知识拓展第二十四章 利尿药和脱水药

SHAPE \* MERGEFORMAT 第二十四章 利尿药和脱水药 水通道的生物学及可能的调节药物 第一节 体内水的转运和水通道的发现 水是细胞维持正常的生理功能不可缺少的组成部分。在消化、呼吸、体温调节、毒物的清除以及神经内环境稳定等许多生理活动中都存在水的跨膜转运。 四十年前，人们一直认为水的跨膜转运是通过简单扩散完成的。水分子通过磷脂双分子层的活化能Ea约为10cal/mol，然而有研究发现水通过红细胞膜的活化能Ea小于5cal/mol。人们猜测，红细胞膜 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 面可能存在介导水转运的孔道，因此能在如此低的能量下完成水的转运。 二十年以前, 研究发现晶状体的内环境稳定依赖于一种存在于晶状体纤维细胞细胞膜上特殊通道蛋白，经过鉴定该蛋白的分子量为26kDa，属于主体内在蛋白（Major intrinsic protein, MIP），具有亲水性。氨基酸序列测定的结果表明，它具有六个跨膜结构，五个长度不同的襻，其中三肽基元序列天冬酰胺-脯氨酸-丙氨酸（Asn-Pro-Ala，NPA）存在于两个最长的襻中，蛋白的C末端和N末端具有同源性。这种蛋白的结构与现在所认识的水通道蛋白结构具有相似性，目前也将该蛋白称为水孔蛋白-0（Aquaporin-0,简称AQP0）。它是水通道最早的雏形。但是当时并没有认识到它有水通道的功能。 直到十年前，Agre及其同事在对红细胞Rh血型抗原核心多肽32kDa的纯化时，从人红细胞膜中意外发现一种分子量为28kDa，含有亲水性氨基酸的未知多肽。这种蛋白存在的形式有两种： 一种为非糖基化形式，分子量为28kDa；另一种为N-糖基化形式，分子量为40-60kDa。研究者起初设想为Rh抗原的蛋白分解物，采用兔抗血清反应，表明与Rh抗原无关。这种蛋白最初被命名为CHIP28（28kD Channel-forming integral membrane protein），即现在的水孔蛋白1（Aquaporin-1,AQP1）。当时该蛋白的功能尚未明确。后来，他们完成了对CHIP28的分子克隆，阐明了其cDNA的分子组成。1991年10月，他们又成功地完成了对该蛋白的功能鉴定，将这种蛋白的编码序列插入到非洲爪蟾的β珠蛋白cDNA的5’和3’非翻译序列中构成表达构建，经体外转录得到cRNA，并将其注射到非洲爪蟾卵母细胞中（Xenopus laevis oocyte），在低渗溶液中观察细胞体积的变化。结果发现注射卵母细胞表达CHIP基因后细胞体积增加，当达到30%～50%时，全部破裂。 以上实验表明，CHIP28参与了水的转运。现在，水通道蛋白又可称为水孔蛋白（Aquaporins，AQPs）。CHIP28 是第一个被证实的水通道蛋白，故称为AQP1。Agre由于最早发现并证实了细胞膜水通道的功能而获得2003年诺贝尔化学奖。现在的研究发现，在哺乳动物中有至少11种AQPs亚型，在植物、微生物、脊椎动物和无脊椎动物中已经发现了200多种水通道亚型。 目前认为，水的跨膜转运有两种基本方式：（1）穿越膜脂质双分子层的简单扩散；（2）水通道介导的水转运。 （一）穿越膜脂质双分子层的简单扩散 所有组织细胞膜都允许水的简单扩散。不同组织，其扩散通透性系数差异不大。在等渗条件下，采用核磁共振或同位素技术，可以检测到水的简单扩散。水的扩散通透性不受药理学控制，但膜脂质的分子组成则影响水的简单扩散；在高温条件下，当脂质流动性增加时，会产生大量水的转移。 （二）水通道介导的水转运 水通道是水分子在溶液渗透压梯度的作用下跨膜转运的主要途径。借助水通道，水可以由低渗向高渗溶液中转运。 第二节 水通道的分类 目前发现在哺乳动物中发现的11种水通道蛋白，分别命名为AQP0、AQP1、AQP2、AQP3、AQP4、AQP5、AQP6、AQP7 、AQP8、AQP9和AQP10。按其功能，哺乳类动物AQPs可以分为两类(见图1)。第一类，主要包括AQP0、 AQP1、 AQP2、AQP4、AQP5和AQP6，只能通透水，属于经典的选择性水通道，英文名称为water-selective channels (或orthodox aquaporins)。第二类，主要包括AQP3、 AQP7和AQP9, 对水有高通透性，同时也能通透甘油、尿素和其他的小分子，英文名称为Aquaglyceroporins。从种系上讲，这两类AQPs功能的明显差异可能起源于细菌，因为细菌既具有一个水通道基因(aqpZ in E.coli)，也存在一个甘油转运子基因(glpF in E. coli)。 但是这些AQPs在生理学上的差别是否与结构的差别有关还不十分清楚，如AQP8位于水选择型和甘油渗透型之间，其功能上的定义还未明确。 