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实验室啤酒发酵实验讲义.doc

实验室啤酒发酵实验讲义

叶落山黄
2011-03-19 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《实验室啤酒发酵实验讲义doc》,可适用于农林牧渔领域

C、实验室啤酒发酵实验室啤酒发酵实验、​ 实验目的:熟悉静止培养操作观察啤酒发酵过程掌握发酵过程中一些指标的分析操作技能。、​ 实验原理:啤酒酵母将麦芽汁发酵产生酒精等发酵产物(啤酒)。三、实验器材:⑴升发酵罐。⑵~OBX糖度表。()℃℃可调生化培养箱。培养基:​ 麦芽汁发酵培养基Plato,升糖化制取。​ 麦芽汁琼脂培养基:麦芽汁加%琼脂自然pH。​ 麦芽汁液体培养基:酵母扩大培养用。菌种:啤酒生产用酵母菌株。四、实验步骤:()麦汁制备()酵母菌种分离纯化与质量鉴定()菌种扩大培养()啤酒主发酵:麦汁升OBX℃→接种量×个细胞mL→主发酵℃~天→至OBX时结束(嫩啤酒)。在主发酵过程中每天测定下列项目:糖度、细胞浓度、出芽率、染色率、酸度、α氨基氮、还原糖、酒精度、pH、双乙酰。然后以时间为横坐标这些指标为纵坐标叠画于方格纸上。()后发酵五、作业要求()画出发酵周期中上述上述指标的曲线图并解释它们的变化。()记下操作体会与注意点。实验一协定法糖化试验一、实验目的:协定法糖化试验是欧洲啤酒酿造协会(EBC)推荐的评价麦芽质量的标准方法我们用该法进行小量麦芽汁制备并借此评价所用麦芽的质量。二、实验原理:利用麦芽所含的各种酶类将麦芽中的淀粉分解为可发酵性糖类蛋白质分解为氨基酸(具体参见理论部分第二节)。三、实验器材和试剂:实验室糖化器:由水浴和~mL的烧杯组成糖化仪器杯内用玻棒搅拌或用℃温度计作搅拌器(此时搅拌应十分小心以免敲碎水银头)。实验时杯内液面应始终低于水浴液面。最好采用专用糖化器:该仪器有一水浴水浴本身有电热器加热和机械搅拌装置。水浴上有~个孔每个孔内可放一糖化杯糖化杯由紫铜或不锈钢制成每一杯内都带有搅拌器转速为~转分搅拌器的螺旋桨直径几乎与糖化杯同但又不碰杯壁它离杯底距离只有~mm。白色滴板或瓷板玻棒或温度计。​ 滤纸漏斗电炉。​ 碘溶液N:克碘和克碘化钾溶于水中稀释到毫升。四、实验步骤协定法糖化麦汁的制备()取g麦芽用植物粉碎机将其粉碎。()在已知重量的糖化杯(~mL烧杯或专用金属杯)中放入g麦芽粉加mL~℃的水于不断搅拌下在℃水浴中保温分钟。()使醪液以每分钟升温℃的速度升温加热水浴在分钟内升至℃。此时于杯内加入mL℃的水。()℃保温小时后在~分钟内急速冷却到室温。()冲洗搅拌器。擦干糖化杯外壁加水使其内容物准确称量为g。()用玻棒搅动糖化醪并注于干漏斗中进行过滤漏斗内装有直径厘米的折叠滤纸滤纸的边沿不得超出漏斗的上沿。()收集约mL滤液后将滤液返回重滤。过分钟后为加速过滤可用一玻棒稍稍搅碎麦槽层。将整个滤液收集于一干烧杯中。在进行各项试验前需将滤液搅匀。​ 糖化时间的测定⑴在协定法糖化过程中糖化醪温度达℃时记录时间分钟后用玻棒或温度计取麦芽汁滴置于白滴板(或瓷板)上再加碘液滴混合观察颜色变化。⑵每隔分钟重复上述操作直至碘液呈黄色(不变色)为止记录此时间。由糖化醪温度达到℃开始至糖化完全无淀粉反应时止所需时间为糖化时间。报告以每分钟计算:如<分钟~分钟~分钟等正常范围值浅色麦芽:分钟内深色麦芽:分钟内​ 过滤速度的测定以从麦汁返回重滤开始至全部麦芽汁滤完为止所需的时间来计算以快、正常和慢等来表示小时内完成过滤的规定为“正常”过滤时间超过小时的报告为“慢”。​ 气味的检查糖化过程中注意糖化醪的气味。具有相应麦芽类型的气味规定为“正常’,因此对深色麦芽若有芳香味应报以“正常”若样品缺乏此味则以“不正常”表示其它异味亦应注明。​ 透明度的检查麦汁的透明度用透明、微雾、雾状和混浊表示。​ 蛋白质凝固情况检查强烈煮沸麦芽汁分钟观察蛋白质凝固情况。在透亮麦芽汁中凝结有大块絮状蛋白质沉淀记录为“好”若蛋白质凝结细粒状但麦汁仍透明清亮则记录为“细小”若虽有沉淀形成但麦芽汁不清可表示为“不完全”若没有蛋白质凝固则记录为“无”。五、注意事项:粉碎最好用EBC粉碎机若用号筛粉碎细粉约占用号筛粉碎细粉约占。对溶解度好的麦芽建议用号筛。因为细粉太多影响过滤速度。一般要求粗粒与细粒(包括细粉)的比例达:以上。麦皮在麦汁过滤时形成自然过滤层因而要求破而不碎。