氨基酸的高效液相色谱分析

文献综述 氨基酸的高效液相色谱分析 朱曙东 赵昇皓 （徐州医学院生物化学研究室 徐州 221002) 1 前 言 氨基酸分析是生命科学研究中最重要的技术之 一1958年，Spackman等[1,2]首先介绍了用离子交换 色谱与柱后茚三酮衍生结合的方法分析蛋白质水解 生成的氨基酸，同时提出了构建氨基酸自动分析仪 的细节，建立了传统氨基酸自动分析技术。其后，传 统氨基酸分析随着衍生方法、柱载体化学、高效液相 色谱（HPLC）仪器学的迅猛发展，分析速度、灵敏度 和自动化程度不断提高[3]。近十年来，反相高效液相 色谱（RP-HPLC）与各种柱前衍生相结合的氨基酸 分析技术发展迅速，显示出各自特有的优越性，构成 了具有广泛适用性的现代氨基酸分析技术。本文拟 就这一发展加以综述，并系统阐述各种氨基酸 HPLC分析方法的优缺点，为研究工作和实际应用 提供参考。 大多数氨基酸无紫外吸收和荧光发射特性，标 准折射探测仪对氨基酸检测也无足够的灵敏度。为 提高分析检测灵敏度和分离选择特性，通常将氨基 酸衍生。衍生方式有柱前衍生法与柱后衍生法。 2 柱后衍生 传统的氨基酸分析技术用离子交换色谱分离氨 基酸，柱后与茚三酮反应，三十余年来迭经改进灵敏 度已提高到200～500pmol，分析时间约减至1h[3]。 此法通常需要专门的仪器。 用荧光胺（Fluram）[]代替茚三酮能增加氨基酸 分析灵敏度（Pro等亚氨基酸除外），一般几个pmol 便可进行 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 分析。邻苯二甲醛（OPA）比荧光胺更 常用，但OPA不直接与Pro反应，需先将后者氧化 （如用次氯酸钠）开环后方可衍生[5]。OPA法检测极 限一般可达5～?10pmol(Pro 50～?100pmol[。另 一个柱后衍生试剂戊烷-2,4-二酮／甲醛7灵敏度比 OPA法低一个数量级，且Pro.Tyr相对显色较浅。 柱后衍生法的主要缺点有：(1)色谱仪器较复 杂，需要额外的泵和反应器以保证洗脱液与柱后试 剂均匀混合。这样会使仪器局限于一类分析。（2）在 茚三酮方法中，单波长检测受流速、温度、缓冲液变 化的影响大而只在nmol以上方为可靠，常需双波长 检测，使仪器更加复杂、昂贵。(3)OPA法最大缺陷 是不能与亚氨基酸直接反应，而间接氧化步骤需要 在Pro被洗脱的瞬间变化柱后试剂，或用不同的试 剂分别反应一次。前者不易把握时间，不易校准Pro 与邻近氨基酸相对显色值；后者则进一步降低了原 本相对其它氨基酸已低一个数量级的Pro检测灵敏 度。 3 柱前衍生 从色谱分析 角度看，高效离子交换色谱 (HPIEC)氨基酸分析法没有充分发挥高压液相的优 势：易塑的离子交换珠比坚硬的无机材料压缩性大， 流动相流速的变化不与施加的压力成比例，无法充 分实现流动相的高速。另外，离子交换色谱的流动相 也不适于具有高灵敏度的荧光检测。随着柱填料的 发展，RP-HPLC弥补了上述缺点，使氨基酸分析发 生了根本的变化。其主要特点是：(1)采用可塑性小 的硅胶等材料作载体，有利于流速的增加。（2）载体 表面饰有C18、C8或其它疏水基团作固定相，能分辨 分子结构的细小差异，分辨率高。(3)反相色谱柱性 能稳定，流动相易平衡。(4)反相洗脱避免了离子交 换色谱中流动相对荧光检测的干扰。因而与柱后衍 生离子交换法相比，RP-HPLC分析方法更加快速、 灵敏。而且与局限于氨基酸分析的自动分析仪不同， HPLC仪适用性极广。表1是两类氨基酸分析技术的 比较。 