mix (Probe Assay用) RNA-directTM Realtime PCR Master Mix 500μl x2 500μl x5 QRT-101T QRT-101 One-step Realtime PCR用Master Mix (SYBR® Green Assay用) RNA-directTM SYBR® Green Realtime PCR Master Mix 500μl x2 500μl x5 QRT-201T QRT-201 ◆详情请浏览本公司中文网页 http://www.bio-toyobo.cn [制造 • 销售商] 东洋纺（上海）生物科技有限公司 上海市浦东新区张杨路 188 号汤臣商务中心 C 座 310 室 邮编：200122 交货期限 • 订货相关咨询 Tel:021-5879-4900 Fax:021-5879-4901 E-Mail:sales@bio-toyobo.cn 产品内容 • 技术相关咨询 Tel:021-5879-4142 Fax:021-5879-5259 E-Mail:tech@bio-toyobo.cn http://www.bio-toyobo.cn 代理商 资料 新概念英语资料下载李居明饿命改运学pdf成本会计期末资料社会工作导论资料工程结算所需资料清单 ： 【1】 前言 【5】 相关操作步骤