如果麦皮粉碎过细不但会造成麦汁过滤困难而且麦皮中的多酚、色素等溶出量增加会影响啤酒的色泽和口味。但麦皮粉碎过粗难以形成致密的过滤层会影响麦汁浊度和得率。麦芽胚乳是浸出物的主要部分应粉碎得细些。为了使麦皮破而不碎最好稍加回潮后进行粉碎。六、思考题:糖化过程中麦芽中各种酶的作用。实验二啤酒酵母纯种分离、​ 实验目的:学习酵母菌种的纯种分离技术二、实验原理:关于纯种分离在基础微生物学实验中已学过稀释分离法和划线分离法这里不再重复。这两种方法虽然简单但并不能保证分离所得种的纯度。而单细胞分离法因可用显微镜直接检查其纯度能得到充分保证。林德奈单细胞分离法即小滴培养法是将酵母菌液充分稀释至每一小滴差不多含一个酵母细胞然后在显微镜下确证只含一个细胞的小滴经适当培养后扩大保存。盖玻片上小滴点样示意图凹载片上湿室小滴培养适宜图三、实验器材与试剂:显微镜凹载玻片计数板盖玻片等。四、实验步骤:​ 取块盖玻片用分析天平称重(精确至mg)后在一块盖玻片(最好用血球计数板的盖玻片)上用毛细滴管滴上滴酵母培养基合上另一玻片再称重计算每滴培养基的体积。​ 用计数板计数酵母菌用培养基对其进行高倍稀释稀释至每滴培养基中大致含一个酵母菌。​ 在已灭菌的盖玻片上滴上酵母稀释液(每张玻片可滴滴)放于已灭菌的凹载玻片上显微镜下观察找到只含一个酵母菌的小滴做上记号。​ ℃培养一定时间后(应放于湿室中)用无菌滤纸片吸走标记的酵母菌进行扩大培养和菌种保藏。五、注意事项:因小滴易干操作时动作要快培养时要用湿室。六、思考题:称重时为什么要用两块盖玻片?是否可以用微量移液器(如微升)来代替称重?实验三啤酒酵母的计数一、实验目的:学习用血球计数板计数酵母数量的方法、​ 实验原理:啤酒发酵时必须接入一定数量的酵母细胞在发酵过程中为了跟踪发酵的进程判断发酵是否正常也有必要测定悬浮酵母细胞的浓度。酵母菌的计数常用血球计数板方法。血球计数板是一块长方形的玻璃板被四条凹槽分隔成三个部分中间部分又被一横槽隔成上下两半每一半上各刻有一个方格网方格网的边长为mm,分为个正方形大格每一大格为mm,其中中间那个大格被横向和纵向的双线分成(或)个中格每个中格又被单线分成(或)个小格因此一个大格中共有×=个小格。这样的一个大格就是一个计数室。由于计数室比板表面要低mm,因此盖上盖玻片后整个计数室的容积就是mm,相当于mL。计数时先让计数室中充满待检溶液然后计数个小格中的细胞总数就可换算出mL发酵液中的总菌数。三、实验器材:显微镜血球计数板盖玻片等。四、实验步骤:取清洁的血球计数板一块平放于桌面上在计数室上方加盖专用盖玻片取酵母菌液(发酵液)一小滴滴至盖玻片的边缘让菌液渗入计数室内注意计数室内不能留有气泡。静置分钟让酵母细胞稳定附着于计数室内将计数板置于显微镜的载物台上先用低倍镜找到计数板的方格网并移至视野中间(寻找时可通过缩小光圈降低聚光镜开低电源电压等方式减少进光量使视野稍偏暗)找到计数室位置(中间一个大方格)并看清由双线包围的中方格(或格)及由单线包围的小方格(共格)计数大格内的酵母细胞总数必要时可在高倍镜下观察。若酵母细胞过多可采取():稀释后再计数():有代表性地选择左上左下右上右下中间五个中方格计数其内的菌数求得每个中格的平均值然后乘以中方格数(或)即得每个大格内的细胞总数():在上述个中方格中选择处于顶角的个小方格计数计算个小方格中的总菌数再乘以即得大格内的细胞总数。计算:酵母细胞数mL=大格中的细胞总数××稀释倍数血球计数板的清洗:将血球计数板立即用流水冲洗干净若菌液变干酵母细胞被固定在计数板上则很难用流水冲洗干净必须用优质脱脂棉湿润后轻轻擦洗再用流水冲洗干净凉干五、注意事项:血球计数板的计数室内刻度非常精细清洗时切勿用试管刷或其它粗糙物品擦拭。加样前应先放好盖玻片让菌液自然吸入。如果先加菌液则由于盖玻片较轻可能会浮在菌液上这样计数室内的容积就不再使mL了。因此为了使结果更加准确最好不要用普通的盖玻片来替代。计数时为避免重复或遗漏对压在方格线上的细胞应遵循数上不数下数左不数右的原则(即凡压在上部或左面线上的细胞都应计数入内凡压在下部或右面线上的菌体都应忽略不计)。对出芽细胞如果子细胞大于母细胞的一半则应算作两个细胞。六、思考题:计数时发现计数板不干净怎样快速地清洗计数板?实验三啤酒酵母的质量检查一、实验目的:学习酵母菌种的质量鉴定方法二、实验原理:酵母的质量直接关系到啤酒的好坏。酵母活力强发酵就旺盛若酵母被污染或发生变异酿制的啤酒就会变味。因此不论在酵母扩大培养过程中还是在发酵过程中必须对酵母质量进行跟踪调查以防产生不正常的发酵现象必要时对酵母进行纯种分离对分离到的单菌落进行发酵性能的检查。