RP-HPLC 要求 对教师党员的评价套管和固井爆破片与爆破装置仓库管理基本要求三甲医院都需要复审吗 将氨基酸在柱前转化为适于反 相色谱分离并能被灵敏检测的衍生物。迄今已报道 本文收稿日期：1992年9月19日，修回日期：1993年5月2日 的柱前衍生试剂很多，主要有OPA、DANSYL-Cl、 DANSYL-Cl、FMOC-Cl、PITC（见表2）、NBD-Cl以 及ILITC等，现依次讨论这七类衍生试剂与分析方 法如下。 表1 两类氨基酸分析技术的比较 3.1 邻苯二甲醛(OPA) OPA衍生法产生于1971年[8]，可能是目前应用 最广泛的氨基酸柱前衍生方法。OPA与巯基试剂， 通常是与β巯基乙醇（ MCE）连用，在碱性条件下 与一级胺反应迅速（30s）产生荧光产物 1-巯代-2- 烷基-异吲哚(λEX=340nm，EM=450nm)[9]。衍生 物很适于 HPLC分离。βMCE作巯 基试剂时 Asn/Ser、Val/Met分辨率较差[10]，近来有用3-巯基 丙酸（3-MPA）替代它，借引入一个α羧基，使这两 对氨基酸衍生物疏水性相对减弱，再用乙腈替代甲 醇，即可使其完全分离[1。 采用上述改进条件，可在13min内在亚pmol 水平分辨二十三种主要生理氨基酸[1。高灵敏度要 求的分析可用微孔柱(microbore column)，检测极限 达5fmol[2]。但分析时的低流速（50～80μL/min）对 梯度混合泵要求很高。使用另一种超敏技术窄径柱 (narrowbore column)1.8mmi.d．时检测极限约为 150fmol[13]。近年来，有人用电化学法检测OPA氨 基酸衍生物，灵敏度达到20～?50fmol[4]。也有关于重 要的修饰氨基酸分析的报道[15] OPA法主要缺点有：(1)亚氨基酸不能与其直 接反应，需先氧化开环，如前所述。(2)荧光产物不稳 定。虽然可使用自动进样器在色谱分析前混合样品 与试剂，但技术较复杂，难以推广。 3.2 丹酰氯(DANSYL-Cl) Tapuhi等[6]的丹酰化方法（DNS法）较简单， 只需将 DANSYL-Cl加入溶于pH9.5碳酸氢钾缓 冲液的氨基酸中，室温暗反应35～?50min即可完成 衍生。早先报道衍生物产率是依赖于DANSYL-Cl 与氨基酸浓度的不同比例的[17]，但Tapuhi等[1]用 碳酸钾代替碳酸钠，并用乙腈代替丙酮与水，使 DANSYL-Cl与氨基酸浓度比例变化1000倍，结果衍 生程度并无变化。DANSYL-Cl与包括亚氨基酸在内 的所有氨基酸均起反应，与His形成多种衍生物，与 Lys、Tyr、Cys2形成双丹酰衍生物，与其它氨基酸则 形成单丹酰衍生物[9]。不同修饰氨基酸成分分析亦 有报道[20。 DNS法的缺点在于：(1)反应活性较差，速度 慢，35min才能达到最大产率。（2）衍生物荧光易被 洗脱缓冲液猝灭，故本法常用紫外检测，灵敏度较低 (250nm处仅有l00pmol[21]。值得注意的是，此法 Cys2线性特别好[12]。 表2 主要柱前氨基酸衍生试剂的性质 3.3 磺酰氯二甲胺偶氮苯（DABSYL-Cl） 该衍生法（DABS法）与DNS反应一样同属磺 酰卤化物的烷基化修饰。所不同者，(1)DABSYL- AA在可见光区436nm处检测灵敏度（1pmol）与荧 光检测（0.5pmol[22]）近似，又可避免使用紫外检测 时流动相中微量UV吸收杂质的干扰，因此更为常 用[23]。近有报道利用光热折射器检测，灵敏度更见 提高[24。（2）衍生物极其稳定，在碳酸氢钠溶液中室 温下可保持一个月以上[25。