图1 存在于哺乳动物水通道（Mammalian aquaporins）和大肠杆菌类水通道（Escherichia coli AqpZ and GlpF）种类和分类 采用Northern blotting、RT-PCR、Western blotting、原位杂交和免疫组化方法确定了各种水通道亚型的组织分布和细胞定位，见表1。 表1 水通道在哺乳动物中的组织分布和功能 Immunohistochemical localization Possible function Feature AQP0 Lens fiber cell AQP1 Erythrocyte Capillary endothelium Water transport across vessel wall Kidney proximal tubule, thin descending limb of Henle’s loop, vasa recta Urinary concentration Cholangiocyte Bile modification Efferent duct Sperm concentration Ampulla of vas deferens Sperm concentration AQP2 Kidney collecting duct Urinary concentration Regulated by vasopressin Ampulla of vas deferens Sperm concentration AQP3 Kidney collecting duct Urinary concentration Permeable to glycerol and urea Epithelium of urinary tract Osmoprotection Epithelium of respiratory system Osmoprotection Epithelium of digestive tract Osmoprotection Epidermis of skin Osmoprotection Corneal epithelium Osmoprotection Conjunctival epithelium Osmoprotection Meningeal cells Transfer of cerebrospinal fluid AQP4 Kidney collecting duct Urinary concentration Gastric parietal cell Gastric-acid secretion Epithelium of respiratory system Meningeal cell, ependymal cell Transfer of cerebrospinal fluid Glial cell Regulation of brain volume Retinal glia Skeletal muscle AQP5 Salivary gland Saliva secretion Lacrimal gland Tear secretion Alveolar type I pneumocyte Water transfer between alveolar and air spaces Corneal epithelium AQP6 Kidney collecting duct Regulated by pH AQP7 Kidney proximal tubule Permeable to glycerol and urea Testis seminiferous tubule Maturation of spermatogenic cell AQP8 Kidney proximal tubule Testis seminiferous tubule Maturation of spermatogenic cell Epithelium of duodenum, jejunum, colon Bile canaliculus Pancreatic acinar cell Secretion of pancreatic juice AQP9 Testicular Leydig cell Permeable to some molecules Epididymis duct cell Sperm concentration Hepatocyte AQP10 Small intestine (mRNA) 第三节 水通道的分子结构及生化特性 不同水通道cDNA具有高度同源性，AQP1和MIP (AQP0) cDNA有42%的同源性，AQP1和家族其它成员cDNA有30%～40%的同源性。