三、实验器材与试剂:显微镜恒温水浴温箱高压蒸汽灭菌锅带刻度的锥形离心管等​ 美兰(又称次甲基兰Methyleneblue)水溶液:g美兰溶于mL水中pH的醋酸缓冲液:g硫酸钙g硫酸钠g冰醋酸溶于mL水中醋酸钾(钠)培养基:葡萄糖蛋白胨醋酸钾(钠)琼脂pH。四、实验步骤:​ 显微形态检查载玻片上放一小滴蒸馏水挑酵母培养物少许盖上盖玻片在高倍镜下观察。优良健壮的酵母菌应形态整齐均匀表面平滑细胞质透明均一。年幼健壮的酵母细胞内部充满细胞质老熟的细胞出现液泡呈灰色折光性较强衰老的细胞中液泡多颗粒性贮藏物多折光性强。死亡率检查方法同上可用水浸片法也可用血球计数板法。酵母细胞用美兰水溶液染色后由于活细胞具有脱氢酶活力可将兰色的美兰还原成无色的美白因此染不上颜色而死细胞则被染上兰色。一般新培养酵母的死亡率应在以下生产上使用的酵母死亡率在以下。出芽率检查指出芽的酵母细胞占总酵母细胞数的比例。随机选择个视野观察出芽酵母细胞所占的比例取平均值。一般生长健壮的酵母在对数生长阶段出芽率可达以上。凝集性试验对下面发酵来说凝集性的好坏牵涉到发酵的成败。若凝集性太强酵母沉降过快发酵度就太低若凝集性太弱发酵液中悬浮有过多的酵母菌对后期的过滤会造成很大的困难啤酒中也可能会有酵母味凝集性可通过本斯试验来确证:将g酵母湿菌体与mLpH的醋酸缓冲液混合℃平衡分钟加至带刻度的锥形离心管内连续分钟每隔分钟记录沉淀酵母的容量。实验后检查pH是否保持稳定。一般规定分钟时的沉淀酵母量在mL以上者为强凝集性mL以下者为弱凝集性。死灭温度检测死灭温度可以作为酵母菌种鉴别的一个重要指标一般说来培养酵母的死灭温度在~℃之间而野生酵母或变异酵母的死灭温度往往较高。温度试验范围一般为~℃温度间隔为或℃在已灭菌的麦汁试管中(内装mL麦汁)接入培养小时的发酵液mL放于恒温水浴内每一样品做个平行试验并在另一同样的试管中放入温度计待温度计达到所需温度时开始计时保持分钟后置冷水中冷却℃培养~天不能发酵的温度即为死灭温度。.子囊孢子的产生试验子囊孢子的产生试验也是酵母菌种鉴别的一个重要指标。一般说来培养酵母不能形成子囊孢子而野生酵母较易形成子囊孢子。将酵母菌体接种于醋酸钾培养基上℃培养小时后用显微镜检查子囊孢子产生情况。发酵性能测定酵母的发酵度反映酵母对各种糖类的发酵情况有些酵母不能发酵麦芽三糖发酵度就低有些酵母甚至能发酵麦芽四糖或异麦芽糖发酵度就高。将mL麦汁盛放于mL三角烧瓶中灭菌冷却后加入泥状酵母g置℃温箱中发酵~天每隔小时摇动一次。发酵结束后滤去酵母蒸出乙醇添加蒸馏水至原体积测比重(见实验十)。()外观发酵度=(Pm)P×%式中P发酵前麦芽汁浓度m发酵液外观浓度(不排除乙醇)()实际发酵度=(Pn)P×%·n发酵液的实际浓度(排除乙醇后)一般外观发酵度应为~真正发酵度为~说明:啤酒酵母主要有两类:()上面发酵啤酒酵母:进行上面发酵发酵温度相对较高(~℃)发酵结束后大部分酵母浮在液面。例如英国著名的淡色爱尔啤酒(Ae)司陶特(Stout)黑啤酒等。()下面发酵啤酒酵母:进行下面发酵发酵温度在℃左右发酵结束后大部分酵母沉于容器底部。例如捷克的比尔森(Pilsen)啤酒德国的幕尼黑啤酒和多特蒙德啤酒丹麦的嘉士伯啤酒等我国的啤酒多属于此类型。实验四啤酒酵母的扩大培养一、实验目的:学习酵母菌种的扩大培养方法为实验室啤酒发酵准备菌种。二、实验原理:在进行啤酒发酵之前必须准备好足够量的发酵菌种。在啤酒发酵中接种量一般应为麦芽汁量的(使发酵液中的酵母量达×个酵母mL)因此要进行大规模的发酵首先必须进行酵母菌种的扩大培养。扩大培养的目的一方面是获得足量的酵母另一方面是使酵母由最适生长温度(℃)逐步适应为发酵温度(℃)。三、实验器材:恒温培养箱生化培养箱显微镜等。四、实验步骤:本次实验拟用升麦芽汁因此应制备mL含×个酵母mL的菌种以每班个组计算每个组应制备约mL菌种。建议流程如下:℃天菌种扩大:麦汁斜面菌种→麦汁平板→镜检挑单菌落个接种mL麦汁试管(或三角瓶)℃天→mL麦汁三角瓶℃天→计数备用。每天摇动次每天摇动次培养基的制备取协定法制备的麦芽汁滤液(约mL)加水定容至约mL取mL装入mL三角瓶中另mL至mL三角瓶中包上瓶口布后Mpa灭菌分钟。菌种扩大培养按上面流程进行菌种的扩大培养(斜面活化菌种由教师提供)。注意无菌操作。五、注意事项:灭菌后的培养基会有不少沉淀这不影响酵母菌的繁殖。若要减少沉淀可在灭菌前将培养基充分煮沸并过滤。