(3)衍生方法简单、快 速。 此法早期不完善，主要缺点：DABSYL-Cl与 His、Lys、Tyr、Cys2分别形成多种衍生物[26]，它们与 其它单衍生物共洗脱，而且多种衍生物的产生不一 致，随DABSYL-Cl/氨基酸比例而异，因此未知样品 的定量分析几乎不可能。后来，Chang等人[22]控制 DABSYL/氨基酸分子比为4/1～?80/1，使上述氨基 酸只形成一种衍生物。1985年Stocchi等[23]通过在 有机流动相中引入异丙醇首次在室温条件下将包括 Asn、Gln、CmCys、Trp在内的约三十种氨基酸及其 副产物充分分离。目前DABS法已拓展，可对包含各 种重要修饰氨基酸在内的复杂氨基酸进行分 析[24,27,28]。 3.4 氯甲酸芴甲酯(FMOC-Cl) 在pH为7.7时反应生成稳定衍生物一 级、二 级氨基酸全可测，荧光检测(λEx＝260nm，?EM= 310nm)灵敏度可达fmol水平。 缺点是：(1)与His形成单、双衍生物的比例不 稳定，影响定量。(2)FMOC-Cl及其水解产物 FMOC-OH有荧光干扰。用戊烷抽提可去除干扰，并 能终止反应和防止FMOC-AA自发降解[29]。但抽提 效率每步约70%，只能部分解决问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 。亦有报道[30] 加入胺基金刚烷与过量的FMOC-Cl反应，可去除 干扰，替代萃取步骤并简化衍生。 此法分析生理氨基酸标准混合物需23min，分 析额外氨基酸只需要加长柱高和增加分析时间就能 得到满意的分离效果（如瓜氨酸与Hpro）[29,31]。其它 重要修饰氨基酸的分析亦有报道[32]。Tyr与Cys2衍 生物荧光极易猝灭，不能用此法测定[3。 3.5 异硫氰酸苯酯(PITC) 苯乙内酰硫脲氨基酸衍生物（PTH-AA）用于蛋 白质顺序分析已三十多年[3，此衍生物非常稳定， 适于RP-HPLC分离，分析速度快（10min）。但用此 法衍生时一些氨基酸如Ser、Thr、Arg、His需用与大 多数氨基酸不同的方法处理。步骤复杂，时间甚长， 有时需要一整天，很不理想。目前在作氨基酸组分分 析时，已被分析苯氨基硫甲酰衍生物（PTC-AA）的 PTC法替代。 PTC-AA是产生PTH-AA的中间产物，只在 Koop等确定了它的稳定性后才直接用于氨基酸分 析。与 PTH法相比，PTC法[33,36]省略了后续步骤， 简化了衍生方法，衍生方便、快速，只需室温反应 20min，两步快速蒸发即可完成；衍生物单一、稳定， -20℃可贮存数月，4 水溶液3天；分析时间也短 （水解氨基酸仅需12min）；结果准确，试剂、副产物、 溶剂等多种干扰因素可通过快速蒸发去除；紫外检 测（254nm）灵敏度也高，可达1pmol；一、二级氨基 酸均可检测。是目前氨基酸分析中最具有吸引力的 分析方法。本法已拓展至磷酸氨基酸[37、硫酸氨基 酸[6等修饰氨基酸与不同组织氨基酸分析[39]。最近 用乙醇梯度系统代替传统有毒、难得、昂贵的乙腈取 得成功，有助于扩大此法的实际应用[4。 3.6其它重要衍生方法 4-氯-7-硝基苯-2-噁f-1，3-吖惯唑?(NBD-Cl)、4-异 硫氰酸邻苯二酰肼（ILITC）是两种新近发展起来很 有前途的氨基酸衍生试剂。虽然色谱分析最优条件 需要完善，但已有充分证据表明这两种方法各有其 显著特点。 NBD系列包含多种可与氨基酸衍生进行分析 的试剂[1]。Anoff[12首先应用NBD-Cl作测定胶原 蛋白水解物中Hpro的柱前衍生试剂。