人AQP1基因定位于染色体7q14，具有该蛋白家族基因的共同特性，包含四个外显子，编码氨基酸第1～128、129～183、184～210和211～269位氨基酸序列,其间三个内含子的长度为9.6、0.43和0.80kb，AQP1基因的转录产物约为3.1kb，5’末端为58bp的非编码区，随后是编码28.5kD蛋白质的807bp开放阅读框架及约2kb的3’末端非翻译序列, 最后为polyA尾。 演绎的氨基酸序列的拓扑学分析揭示,水通道在细胞中以四聚体的形式存在，每一亚单位在功能上都可作为一个单水通道（见图2）。它的四级结构是由四个对称排列的各长5nm，直径3.2nm的圆筒状亚基包绕而成的四聚体。目前对于四个可以独立行使转运水功能的亚单体组成四聚体形式的原因和意义仍然未被揭示。 图2 由四个单体组成的水通道的空间结构 水通道单体的一级结构为跨越细胞膜6次的单肽链, 含有2个胞内襻(B、D)和 3个胞外襻(A、C、E)。各种水通道亚型蛋白结构的B襻和E襻具有高度的同源性，并且都存在有天冬酰胺-脯氨酸-丙氨酸（Asn-Pro-Ala，NPA）的重复串联基元序列（motif）, 因此NPA是水通道家族成员共有的特征性结构。有实验对多种类型水通道的B襻和E襻进行结构改变，并测定其转运水的能力，结果发现在膜上处于反向相对位置的B襻和E襻对构成功能性水的选择性通透十分重要。 AQP1二级结构是由40%的α螺旋及β片层和转角构成。在空间结构上，分别位于细胞内和细胞外的疏水B襻和E襻向膜脂质双分子层中折叠，两个NPA在折叠中形成一个直径约为0.3nm，大小为一个单水分子的单水孔道，这种结构称为“沙漏模型（hourglass fashion）”(见图3)。 在水通道蛋白的B襻和E襻的末端部分含有α螺旋结构，该结构可以在细胞膜中产生正电位，大分子如尿素和质子等将被排斥而不能通过。由于水通道的孔径和正电位的特点，肾脏每天约150L的滤液中有99%被重吸收。然而，尿素、肌氨酸酐和酸性物质将不被重吸收。 目前认为AQP1、AQP2、AQP5的E襻和AQP3的B襻NPA序列中的半胱氨酸是汞抑制水通道的作用位点。汞离子和有机汞可通过与半胱氨酸结合阻塞水孔道，抑制水通道对水的转运。某些水通道如AQP4在该位置无半胱氨酸,故对汞不敏感。 图3 AQP1单体结构的沙漏模型（hourglass fashion） (a) AQP1单体的6个跨膜区域和细胞外襻A, C, E及细胞内襻B，D。2个NPA基元序列定位于B和E襻。 (b) 在B和E襻中的NPA基元序列共同构成了可通透单水分子的水通道。 引自：Landon S. KingA. Aquaporins in health and disease. Molecular Medicine Today 2000, 6:60-65. 第四节 水通道的分布 一、水通道在血细胞的分布 AQP1最早就是在哺乳动物的红细胞膜上发现的，此蛋白可使非洲爪蟾卵母细胞水通透性提高20倍。最初认为AQPl介导的水通透性与红细胞通过高张的肾髓质和微血管时的变形性及其恢复有关。但在AQPl的基因变异的成人却没有相应特殊的临床表现。Preston等对三例红细胞膜上无AQPl相关Colton血型抗原的成人进行研究，发现三人均有DNA的突变，红细胞水通透性均降低，但均无异常临床表现，故对红细胞膜上AQP1的生理重要性提出疑问，并提示可能有其他代偿AQP1缺失的机制存在。 　　早在胚胎早期二、三个月时，红细胞膜表面就有AQPl表达，只是与成人相比，表达水平低，红细胞水通透性差。有一种新型的先天性促红素功能不良性贫血的疾病，其临床表现是持续存在胚胎期和胎儿期血红蛋白，缺乏红细胞CD44 蛋白。对其研究发现，这种病人血液中红细胞含有AQPl的水平小于正常人的 10％，相关Colton抗原水平下降，红细胞水通透性显著降低，而AQPl在基因水平没有突变发生。这一现象提示这种疾病可能与红细胞中AQP1和CD44蛋白表达水平的缺陷有关，可能影响红细胞的成熟过程。但目前尚无直接证据。 　　AQP1缺陷患者肾髓质的间质渗透梯度被破坏，而且红细胞膜上有低水平的AQP3表达。另外，AQP3在人类外周白细胞上有表达，其生理功能与病理意义不详。 二、水通道在肾脏的分布 成人肾脏所具有的复杂的尿浓缩机制 说明 关于失联党员情况说明岗位说明总经理岗位说明书会计岗位说明书行政主管岗位说明书 水通道蛋白在保持人体水盐代谢平衡中起重要作用。肾小球每天产生180 L滤液，其中80%～90%在近曲小管和髓袢降支细段被重吸收。肾脏作为整个机体调节水平衡的主要器官，其水通道的亚型分布也是最多的。主要有AQP1、AQP2、AQP3、AQP4和AQP6。也有研究表明在肾脏的近端小管可能还存在AQP7。（见图4） AQP1在肾单位的近曲小管和降支细段中很丰富，它组成将近4%的顶质膜刷状缘蛋白，对水都有很高的通透性。