六、思考题:菌种扩大过程中为什么要慢慢扩大培养温度为什么要逐级下降。实验五小型啤酒酿造设备介绍及发酵罐的空消一、实验目的:熟悉啤酒酿造工艺流程对发酵罐进行空消为发酵作好准备。二、实验原理:啤酒酿造包括麦芽粉碎、麦汁糖化、麦醪过滤、麦汁煮沸、麦汁冷却及啤酒发酵等几个过程。啤酒发酵是纯种发酵必须先对空的发酵罐进行灭菌处理。三、实验器材:粉碎机、糖化煮沸锅、过滤沉淀槽、发酵罐、制冷机、板式换热器等四、工艺流程简介:啤酒发酵的工艺流程见图糖化煮沸锅过滤槽、发酵罐的结构图见五、实验步骤:熟悉各项设备​ 清洗各项设备​ 在回旋沉淀槽、板式换热器、发酵罐中通入蒸汽消毒分钟。​ 待各项设备使用结束后应及时进行清洗灭菌。实验六麦芽汁的制备一、实验目的:熟悉麦芽汁的制备流程为啤酒发酵准备原料。二、实验原理:麦汁制备包括原料糖化、麦醪过滤和麦汁煮沸等几个过程。由于麦芽的价格相对较高再加上发酵过程中需要较多的糖因此目前大多数工厂都用大米做辅料。三、实验器材:在糖化车间一般有四种设备:糊化锅、糖化锅、麦汁过滤槽和麦汁煮沸锅本实验由于受条件限制只能采用单式设备即将糊化锅、糖化锅和麦汁煮沸锅合而为一。四、实验步骤:糖化用水量的计算糖化用水量一般按下式计算:W=A(B)B式中B为过滤开始时的麦汁浓度(第一麦汁浓度)A为Kg原料中含有的可溶性物质(浸出物重量百分比)W为Kg原料(麦芽粉)所需的糖化用水量(升)。例:我们要制备升度的麦芽汁如果麦芽的浸出物为请问需要加入多少麦芽粉?因为W=()=升即Kg原料需升水则要制备升麦芽汁大约需要添加Kg的麦芽和升左右的水(不计麦芽溶出后增加的体积)。糖化糖化是利用麦芽中所含的酶将麦芽和辅助原料中的不溶性高分子物质逐步分解为可溶性低分子物质的过程。制成的浸出物溶液就是麦芽汁。传统的糖化方法主要有两大类()煮出糖化法:利用酶的生化作用及热的物理作用进行糖化的一种方法。()浸出糖化法:纯粹利用酶的生化作用进行糖化的方法。本实验采用浸出糖化法。推荐使用如下流程:~℃保温分钟→~℃分钟→℃分钟(至碘液反应基本完全)→~℃送入过滤槽。麦汁过滤将糖化醪中的浸出物与不溶性麦糟分开以得到澄清麦汁的过程。由于过滤槽底部是筛板要借助麦糟形成的过滤层来达到过滤的目的因此前分钟的滤出物应返回重滤。头号麦汁滤完后应用适量热水洗糟得到洗涤麦汁。麦汁煮沸将过滤后的麦汁加热煮沸以稳定麦汁成分的过程。此过程中可加入酒花(一种含苦味和香味的蛇麻之花每升麦汁中添加约克)。煮沸的具体目的主要有:破坏酶的活性使蛋白质沉淀浓缩麦汁浸出酒花成分降低pH蒸出恶味成分杀死杂菌形成一些还原物质。添加酒花的目的主要有:赋予啤酒特有的香味和爽快的苦味增加啤酒的防腐能力提高啤酒的非生物稳定性。将过滤的麦汁通蒸汽加热至沸腾煮沸时间一般控制在~小时蒸发量达~(蒸发时尽量开口煮沸结束时为了防止空气中的杂菌进入最好密闭)。​ 回旋沉淀及麦汁预冷却:将煮沸后的麦汁从切线方向泵入回旋沉淀槽使麦汁沿槽壁回旋而下借以增大蒸发表面积使麦汁快速冷却同时由于离心力的作用使麦汁中的絮凝物快速沉淀的过程。​ 麦汁冷却将回旋沉淀后的预冷却麦汁通过薄板冷却器与冰水进行热交换从而使麦汁冷却到发酵温度的过程。设备清洗由于麦芽汁营养丰富各项设备及管阀件(包括糖化煮沸锅、过滤槽、回旋沉淀槽及板式换热器)使用完毕后应及时用洗涤液和清水清洗并蒸汽杀菌。五、注意事项:若加热、煮沸过程中将蒸汽直接通入麦汁中则由于蒸汽的冷凝。麦汁量会增加因此最好用夹套加热的方法。麦汁煮沸后的各步操作应尽可能无菌特别是各管道及薄板冷却器应先进行杀菌处理。六、思考题:麦芽粉碎程度会对过滤产生怎样的影响?实验七糖度的测定一、实验目的:学习用糖锤度计测定糖度的方法。二、实验原理:麦汁的好坏将直接关系到啤酒的质量。工业上一般根据啤酒品种的不同来制造不同类型的麦芽汁因此及时分析麦芽汁的质量调整麦芽汁制造工艺显得尤为重要。麦汁的主要分析项目有:麦汁浓度、总还原糖含量、氨基氮含量、酸度、色度、苦味质含量等。一般分析项目应在麦汁冷却分钟后取样。样品冷却后以滤纸过滤滤液放于灭菌的三角瓶中低温保藏。全部分析应在小时内完成。为了调整啤酒酿制时的原麦汁浓度控制发酵的进程常常在麦汁过滤后、发酵过程中用简易的糖锤度计法测定麦汁的浓度。现对糖锤度计这一简单的玻璃仪器作一介绍。糖锤度计即糖度表又称勃力克斯比重计。这种比重计是用纯蔗糖溶液的重量百分数来表示比值它的刻度称为勃力克斯刻度(Brixsale,简写BX)即糖度规定在℃使用BX与比重的关系举例如下(℃):比重BX它们之间有公式可换算同一溶液若测定温度小于℃则因溶液收缩比重比℃时要高。