Watanabe[] 不久发现NBD-F在反应活性与产率方面更优越。二 者均可与一、二级氨基酸起反应；衍生迅速，在 pH 8.0和60 条件下5min即可完成；荧光检测（λE= 470nm，λEM=530nm）灵敏度高，检测极限小于20 fmol，在1pmol水平可作常规分析。常液洗脱有效分 离了多种氨基酸衍生物，仅有的NBD-OH试剂峰并 不干扰分析。预计梯度洗脱可将各种复杂的混合氨 基酸完全分开。这类试剂一般对二级氨基酸反应活 性最大，尤其适合于对它们的灵敏度检测[4。另外， 将氨基酸经HPIEC后与NBD-F衍生可成功地分析 各种氨基酸与亚氨基酸[45]，这个特点是OPA、荧光 胺等柱后衍生试剂所没有的。存在的缺点是Trp不 可测定。 1986年Spurlin[4]报道的ILITC有类似于 PITC的异硫氰基团，因此柱前衍生、色谱分析与 PTC法类似。ILITC还有一异露明诺基团在柱后与 H2O2、Fe(CN)36反应化学发光，扩增了显色信号。因 此用它衍生除具有PTC法的一般优点外，检测灵敏 度大为增加，检测极限低于20fmol，在1pmol水平 可作常规分析。已有报道常液洗脱能使十二种混合 氨基酸有效分离。 其它初步报道可用于氨基酸柱前衍生RP- HPLC分析的试剂还有1-naphthylisocyanate (λEx= 238,305nm，EM=385nm或紫外222nm检测。衍生 物稳定）[]，diethyl ethoxymethylenemalonate(280 nm检测，室温稳定，35min内可将包含Pro与Cys2 在内的十七种氨基酸分开，检测极限为3pmole)[]， 1-fluoro-2，4-dinitrophenyl-5-L-alanine amide (340 nn 检测，110min分开包括Pro、Cys2在内的二十种 氨基酸，检测极限为50pmol，方法简单）[4]等。 4 微粒柱、窄径柱与氨基酸分析 在氨基酸分析中常用反相C18、C8、CN柱与离 子交换柱。色谱柱的硅胶粒度一般控制在5～?10μm. 柱长选用15～?30cm，柱内径4.6mm左右。近年来， 为了提高分析速度与灵敏度，对柱填料作了深入的 研究改进。其一是降低硅胶的粒度（微粒柱），例如使 用3m粒度的硅胶能提高柱效，缩短分析时间，减少 溶剂消耗。其二是采用窄径柱（内径≤3mm）。在柱 长一定的条件下，检测灵敏度与柱径的平方成反 比[50]，因此窄径柱特别适用于灵敏度要求高的分 析。例如分析PTH-AA时，将柱径由4.0mm缩至 2.0mm，灵敏度可增加4倍[51]。如用毛细管柱（capil- lary column,0.4mm i.d.）则可更大地提高检测灵 敏度。用0.32mm i.d．毛细管柱（粒度7m，孔径300 ，C8），PTH-AA在25fmol时即可检出[5]。窄径柱 还能减少昂贵、有毒的有机溶剂用量的80? 85%[13]。但微粒柱与窄径柱易污染、寿命短，需注意 保护（如使用precolumn、guard column、scavenger column等）。此外，窄径柱反压较高，对控制流速及 梯度的泵系统的准确性要求很高。但同流行的观 点[12]相反，窄径柱可能并不需要检测器有特别小的 flow cell或特别短的光通道作为先决条件，因而可 与常规检测器配套使用[]。 5 结 语 与传统的柱后衍生法相比，氨基酸柱前衍生 RP-HPLC分析法的分析灵敏度显著提高，分析时间 大为缩短，仪器一机多用降低了检测费用，因而正在 逐渐取代传统的离子交换方法。据统计，现在80％的 HPLC工作是采用反相柱完成的。 