进一步的研究证实了在先天性无AQP1的人，其水转运的缺陷可以得到代偿，因此在无外界条件变化时，这些人不表现明显的临床症状。 AQP2位于集合管的主细胞中。在静息条件下，AQP2主要存在于顶质膜下的细胞内囊泡中。在精氨酸加压素（Arginine Vasopressin，AVP）与基侧质膜的V2受体结合后，AQP2 C-末端的丝氨酸Ser256被磷酸化。然后AQP2重新分布到顶质膜，并产生对水的通透性。与遗传性AQP1缺陷的人相比，AQP2缺乏有明显的临床表现。肾源性尿崩症(Nephrogenic Diabetes Insipddus，NDI)是一种肾对AVP无反应的疾病，它的临床标志是排泄大量的稀释尿。Deen和他的同事已经发现大量的长染色体隐性遗传的肾源性尿崩症病人，他们的AQP2基因有突变。后天的肾源性尿崩症比先天的更普遍，并且可由许多种原因引起，包括AQP2在表达水平的变化。Nielsen和他的同事最近证实锂、双侧输尿管阻塞和慢性低钾血症均能引起肾源性尿崩症，这些可导致动物肾脏AQP2表达的减少，并且降低泌尿系的浓缩功能。水代谢失衡的另一个表现是在体液明显潴留时，如在充血性心力衰竭、肝硬变和妊娠时AQP2表达增加。AQP2可能是治疗各种原因引起的水平衡失调的靶点之一。 AQP3存在于集合管基侧质膜，AQP4存在于髓质内小血管结构中，两者虽不直接参与尿液浓缩，但为集合管重吸收的水分提供出路； AQP6存在于集合管泌酸细胞和近曲小管上皮细胞的囊泡中。AQP6分布的独特性预示了它可能与其他水通道蛋白有功能上的差别，包括对酸碱平衡的调节。 AQP1，AQP2和AQP3都是汞敏感水通道，受汞化合物的抑制，这正是临床曾经使用汞利尿剂治疗心功能不全的机制。 存在于肾脏近端小管的AQP7可能具有通透甘油和尿素的作用。 图4 肾脏上主要的水通道分布 三、水通道在呼吸道的分布 呼吸道的液体转运很复杂。在远端的肺组织，围产期水的转运对于胎盘和子宫的气体交换非常重要。在整个生命过程中，血管、间质和肺中水的适当调节对正常的气体交换和肺的防御是必须的。气道表面液体层的精细调节对于有效的黏膜纤毛的运输是必需的。在气道和鼻咽中，吸入的气体必须是潮湿的，以防止远端的气道干燥，而且必须从呼出的气流中吸收水分，将呼出的水分损失减少到最小。 有4个水通道存在于呼吸道中，它们的分布各不相同(见图5)。 AQP1丰富的定位于大鼠的微血管和胸膜的顶质膜和基侧质膜中。在气道黏膜下腺体的I型肺泡细胞和分泌细胞的顶质膜中则有AQP5的表达。在气道和鼻咽的上皮组织，不同细胞的基侧质膜中都有AQP3和AQP4的表达。水通道的非重叠分布可能为呼吸道的跨细胞水转运提供了一个网络协调系统。I型肺泡细胞的基侧质膜和呼吸道上皮组织的顶质膜缺乏已知的水通道，推测在那些部位可能存在未知的水通道。另外一种解释是，跨细胞膜的水转运不一定存在于呼吸道上皮组织的每一个位置，而只是发生在特定的部位。 水通道在肺中的发生过程是很有意思的。AQP1在妊娠晚期的胚胎大鼠肺中有表达，在出生时明显增加，而且在成年动物中维持很高的水平。皮质醇类药物能诱导胎鼠和成年鼠肺中AQP1的表达，这与已知皮质醇类药物可以加速胎肺成熟的作用一致。出生后1至2天大鼠肺中有AQP5的表达，在成年动物中有高水平的表达。与AQP1不同，AQP5不能被皮质醇类药物所诱导。出生后2天在远端的肺组织中有短暂的AQP4的表达。在远端的肺组织，AQP1和AQP5的表达和功能的改变对肺水肿和胸腔积液的发病起着一定的作用。最近对无AQP1小鼠的研究证实了在远端肺组织中AQP1的功能。与对照动物作比较，无AQP1的小鼠对渗透水的通透性减少了10倍，同时对流体静力的渗透性减少2倍。另外，用游离的远端气道灌注法证实水通道蛋白通过远端的气道上皮组织介导水的转运。气道和鼻咽的上皮下血管和腺体参与了气道的湿润和气道表面液体的形成和调节。气道表面液体层的改变是肺囊性纤维化的重要临床表现，而且可能在肺水肿中起一定作用。水通道可能参与肺水平衡的诸多方面。 图5 水通道在呼吸道的组织分布 四、水通道在消化道的分布 存在于消化道中的水通道有AQP3、AQP4、AQP8、AQP10。 AQP3主要分布于上起口腔下至前胃（胃体的非腺体部分）的上消化道、远端结肠至肛门部分的上皮细胞。由此推断，AQP3可能参与了这些上皮细胞的渗透压的维持。 AQP4主要分布于胃壁细胞，可能参与了胃酸的分泌。但是采用AQP4基因敲除小鼠研究表明，AQP4对胃酸的分泌没有作用。 目前对于AQP8参与肠道水吸收的机制尚不明晰。 在小肠中还存在AQP10。 五、水通道在唾液腺的分布 唾液腺中主要分布有AQP3、AQP4、AQP5（见图5）、AQP8。 免疫组织化学研究表明，AQP5主要存在于下颌下腺、腮腺和舌下腺的分泌细胞的顶质膜中，参与腺体分泌。有研究表明，在Sjögren's 综合症患者中常常出现AQP5在唾液腺中分布异常，表现为口干。