若液温高于℃则情况相反。不在℃液温时测得的数值可从附表中查得℃时的糖度。我们说某溶液是多少Brix值或多少糖度应是指℃的数值。若是在℃以外用糖度表得数值应加温度说明(显然如测纯蔗糖溶液只有在℃液温测得的数值是真正表示了含蔗糖的重量百分数)。Plato是一种与BX相同的表示比重的刻度也以在℃时纯蔗糖溶液的重量百分数表示。很明确如plato就是指℃时的数值没有(例如)℃时多少plato的含糊叫法因为只有勃力克斯比重计没有plato比重计所以不存在各种温度用plato比重计去测定的情况所以它纯粹是一种刻度一种标准而已。麦汁浓度常用BX表示有时也用plato表示。换算举例:在℃液温用糖表读得啤酒主发酵液为糖度问℃的糖度为多BX?多少plato?查表:观测糖锤度温度校正表℃时的糖度应减去得即℃时为BX亦即plato。巴林比重计:含义与勃力克斯比重计相同但规定在℃使用而不是在℃使用。糖度表本身作为产品允许出厂误差为BX放在啤酒发酵液中指示时由于CO上升的冲力使表上升而读数偏高故刚从发酵容器取出的样品须过半分钟待CO逸走后再读数糖度表一直放在发酵液中作长期观测时不读数时应设法使其全部没入发酵液中否则浮在液面的泡盖物质会干结在表上造成明显的读数偏差。三、实验器材:糖锤度计四、实验步骤:取mL麦汁或除气啤酒放于mL量筒中放入糖锤度计待稳定后从糖锤度计与麦汁液面的交界处读出糖度同时测定麦汁温度根据校准值计算℃时的麦汁糖度。若糖度较低糖度计不能浮起来可多加一些麦汁直至糖度计浮在液体中。表糖锤度与温度校正表(部分)温度BxBxBxBxBxBxBxBxBxBxBxBx℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃五、注意事项:糖锤度计易碎使用时要格外小心六、思考题:试比较勃力克斯与plato的异同。实验八啤酒主发酵一、实验目的:学习啤酒主发酵的过程掌握酵母发酵规律。二、实验原理:啤酒主发酵是静止培养的典型代表。是将酵母接种至盛有麦芽汁的容器中在一定温度下培养的过程。由于酵母菌是一种兼性厌氧微生物先利用麦芽汁中的溶解氧进行好氧生长然后利用EMP途径进行厌氧发酵生成酒精。显然同样体积的液体培养基用粗而短的容器盛放比细而长的容器氧更容易进入液体因而前者降糖较快(所以测试啤酒生产用酵母菌株的性能时所用液体培养基至少要米深才接近生产实际)。定期摇动容器既能增加溶氧也能改善液体各成份的流动最终加快菌体的生长过程。这种有酒精产生的静止培养比较容易进行因为产生的酒精有抑制杂菌生长的能力容许一定程度的粗放操作。由于培养基中糖的消耗CO与酒精的产生比重不断下降可用糖度表监视。若需分析其他指标应从取样口取样测定。三、实验器材:带冷却装置的发酵罐(LL)若无发酵装置可将玻璃缸放于生化培养箱中进行微型静止发酵。四、实验步骤:将糖化后冷却至℃左右的麦芽汁送入发酵罐接入酵母菌种(实验四共约升)然后充氧以利酵母菌生长同时使酵母在麦汁中分散均匀(充氧即通入无菌空气也可在麦汁冷却后进行一般温度越低氧在麦汁中的溶解度越大)待麦汁中的溶解氧饱和后让酵母进入繁殖期约小时后溶解氧被消耗逐渐进入主发酵。由于发酵罐密闭很难看清发酵的整个过程建议一个组在mL玻璃缸中进行啤酒主发酵小型试验。具体方法如下:、​ 洗标本缸缸口用层纱布包扎后进行高压灭菌、​ 将协定法糖化得到的麦汁加水至mL再加葡萄糖使糖度达到Bx灭菌冷却后摇动充氧沉淀将上清液以无菌操作方式到入已灭菌的标本缸中。、​ 将mL酵母菌种接入在℃生化培养箱中发酵每天观察发酵情况。、​ 主发酵:℃天→至plato时结束(嫩啤酒)。一般主发酵整个过程分为酵母繁殖期起泡期、高泡期、落泡期和泡盖形成期等五个时期。仔细观察各时期的区别。主发酵测定项目接种后取样作第一次测定以后每过或h测次直至结束。全部数据叠画在张方格纸上纵坐标为个指标横坐标为时间。共测定下列几个项目:a、糖度(用糖度表测并换算成plato)b、细胞浓度、出芽率、染色率c、酸度d、α氨基氮e、还原糖f、酒精度g、pHh、色度I、浸出物浓度J、双乙酰含量、作业要求⑴画出发酵周期中上述个指标的曲线图并解释它们的变化。⑵记下操作体会与注意点附:发酵液的取样方法若在发酵罐中发酵可从取样开关处直接取样(先弃去少量发酵液)。若无取样开关可用一灭过菌的乳胶管深入发酵池面下cm处用虹吸法使发酵液流出弃去少量先流出的发酵液然后用一清洁干燥的三角瓶接取发酵液作样品。五、注意事项:除少数特殊的测定项目外应将发酵液在两干净的大烧杯中来回倾到次以上以除去CO再经过滤后滤液用于分析。