常用的五种柱前衍生氨基酸分析法各具特点。 简便、快速的衍生适于选有OPA法（亚氨基酸、Cys2 除外），但常需要额外的自动进样装置。DNS法则可 测定亚氨基酸，并且最适于测定Cts2.但反应时间 较长，且常用的紫外检测灵敏度远逊于其它方法。 DABS法虽可测定亚氨基酸及CYS2，但需特别注意 控制影响定量的各种干扰峰。FMOC法可测定亚氨 基酸，但不能检测Cys2，此外个别氨基酸如His的定 量不够准确，试剂干扰因素难以完全去除。测定亚氨 基酸时用此法或用FMOC结合OPA法最佳[53。 PTC法优点甚多，但灵敏度稍逊[12]。总之，用何方法 需要根据衍生速度与简便程度、分析速度与灵敏度、 检测亚氨基酸与Cys2能力、干扰因素、重复性等各 项指标与实际要求作出选择。 关键词 高效液相色谱，氨基酸，柱前衍生，柱后衍生 Key words high performance liquid chromatography, amino acid,pre-column derivatization, post-column derivazation 参 考 文 献 1 Spackman D H.Stein W H.Moore S.Anal Chem. 1958;30:1185 2 Spackman D H.Stein W H.Moore S.Anal Chem, 1958;30:1190 3 Hirs C H W.Methods in enzymology(Vol.91).New York:Acdemic Press,1983:3 4 Georgiadis A G,Coffey J W.Anal Biochem,1973;56: 121 5 Bohlen P,Mellet M.Anal Biochem.1979;94:313 6 Dong M W.Gant J R.J Chromatogr.1985;327:17 7 Kakehi K.Konishi T.Sugimoto 1eal.J Chromatogr. 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有高水平的论文，而且能积极参加会议学术讨论。评选方法：先由各地色谱学术组织初审、推荐，后由复审稿专 家组确定候选论文名单，再由会议评选产生。 本次会议论文审稿，仍由各地色谱学术组织负责初审，会议筹备组组织复审，因此，（1有地方色谱学术组 织的地区的投稿者，务必于1994年9月10日前（以邮戳为准）将征文摘要交当地色谱学术组织（详见各地征文投 寄单位一览表）。各地色谱学术组织，务必于1994年10月20日前将审后的征文摘要、初审意见和推荐的优秀论 文、推荐意见以及不拟录用的论文摘要一并寄到会议筹备组— 116011大连市中山路161号中科院大连化物 所任启振收；（2）无地方色谱学术组织的地区和虽有地方色谱学术组织但遇有特殊情况（有充分理由）者，可于 1994年10月20日前（以邮戳为准）直接投寄到会议筹备组。无论寄给地方色谱学术组织还是寄给会议筹备组的 征文摘要，一律用挂号寄出，并务必在稿件上写明“十次色谱会征文”字样，以免丢失或与其他稿件混淆；（3）请 投稿者在投寄搞件的同时，每份稿件汇给审稿单位审稿费15元，各审稿单位出具报销收据；(4)逾期的稿件和 有地方色谱学术组织但无充分理由而直接寄到会议筹备组的稿件，以及未汇审稿费的稿件，概不受理（各地征 文投寄单位一览表见第31页）。 中国化学会色谱专业委员会 1994年1月20日 中国分析测试协会色谱学会 （下转第31页） 中 国 色 谱 学 会