对5只AQP5缺陷小鼠的唾液分泌进行了研究，结果证实AQP5参与了唾液腺的分泌。 AQP8在唾液腺腺体上的分布位置存在异议。 有研究表明AQP3存在于人体唾液腺腺体的基侧膜中。 采用RT-PCR对大鼠下颌下腺腺体中AQP0-AQP9蛋白的mRNA进行检测，结果表明，AQP4和AQP8 mRNA呈阳性。 六、水通道在脑的分布 颅腔的正常形态和生理功能的维持与颅内液体的严格调节密切相关。脑脊液是在脉络丛侧壁内包含血管的第三和第四脑室的分泌上皮中产生的。 免疫定位的研究证实AQP1丰富地表达于脉络膜上皮组织顶质膜微绒毛中；在妊娠早期胚胎大鼠中有表达。AQP1和Na+–K+ ATPase在顶质膜中的共定位提示水通道对脑脊液的产生具有非常重要的作用。 目前发现大量在脑组织中表达的水通道蛋白是AQP4。主要位于室管膜、组成皮质和脑干边沿的神经胶质细胞、下丘脑视上核和室旁核分泌血管及脑浦肯野细胞。 根据其分布部位，脑中AQP4的功能有两方面 ：（1）通过脑脊液的重吸收，调节脑室内液体的出入平衡，并可能对脑水肿的病理状态起调节作用。（2）感受渗透压的变化，调节抗利尿激素（Antidiuretic Hormone， ADH）分泌，间接起到介导肾脏AQP2的作用，调节机体水平衡。 七、水通道在眼的分布 在眼组织中的不同区域中已经有5个AQPs被确定(见图6)。大约一半的晶体纤维细胞蛋白是MIP (AQP0)，最近证实AQP0有弱的水通道的功能。小鼠MIP基因的2个不同的突变可导致先天性白内障。在角膜内皮组织和晶体前囊上皮组织中的AQP1和在角膜上皮的AQP5可能参与减少这些组织水含量的过程，这对维持角膜和晶体的透明很重要。在睫状体上皮前部和Schlemm管中存在AQP1说明玻璃体具有分泌和摄取水的功能。AQP1也存在于虹膜中，此处有很高的水通透性，以促进虹膜随着瞳孔收缩发生快速形状变化。在视网膜Müller细胞中存在AQP4，表明它在光感受器周围光依赖的水化中起一定的作用。在球结膜中的AQP3对于防护眼球的水化也有一定的调节功能。 图6. 水通道在眼球组织中的分布 八、水通道在其他组织的分布 因尿毒症而进行腹膜透析的病人，其腹膜上存在AQP1，这为腹膜透析的机制提供了进一步的理论解释。肝脏中与肝内胆管相连的胆管细胞中有AQP1的表达，提示AQP1参与该细胞的水转运，而肝细胞的水转运方式则主要是通过非通道介导的途径进行。 第五节 水通道与疾病 水通道在组织中的分布表明，水通道基因表达异常可能参与某些水平衡紊乱性疾病的发病。 AQP1是Colton (Co)血型的分子基础， 抗Coa和抗Cob抗体与Coa及Cob特异性血型抗原发生的免疫沉淀反应说明Co抗原和AQP1上的一个位点间的物理关系。从确定的Colton显性个体的多个DNA样本的排列顺序可确定Colton抗原源于AQP1第45残基上丙氨酸/缬氨酸的多态性。 目前，在世界范围内已确认了有五个不同的家族完全缺乏Co抗原。检查了其中3个家族先证者的血液和尿样，发现她们的红细胞及尿沉淀物中缺乏AQP1。基因组DNA分析证实，这些先证者具有不同的AQP1突变的纯合体。两人发生了AQP1的基因敲除，另一人有AQP1的错义突变。先证者1的外显子I缺失；先证者2在307位有一个单碱基插入导致了104位甘氨酸后的移码突变；而先证者3的113位核苷酸由胞嘧啶变成胸腺嘧啶，从而使38位残基上的脯氨酸变成了亮氨酸，产生错义突变。这样，基因的突变导致了无Colton表型的产生。但令人惊讶的是，这三人均不表现出在血液、肾脏、眼睛、呼吸、胃肠道、生殖以及神经系统的明显异常。原因可能是其他的AQP或其他机制补偿了AQP1的缺陷。 现已知部分先天性肾源性尿崩症（NDI）病人是由于精氨酸加压素（AVP）V2受体的基因突变引起的，已发现约有30种类型的V2受体基因突变，包括核苷酸的缺失和插入以及核苷酸的点突变等。由于V2受体的突变，导致其不能与AVP配体结合或不能激活腺苷酸环化酶这一受体后信号转导机制，使患者的肾脏不能在加压素的调节下浓缩尿。然而，有些NDI表现为常染色体显性或常染色体隐性遗传方式，研究证实这些方式遗传的NDI与AQP2水通道基因的突变有关。AQP2定位在染色体12q13。AQP2基因表达缺陷引起肾脏浓缩功能的丧失是不能为其他机制所补偿的。第一个AQP2缺陷病人其基因型为杂合体，伴有两个AQP2基因的错义突变，它的cRNA在爪蟾卵母细胞中表达时，无转运水的功能。另外，某些形式的中枢性肾源性尿崩症亦是AQP2分子表达异常造成的。 在充血性心衰、肝硬变、抗利尿激素分泌不当综合征等疾病情况下可发生机体水排泄障碍。在肝硬变及充血性心衰的动物模型中，发现AQP2蛋白水平上调；在严重充血性心衰伴低钠血症者观察到AQP2集中在集合管上皮细胞顶质膜，从而强调了AQP2在这些疾病中的重要性。相反，在抗利尿激素分泌不当综合征中则AVP表达增加。