分析工作应尽快完成。实验九总还原糖含量的测定(斐林试剂法)一、实验目的:学习用斐林试剂测还原糖的方法二、实验原理:斐林试剂由甲、乙液组成甲液为硫酸铜溶液乙液为氢氧化钠与酒石酸钾钠溶液。平时甲、乙溶液分开贮存测定时才等体积混合混合后硫酸铜与氢氧化钠反应生成氢氧化铜沉淀:NaH十CuS→Cu(OH)↓十NaSO氢氧化铜因能与酒石酸钾钠反应形成络合物而使沉淀溶解。酒石酸钾钠铜络合物中的二价铜是一个氧化剂在氧化醛糖和酮糖(合称总还原糖)的同时自身被还原成一价的红色氧化亚铜沉淀:反应终点用美蓝(亚甲基蓝)来指示。由于美蓝的氧化能力较二价铜弱故待二价铜全部被还原糖还原后过量一滴还原糖立即使美蓝还原成无色的美白。三、实验器材与试剂:电炉滴定管等()斐林溶液甲液:称取g结晶硫酸铜(CuS·H)溶于mL水中如有不溶物须过滤。乙液:称取g酒石酸钾钠gNaOH溶于mL水中若有沉淀过滤即可。()%标准葡萄糖液:精确称取于℃烘至恒重的分析纯葡萄糖g用水溶解后加mL浓盐酸定容成至mL。()%美蓝指示剂:g美蓝溶于mL蒸馏水中。四、实验步骤斐林溶液的标定由于试剂的纯度不同配制时称量、定容等有误差各人所配的斐林试剂氧化能力会有差异因此有必要对斐林溶液进行校准。配制准确时斐林甲、乙液各mL可氧化mL%标准葡萄糖溶液。①预滴定:准确吸取斐林甲、乙液各mL放入mL锥形瓶中加水约mL并从滴定管加入约mL%标准葡萄糖溶液(如果斐林甲、乙液配制非常精确从理论上说应消耗mL%标准葡萄糖溶液故先加mL)将锥形瓶置电炉上加热煮沸维持沸腾分钟加入%美蓝指示剂滴在沸腾状态下以每两秒滴的速度滴入%标准葡萄糖溶液至溶液刚由蓝色变为鲜红色为止。后滴定操作应在分钟内完成整个煮沸时间应控制在分钟之内。记下总耗糖量V。②正式滴定:与预滴定基本相同只是用(V)mL标准葡萄糖代替mL葡萄糖液最后在分钟内滴定完成。试样的滴定①稀释:将样品除气后进行适当稀释以期用~mL(最好~mL)稀释液使滴定完成。一般麦汁稀释倍左右啤酒主酵液稀释倍左右。②滴定:基本同上也分预滴定和正式滴定。只不过用样品稀释液代替标准葡萄糖液由于预滴定时不知道需要多少毫升稀释液因此误差较大。正式滴定时先加入比预滴定少mL的稀释液。正式滴定至少进行次。计算总还原糖量以mL样品中含有的葡萄糖克数来表示五、注意事项:()​ 指示剂美蓝本身具有弱氧化性要消耗还原糖.所以每次用量应保持一致。()​ 次甲基蓝被还原为无色后易被空气氧化又显蓝色所以滴定过程应保持沸腾状态使瓶内不断冒出水蒸汽以防空气进入。()​ 反应过程中不能摇动锥形瓶沸腾已可使溶液混匀。()​ 测定时须严格控制反应液体积以保持一致的酸碱度。因此要控制电炉火力及滴定速度。六、思考题:为什么要进行预滴定?实验十α–氨基氮含量的测定一、实验目的:学习α–氨基氮含量的测定方法控制麦汁或啤酒质量。二、实验原理:α–氨基氮为α–氨基酸分子上的氨基氮。水合茚三酮是一种氧化剂可使氨基酸脱羧氧化而本身被还原成还原型水合茚三酮。还原型水合茚三酮再与末还原的水合茚三酮及氨反应生成蓝紫色缩合物颜色深浅与游离α–氨基氮含量成正比可在nm下比色测定。三、实验器材与试剂:分光光度计电炉等()显色剂称取gNaHPO·HOgKHPOg水合茚三酮g果糖用水溶解并定容至mL(pH~)棕色瓶低温保存可用两周。()碘酸钾稀释液溶g碘酸钾于mL水中加mL%乙醇。()标准甘氨酸贮备溶液准确称取g甘氨酸用水溶解并定容至mL℃保存。用时倍稀释。四、实验步骤()样品稀释适当稀释样品至含~μgα–氨基氮mL(麦汁一般稀释倍啤酒倍啤酒应先除气)。()测定取支mL比色管其中支吸入mL甘氨酸标准溶液另支各吸入mL试样稀释液剩下支吸入mL蒸馏水。然后各加显色剂mL盖玻塞摇匀在沸水浴中加热l分钟。取出在℃冷水中冷却分钟分别加mL碘酸钾稀释液摇匀。在分钟内以水样管为空白在nm波长下测各管的光密度。计算:α–氨基氮含量(μgmL)=(样品管平均OD标准管平均OD)××稀释倍数说明:式中(样品管平均OD标准管平均OD):表示样品管与标准管之间的α–氨基氮之比:标准管的α–氨基氮浓度(μgmL)即(×)×五、注意事项:()必须严防任何外界痕量氨基酸的引入所用比色管必须仔细洗涤洗净后的手只能接触管壁外部移液管不可用嘴吸。()测定时加入果糖作为还原性发色剂碘酸钾稀释液的作用是使茚三酮保持氧化态以阻止进一步发生不希望的生色反应。()深色麦汁或深色啤酒应对吸光度作校正:取mL样品稀释液加mL蒸馏水和mL碘酸钾稀释液在nm波长下以空白做对照测吸光度将此值从测定样品吸光度中减去。、​ 思考题:啤酒色泽是否会对结果产生影响?附:分光光度计的使用:现以SPUV紫外可见分光光度计为例介绍使用方法。a)​ 接通电源预热分钟使仪器进入热稳定状态仪器开始自检b)​ 自检结束后仪器自动停留在nm处并自动调T和T当仪器显示“”“T”即进入测试状态c)​ 按方式键(MODE)将测试方式设定为吸光度方式仪器显示“XXXnmXXXXAbs”d)​ 按波长设置键至所需要波长如nme)​ 将参比溶液和被测溶液分别倒入比色杯中插入比色槽中盖上样品室盖f)​ 将参比溶液推入光路中按“T”键调整“Abs”g)​ 将被测溶液推入光路中读取显示器上的吸光度值h)​ 搞好清洁卫生工作。注意:比色杯贵重应格外小心。实验十一酸度和pH的测定一、实验目的:掌握酸度和pH的测定方法监测啤酒发酵的进程。二、实验原理:总酸是指样品中能与强碱(NaOH)作用的所有物质的总量用中和每升样品(滴定至pH)所消耗的NNaOH的毫升数来表示,但在啤酒发酵液的测定过程中常用中和mL除气发酵液所需的NNaOH的毫升数来表示。啤酒中含有各种酸类约种以上生产原料、糖化方法、发酵条件、酵母菌种都会影响啤酒中的酸含量。其中包括挥发性的(甲酸、乙酸)低挥发性的(C、C、异C、异C、C、C、C等脂肪酸)和不挥发性的(乳酸柠檬酸琥珀酸苹果酸以及氨基酸核酸酚酸等)各种酸类。适宜的pH和适量的可滴定总酸能赋于啤酒以柔和清爽的口感同时这些酸及其盐类也是酒中重要的缓冲物质有利于各种酶的作用。由于样品有多种弱酸和弱酸盐有较大的缓冲能力滴定终点pH变化不明显再加上样品有色泽用酚酞做指示剂效果不是太好最好采用电位滴定法。三、实验器材与试剂:自动电位滴定仪或普通碱式滴定管pH计。()molLNaOH标准溶液(精确至molL)()%酚酞指示剂:g酚酞溶于的中性酒精(普通酒精常含有微量的酸可用molLNaOH溶液滴定至微红色即为中性酒精)中定容至mL。四、实验步骤.酸度测定取mL除气发酵液置于烧杯中加入磁力搅拌棒放于自动电位滴定仪上插入pH探头逐滴滴入molLNaOH标准溶液直至pH记下耗去的NaOH毫升数。若无自动电位滴定仪可用下述酸碱滴定方法。取mL除气发酵液置于mL三角瓶中加mL蒸馏水再加滴酚汰指示剂用molL氢氧化钠标准溶液滴定至微红色(不可过量)经摇动后不消失为止记下消耗的氢氧化钠溶液的体积VmL计算总酸(molLNaOH毫升数/mL样品)=MV式中M为NaOH的实际摩尔浓度V为消耗的氢氧化钠溶液的体积.pH测定现以PHSC型精密pH计为例来说明pH的测定方法。PHSC型pH计是一种精密数字显示pH计它采用位半十进制LED数字显示。在使用前应在蒸馏水中浸泡小时。接通电源后先预热分钟然后进行标定。一般说来仪器在连续使用时每天要标定一次。()​ 选择开关旋至pH档()调节温度补偿至室温()把斜率调节旋纽顺时针旋到底(即调到位置)()将洗净擦干的电极插入pH的缓冲液中调节定位旋纽至()用蒸馏水清洗电极擦干再插入pH的标准缓冲液中调节斜率至pH()重复()()直至不用再调节定位和斜率两旋纽为止。()清洗电极擦干将电极插入发酵液中摇动烧杯使均匀接触在显示屏中读出被测溶液的pH值。()关闭电源清洗电极并将电极保护套套上套内应放少量补充液以保持电极球泡的湿润切忌浸泡于蒸馏水中。五、注意事项发酵液中的二氧化碳必须彻底去除。molLNaOH必须经过标定保留位有效数。六、思考题:酸碱滴定时为什么要用水稀释?水的酸碱度对滴定结果有什么影响?实验十二比重的测定一、实验目的:了解比重的测定方法监测发酵过程中浸出物浓度的变化。二、实验原理:在一定温度下各种物质都有一定的比重。当物质纯度改变时比重也随着改变故测定比重可检验物质的纯度或溶液的浓度。如在啤酒发酵中随着糖分的消耗、酒精和CO的产生比重会逐渐下降因此可通过测定发酵液的比重来了解发酵过程。溶解于水中的固体物质称为固形物以重量百分浓度表示。在啤酒发酵液中固形物的含量常以蔗糖的重量百分比来表示。但是发酵液固形物还包括许多非糖成分这些非糖成分对溶液比重的影响与蔗糖不一样但为了方便起见可假定非糖物质对溶液比重的影响程度和蔗糖相等。因此根据比重查知的固形物含量实际上只是一个近似值。麦汁和啤酒发酵液样品℃的比重规定为:在空气中℃样品与同体积℃水的重量之比值。三、实验仪器:测定比重常用的是比重瓶和比重计。比重计方便但精确度低(见实验四)比重瓶精确但测定很费时。比重瓶有多种的形状常用的规格为mL比较好的一种是带有特制温度计并具有磨口帽小支管的比重瓶(见图)。