还有 报告 软件系统测试报告下载sgs报告如何下载关于路面塌陷情况报告535n,sgs报告怎么下载竣工报告下载 指出，AQP2参与了妊娠和适应高海拔时改变水代谢的病理生理过程，并预测AQP2表达可能与水平衡失调有关。 最近的研究表明，AQP1和AQP2共同参与引起一些肾脏疾病的病理生理机制。常染色体显性的多囊肾是一种由许多小管上皮包绕充满液体的囊肿形成的遗传性疾病。AQP1和AQP2均在常染色体显性多囊肾病肾脏内表达。 另外，在肾细胞性肿瘤的小管上皮中发现AQP2，说明集合管上皮可能是肾细胞癌的来源。 AQP4可能对脑水肿的发病与改善起作用。而且AQP4发生代谢或破坏，如去磷酸化或分布异常可能导致血脑屏障通透性的改变，这种情况多见于肿瘤、中风、脑缺血或感染。AQP4可能由于肾功能衰竭、急性血浆渗透压减低、糖尿病高渗状态而提供水进入的通道引起脑水肿。AQP4在小脑及室管膜细胞中的存在提示这种蛋白可能参与运动失调或脑脊液重吸收障碍的病理生理过程。AQP4在小脑Purkinjie层的存在，提示其参与小鼠AQP4突变性运动失调。 现在人们更加认识到水在哮喘时对气道阻塞的作用。在冷诱发或运动诱发的哮喘中，气流通过鼻及上呼吸道的阻力很大程度上直接来源于上皮下血管、鼻、气管及支气管的肿胀。皮质激素诱导的AQP1表达可促使水从间质流回血管系统，可能使其治疗哮喘或肺水肿的作用机制。 AQP5存在于I型肺泡细胞，提示AQP5与淡水溺水、成人呼吸窘迫综合征及高原性肺水肿的发病机制有关。AQP5也可能参与充血性心衰的肺脏反应。 AQP1在分泌眼房水的前睫状体的非色素上皮中含量丰富，同时也存在于小梁网上皮及巩膜静脉窦，这里是房水流出通道，并在此重吸收水。由于青光眼的病因学是由于前房压力持续增高，因此不难理解分泌房水的微小增加或房水重吸收紊乱在某些类型的青光眼的发病中起重要作用。AQP1在虹膜的非色素上皮中也很丰富，这里高度的水通透性有助于瞳孔收缩所必需的快速容量变化。AQP4在视网膜Müller细胞中非常丰富，这些细胞围绕并支持着光感受器细胞，因此AQP4可能通过影响包绕光感受器的光感性水合作用而参与视觉活动。 AQP5在肺、泪腺及唾液腺的分布可以为干燥综合征的病因学提供一种解释。 第六节 水通道的调节 与水穿越脂质双层的简单扩散不同，通道介导的水转运是水通过水通道沿着渗透梯度由低渗区向高渗区的移动。目前研究表明，水通道在特殊的生理条件下，可以通过渗透压、激素和药物对水通道的表达和功能产生一定的影响。 一、限水对水通道的调节 正常状态下，AQP2弥漫分布于细胞质，限水后，顶质膜AQP2的染色加深。集合管细胞膜的免疫印迹研究也证实，限水大鼠AQP2的表达量增加。此外，肾髓质AQP2的mRNA含量亦有增加。失水导致AQP2表达量的增加是机体克服长期缺水的生理学调节机制之一。 相反，长期失水后，肾髓质AQP1的mRNA含量却无明显变化。 AQP3在肾皮质和肾髓质均有分布，但在内髓基底部表达最多。免疫组化和免疫荧光的研究显示AQP3局限于皮、髓部的集合管，主要分布于集合管细胞基侧质膜区，但在细胞内囊泡也有少量标记。限水48h后，AQP3的蛋白质含量约增加了2倍。大鼠失水量达体重的14%-21%时，肾脏水通道AQP3的mRNA的含量也增加。AQP3可由于表达的改变而被长时调节。 二、精氨酸加压素对水通道的调节 除限水引起的长时调节外， AQP2的细胞水通透性也受精氨酸加压素（AVP）的急性调节。经加压素处理后，集合管水的通透性显著增加。在5min～10min内，渗透水的通透性（osmotic water permeability）Pf值可以从<50(m/s增加到1000(m/s。 为观察AQP1和AQP2对加压素的不同反应及向细胞膜转运的不同途径，用大鼠肾脏AQP1和AQP2的cDNA在LLC-PK1猪肾小管上皮细胞作稳定转染。免疫荧光法显示AQP1主要分布于细胞膜，AQP2则分布于细胞内囊泡。经AVP处理后，AQP2多由细胞内囊泡向细胞膜转移，同时其转染细胞的水通透性显著增加，而AQP1转染细胞和野生型细胞，其分布未发生变化，而且对水的通透性只有轻微增加。由此推断，AQP2转染的细胞在AVP作用下可导致功能性水通道插入细胞膜产生所谓的“穿梭机制”，而AQP1蛋白在其转染细胞中以构成形式表达于细胞膜，具有不受AVP调节的高水通透性。“穿梭机制”认为，此Pf值的升高是由于AVP引起的排粒作用，将细胞内囊泡中的水通道蛋白转移到管腔膜，使该部位功能性水通道增加所致。撤除AVP后，细胞膜水通道结构区摄粒作用恢复，将水通道从管腔膜移走，引起水通透性回降。 Kuwahara等人对AVP的作用机制作了进一步的研究，发现AQP2基因中包含着一段cAMP依赖性蛋白激酶的作用序列，定位在253-256（Arg-Arg-Glu-Ser）残基。已知cAMP依赖性蛋白激酶介导的磷酸化作用对调节通道蛋白的功能起着重要作用，对MIP家族成员也不例外。