比重以相同温度下同体积的溶液和纯水之间的重量比来表示。比重瓶示意图四、实验步骤:()空瓶称重:将比重瓶洗干净后吹干或低温烘干(可用少量酒精或乙醚洗涤)冷却至室温精确称重至mg。()称水重:将煮沸分钟并冷却至~℃的蒸馏水装满比重瓶(注意瓶内不要有气饱)。装上温度计。立即浸入±℃的恒温水浴中让瓶内温度计在℃下保持分钟取出比重瓶用滤纸吸去溢出支管外的水立即盖上小帽室温下平衡温度后擦干瓶壁上的水精确称重。()样品称重:倒出蒸馏水用少量除气样品洗涤后加入冷却至~℃的样品按()测得样品重量。()比重计算:比重瓶和样品重空瓶重样品比重=比重瓶和蒸馏水重空瓶重()查表:查阅比重浸出物对照表。啤酒外观浓度和实际浓度的测定成品啤酒或发酵液中所含的浸出物的重量百分数称为浓度。由于啤酒和发酵液中有部分酒精酒精比水轻故采用比重法测得的浓度要稍低于实际浓度习惯上称为外观浓度。将酒精分和CO除去后测得的浓度称为实际浓度。因此实际浓度较为准确并可以此来计算原麦芽汁浓度。()外观浓度的测定:同上。()实际浓度的测定:在普通天平上用干燥的烧怀称取已除CO的发酵液或啤酒样品g置℃水浴中蒸发酒精蒸至原体积的/时冷却加蒸馏水至内容物g充分混匀用比重瓶准确测定℃时的比重查表求得实际浓度。加热过程中可能有蛋白质沉淀测定比重时不必滤出。有时为简化操作常将测定酒精分时蒸馏下的残液加水至原重量作测定实际浓度之用(见实验十)。该法由于沸腾时间较长对测定结果有一定影响。我国部颁标准规定:度啤酒实际浓度不低于%度啤酒不低于%。表比重浸出物浓度对照表(部分)比重浸出物比重浸出物比重浸出物比重浸出物注:比重为℃时测得浸出物指克样品中的克数。五、注意事项:、​ 比重瓶易碎请格外小心特别是小帽。、​ 要檫干比重瓶外壁特别是连接处的水分六、思考题:若无℃恒温水浴怎样尽可能测准比重?实验十三酒精度的测定及原麦汁浓度的计算一、实验目的:掌握酒精含量的测定方法监测啤酒质量二、实验原理:用小火将发酵液或啤酒中的酒精蒸馏出来收集馏出液测定其比重根据比重酒精度对照表可查得酒精含量。三、实验器材:电炉调压变压器铁架台mL锥形瓶冷凝管mL量筒或容量瓶。四、实验步骤:、酒精度的测定()​ 在已精确称重至g的mL三角烧瓶中称取lg除气啤酒再加mL水()​ 按上冷凝器冷凝器下端用一已知重量的mL容量瓶或量筒接收馏出液。若室温较高为了防止酒精蒸发可将容量瓶浸于冷水或冰水中。()​ 开始蒸馏时用文火加热沸腾后可加强火力蒸馏至馏出液接近mL时停止加热。()​ 取下容量瓶于普通天平上加蒸馏水至馏出液重g混匀。()​ 用比重瓶精确测定溜出液比重。()​ 查比重和酒精对照表求得酒精含量。我国部颁标准规定度啤酒的酒精含量不低于度啤酒的酒精含量不低于%。、实际浓度的测定()​ 将上述蒸去酒精的mL三角烧瓶冷却至室温。()​ 加蒸馏水将蒸馏残液调整至g。()​ 按实验九测定蒸馏残液在℃时的比重。()​ 查比重浸出物对照表得出实际浓度。、原麦芽汁浓度的计算原麦芽汁浓度是指发酵之前的麦芽汁浓度。生产中为检查发酵是否正常常根据啤酒的实际浓度来推算原麦汁浓度和发酵度。根据巴林氏的研究在完全发酵时每g浸出物可生成g酒精gCO和g酵母。若测得啤酒的酒精含量(重量百分比)为A.实际浓度为n则克啤酒发酵前含有浸出物的克数应为:A×.十n生成A克酒精即从原麦汁中减少A×克浸出物(CO和酵母沉淀物)。要生成克啤酒需原麦汁为:(十A×.)克原麦汁浓度P为:P=(A×.十n)(十A×.)我国部颁标准规定:度啤酒原麦汁浓度为~.%度啤酒为~。若计算所得的原麦汁浓度与发酵之前的麦汁浓度相符说明发酵正常若计算所得的原麦汁浓度与发酵之前的麦汁浓度不符说明发酵不正常可能有野生酵母或细菌污染。、发酵度的计算麦芽汁发酵后浸出物减少的百分数称为发酵度。有两种:()外观发酵度=(Pm)P×%式中P原麦芽汁浓度m啤酒的外观浓度()实际发酵度=(Pn)P×%·n啤酒的实际浓度浅色啤酒根据其实际发酵度可分为三个类型低发酵度:%左右。往往使啤酒保存性差。中发酵度:%左右。较合适。高发酵度:%左右。较合适。五、注意事项:、​ 蒸馏时火力不要太旺最好有调压器调节电压。、​ 测真正浓度时最好用℃水浴将酒精蒸去。六、思考题:是否可以在馏出液接近mL时停止蒸馏?如果馏出液大于mL会对结果产生怎样的影响?表比重酒精度对照表比重酒精度比重酒精度比重酒精度比重酒精度

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