如它对MIP的磷酸化部位是在丝氨酸243（Ser243），磷酸化作用增加了MIP电压依赖性通道的关闭。由此Kuwahara等推测AQP2的磷酸化位点是Ser256残基。为确定这一点的作用，它们通过定点突变将Ser256分别用丙氨酸、亮氨酸、苏氨酸、天冬氨酸或谷氨酸置换，将这些突变体和野生型AQP2的cRNA分别注入爪蟾卵母细胞，发现这些细胞渗透水的通透性比仅注入水的细胞高4.8倍～7.7倍，说明突变型AQP2仍具水通道的功能；然后用cAMP加Forskolin培养或直接将cAMP注入卵母细胞，野生型AQP2的Pf值继续升高，突变型却无变化。而Western blot分析表明野生型和突变型 AQP2在卵母细胞表达的数量是相近的，说明突变体Pf值不能继续增高是由于其丧失了对cAMP或Forskolin的反应能力。体外磷酸化研究发现cAMP依赖性蛋白激酶能够磷酸化野生型AQP2，却不能磷酸化突变体。已证实野生型AQP2是一个分子量为29kDa的磷酸化蛋白，磷酸化丝氨酸是唯一能检测到的磷酸化氨基酸，从而断定，AQP2蛋白在Ser256位点的磷酸化是cAMP引起的Pf增高的原因。 在离体的肾脏集合管灌注实验中，发现水通道AQP2主要分布在细胞内的小囊泡中，与精氨酸加压素（AVP）同时存在。当细胞内的AQP2从囊泡迁移至集合管管腔膜时，管腔膜的水通透性将增加5倍。如果去除AVP，水通道AQP2蛋白将发生胞饮作用进入细胞浆内的囊泡中，同时，水的通透性将降低。水通道AQP2迁移和合成调节目前还在研究之中。将加压素V2受体克隆到集合管的基底膜中，加压素受体将被活化，通过精氨酸加压素（AVP）-腺苷酸环化酶-环腺苷酸（cAMP）-蛋白激酶A（PKA）调节通路，磷酸化水通道蛋白AQP2细胞内C-末端256位的丝氨酸（Ser），激发水通道蛋白AQP2向集合管管腔膜迁移。 同时研究表明，AQP2基因的增强子中包含有环腺苷酸反应元件。短时程的调节作用(The short-term effect):活化水通道AQP2向集合管管腔膜上的迁移。目前比较清楚的是，长时间用AVP处理，将会导致水通道AQP2蛋白的合成。细胞分子水平实验研究证实了水通道AQP2的“穿梭假说”：加压素AVP通过调控水通道AQP2蛋白向集合管主细胞管腔膜的穿梭实现尿液稀释与浓缩的调节。如图6 图6 肾脏集合管中水通道AQP2的迁移和合成.AVP可以活化腺苷环化酶AC- 环腺苷酸cAMP -蛋白激酶A通路从而实现双向调节作用.短时程的调节作用(The short-term effect):水通道AQP2细胞内的C-末端256位的丝氨酸磷酸化,导致水通道AQP2与集合管管腔膜的结合和细胞的胞吐作用，从而将有３－６％水通道ＡＱＰ２将随尿液丢失。长时程的调节作用：细胞核中环腺苷酸cAMP反应元件结合蛋白磷酸化，导致ＡＱＰ２合成增加。ＡＶＰ减少可以导致水通道蛋白ＡＱＰ２从集合管管腔膜向细胞浆中的胞饮作用。前列腺素（ＰＥＧ２）可以损伤ＡＶＰ的作用，同时抑制水通道ＡＱＰ２的合成。 三、水通道蛋白的泛素化调节 AQP1在身体的多种组织中有表达，尤其在肾脏、脑和肺的气道中起着很重要的作用。AQP1作为转运水的一种膜蛋白，其代谢降解途径一直是人们关注的问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 ，因为AQP1的代谢方式影响着水通道蛋白的表达和含量，从而影响体内水的转运和机体各器官的功能。 真核细胞中蛋白质的降解途径主要有溶酶体途径和非溶酶体途径。前者主要降解通过摄粒作用或胞饮作用，吞噬进入细胞的胞外蛋白质；后者则在蛋白酶复合体（20s/26s蛋白酶体）颗粒内进行，被降解的蛋白底物经过E1（泛素连接酶）的作用与多聚泛素（ubiquitin）结合，从而递呈给26s蛋白酶复合体降解。 Agre等人的研究表明水通道主要是通过以泛素化为主要途径的非溶酶体途径。水通道泛素化在一般情况下半衰期小于4小时，当细胞暴露在高渗透压介质中4小时，水通道的泛素化减少，水通道蛋白的稳定性显著增加。在高渗透压下水通道泛素化减少可以持续24小时。抑制水通道的泛素化，可以增加水通道的稳定性，促进水的转运。 第七节 作用于水通道的药物研究 水通道作为人体内广泛分布的转运水的细胞膜蛋白，研究表明它与机体一些疾病的各种病理生理因素有关。水通道蛋白能否作为某些水平衡紊乱性疾病治疗药物的靶点一直是人们关注的热点。水通道与疾病的关系研究迫切要求发现作用于水通道蛋白的药物，以适应水通道疾病机制研究和相关疾病的治疗。目前发现的影响水通道功能的药物综述如下： 一、汞制剂 在水通道结构中，定位在AQP1 E襻的NPA(Asn-Pro-Ala)序列前有一半胱氨酸（C-189），被认为是AQP1水通道的汞抑制部位。汞离子和有机汞通过与C-189结合而阻塞或破坏这个孔，降低水的通透性。在AQP2的相关部位也有半胱氨酸存在，因而也对汞敏感。但在汞不敏感水通道（mercurial-insensitive water channel, MIWC）和汞敏感的AQP3相应部位，均无半胱氨酸，推测AQP3是由于在B襻靠近NAP处有一半胱氨酸（C-78），因而对汞敏感。为研究MIWC的汞不敏感性以及证实其它AQP的汞抑制部位，将靠近NPA（69-74及187-190）序列的残基逐个突变为半胱氨酸，然后将它们的cRNA表达于爪蟾卵母细胞，观察细胞Pf值和汞抑制反应，发现突变体介导水转运的Pf值与野生型MIWC并无差异。但S70C,G71C,G72C,H73C和S189C突变体，Pf值被HgCl2可逆性的抑制，其余几种突变体则对HgCl2不敏感。 为证实这些残基靠近MIWC的通水孔道，残基72和188被突变为分子较大的色氨酸，发现表达突变体G72W和A188W细胞的Pf值并不比注入水的细胞高。这些结果证实，MIWC之所以对汞不敏感，是由于其NPA序列附近缺少一个半胱氨酸残基，而且其残基70-73和189接近其通水孔道。 二、四乙铵(Tetraethylammonium，TEA) 在四乙铵发现作为水通道AQP1抑制剂以前，人们一直仅仅将汞制剂作为水通道唯一的抑制剂。Andrea 等将人的AQP1基因表达于爪蟾卵母细胞（Xenopus oocytes）中，氯化四乙铵(TEA; 0.05 to 10 mM) 可以抑制水通道对水的转运。同时发现，四乙铵还可以抑制肾脏上AQP1对水的转运、重组有AQP1的源于肾脏的MDCK细胞系对于水的转运。但是对水通道AQP1的cGMP依赖性离子转运没有明显的抑制作用。最近已有人证实四乙铵通过与AQP1蛋白Ｅ襻一个酪氨酸186残基的ＯＨ-基团相互作用，影响AQP1对水的通透性，从而抑制水的转运。这也为水通道功能的研究提供了有力工具。 三、锂制剂 锂常用于治疗狂躁抑郁性精神病，其副作用为肾源性尿崩症（NDI）。有证据表明锂可抑制抗利尿激素（加压素）的作用，但机制未明。有人认为，锂通过抑制集合管上皮细胞腺苷酸环化酶的活性，从而抑制cAMP-加压素第二信使的产生。Marpls等人用免疫印迹的方法研究发现，经10天锂治疗，AQP2的表达减少到31%，25天后继续减少到4%，与尿频的发展程度相平行。此外，免疫荧光法和免疫金定量也证实了锂诱导AQP2向下调节。停用锂7天后，尿渗克分子浓度增高只是对照组的2/3，AQP2的表达也仅由对照组的11%升高到40%，说明停药7天后AQP2的表达并没有完全恢复。 饥渴疗法和静脉注射1-脱氨-8-D-精氨酸-加压素（dDAVP）也能翻转锂对AQP2表达的向下调节。免疫印迹和免疫金定量显示，经过2天的饥渴疗法和7天的dDAVP治疗，其间继续用锂，AQP2的表达分别增加了6倍和3倍，与尿渗克分子浓度的增加相一致。免疫荧光和免疫电镜显示，饥渴疗法主要是增加了顶质膜下区和质膜的AQP2含量。提示锂诱导AQP2表达的向下调节，只能部分的被饥渴疗法或dDAVP治疗所翻转，这与临床观察到的锂诱导的尿浓缩功能障碍的缓慢恢复是一致的。 四、秋水仙碱 微管对于膜转运和上皮细胞极性的维持有重要作用，秋水仙碱可致微管破裂而影响其上述功能。Elkjaer等人用秋水仙碱处理，然后观察大鼠肾脏的近曲小管切片，发现无摄粒内褶存在，说明秋水仙碱阻断了摄粒内褶的形成；同时未发现有摄粒空泡存在，说明它对摄粒作用也有阻断作用。此外，功能性研究也证实，秋水仙碱诱导的过氧化物酶阻断了上皮细胞顶质膜的摄粒作用。 免疫荧光和免疫电镜显示了秋水仙碱诱导的AQP1在细胞内分布的明显变化。 五、碳酸酐酶抑制剂对水通道的调节 我们对于碳酸酐酶抑制剂乙酰唑胺和托吡酯对水通道AQP1的表达和功能做了比较深入的研究。结果表明，乙酰唑胺对水通道蛋白转运水的功能和水通道蛋白的表达具有抑制作用。另外，最近也有人发现碳酸酐酶抑制剂可以抑制AQP4的功能。 六、乙醇、乙腈 最近，Lahajnar 等人研究了乙醇和乙腈对牛和小鸡红细胞水扩散通透性的影响。与水通道抑制剂汞相比，乙醇和乙腈增加牛红细胞跨膜水扩散交换时间和阿里纽斯激活能量达2倍之多。小鸡红细胞无水通道存在，对乙醇和乙腈不起反应。因此他们推测乙醇和乙腈通过介入牛红细胞膜脂质而影响AQP1水通道的通透性，但不影响脂对水的扩散。他们还推测，水经AQP1水通道跨膜转运的抑制，也许与一些麻醉剂如乙醇的抗溶血性作用有关。 七、其他药物对水通道的调节 目前还有较多的研究发现，在一些肿瘤细胞中发现AQP1表达，如肾癌细胞、乳腺癌细胞、恶性角质瘤细胞。在AQP1基因缺陷小鼠，肿瘤的生长和血管的生成明显减慢，说明AQP1可能与肿瘤的生长和血管的生成有关。进一步的研究还发现，肿瘤细胞和内皮细胞的迁移也与AQP1有关，这也许为肿瘤发病机制和药物研制提供了新的思路。 药 理 学 pharmacology _1281292065.psd