蛋白的酵母双杂交操作手册大全

1 蛋白的酵母双杂交实验 ——以钓饵蛋白筛选 cDNA 文库研究蛋白相互作用 第一部分 系统简介 1. 实验原理 蛋白的酵母双杂交实验是以酵母的遗传分析为基础，研究反式作用因子之间的相互作用 对真核基因转录调控影响的实验。很早就已知道，转录活化蛋白可以和 DNA 上特异的序列 结合而启动相应基因的转录反应。这种 DNA 结合与转录激活的功能是由转录活化蛋白上两 个相互独立的结构域即 DNA 结合结构域(Binding Domain, BD)和转录活化结构域(Activation Domain, AD)分别来完成的，并且这两个结构域对于基因的转录活化都是必须的。目前酵母 双杂交实验采用的系统有 LexA 系统和 Gal4 系统两种。在 LexA 系统中，DNA 结合结构域 由一个完整的原核蛋白 LexA 构成，转录活化结构域则由一个 88 个氨基酸的酸性的大肠杆 菌多肽 B42 构成，它在酵母中可以活化基因的转录; 在 Gal4 系统中，BD 和 AD 分别由 Gal4 蛋白上不同的两个结构域(1-147aa 与 768-881aa)构成。在利用 GAL4 系统筛选 cDNA 文库或 研究蛋白间的相互作用时，DNA 结合结构域与靶蛋白即“诱饵”相结合，转录活化结构域 与文库蛋白或要验证的蛋白相结合。一般情况下，单独的 BD 可以与 GAL4 上游活化序列 （GAL UAS）结合但不能引起转录，单独的 AD 则不能与 GAL UAS 结合，只有当 BD 与 AD 分别 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达的融合蛋白由于相互作用而导致两者在空间上相互靠近时，BD 与 AD 才能与 GAL UAS 结合并且引起报道基因的转录。在 BD 与 AD 要导入的酵母菌 AH109 中，通过基 因工程的 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 在 GAL4 UASs 和启动子的下游构建了 3 个报道基因——ADE2，HIS3，MEL1 （或 LacZ），因此可以通过营养缺陷筛选和酵母菌表型的改变来筛选或验证两个蛋白之间是 否存在相互作用。GAL4 系统的原理如图所示： 图一：酵母双杂交系统工作原理 AH109（Trp,Leu,His,Ade 表达缺陷株） pGBKT7 Kanr Trp1 GAL4 BD bait pACT2 Ampr Leu2 GAL4 AD cDNA pGBKT7-bait pACT2-cDNA UAS Promoter Mel/Ade/His/LacZ reporter gene GAL4 DNA-BD GAL4 AD Bait protein cDNA:protein 2 2．系统特点 同以往研究蛋白质—蛋白质之间相互作用的实验手段相比，双杂交系统具有其独特优 势。首先，融合体蛋白之间的相互作用是在真核酵母细胞内进行，蛋白质有可能保持天然的 折叠状态，类似其在体内生理状态下的情况，这是其他离体生化检验方法所缺乏的，因此较 之后者，它所证实的蛋白质间相互作用将更接近于在体的真实水平。其次，双杂交系统的敏 感度即高，可以检测到在蛋白质之间结合常数低至 1mmol/L 左右的微弱作用。许多微弱或 短暂的蛋白质之间的相互作用可以借助报道基因表达过程中的多级放大效应反映出来；融合 蛋白基因在强启动子的作用下，处于较高的表达水平。第三，在筛选 cDNA 文库时，双杂 交系统能够简捷地得到编码相互作用蛋白的基因序列，它只需构建质粒而不必准备抗体或纯 化蛋白，省略了其它体外检测蛋白之间相互作用方法所必须的蛋白抽提、纯化等繁琐步骤。 需要指出的是，融合体蛋白必须转运至核内才能活化转录，因此对于胞外配体—受体作 用以及需要核外修饰或受磷酸化等翻译后修饰过程介导的蛋白质间相互作用而言，该系统的 应用受到一些限制。在进行文库筛选时，假阳性结果常常干扰实验的准确性，除某些文库编 码的蛋白质本身含有转录活化成分外，细胞内的其它无关蛋白也可能有类似作用，因此双杂 交系统检测的结果必须通过其它蛋白间相互作用的实验来进一步验证。 3．酵母双杂交 GAL4 系统筛选 cDNA 文库实验流程 构建 DNA-BD 与钓 饵 DNA 融合的重组 质粒 构建于 DNA-BD 载体的 目的 DNA 转化酵母菌 AH109 检测钓饵蛋白 自身激活能力 文库 DNA 转化含有 DNA-BD 载体的酵母菌 AH109 阳性克隆在 X- α-Gal 平板上的 初步筛选 酵母中质粒的提 取及 PCR 酶切分 类 酵母质粒电转化 大肠杆菌 KC8，抽 提分离所需质粒 所 得 质 粒 与 构 建 于 DNA-BD载体的目的DNA 再次共转化酵母菌 AH109 阳性克隆在 X- α-Gal 平板上的 再次验证，质粒 纯化、测序。 3 4．GAL 系统所用酵母菌株与载体 1). GAL 系统所用酵母菌株 注：菌株 AH109 可利用所带的 HIS3、ADE2、MEL1 三个报道基进行筛库。 菌株 Y187 可利用所带的 IacZ 报道基因来验证两个已知蛋白间的相互作用。 菌株 CG-1945 可被用于用环己酰亚胺来分离 BD-bait 和 AD-library 质粒。 2). GAL 系统所用各种质粒 4 第二部分 实验流程 构建于 AD 载体的 cDNA 文库的扩增 一．培养基： LB 液体培养基，121℃，15 lbf/ in2 灭菌 15min A． bacto-Tryptone 10.0g B． bacto-Yeast Extract 5.0g C． NaCl 5.0g D． 5N NaOH 调 pH → 7.0 E. ddH2O → 1000.0 ml * LB 固体培养平板为含有 1.8％琼脂（Agar）的 LB 培养基 LB/Amp 培养基为含有 Amp 100 ug/ml（高压后冷却到 50℃加入）的 LB 培养基 二．实验步骤： 1. 自-70℃冰箱取出含有 DNA 文库的甘油菌，置于冰浴中缓慢化冻； 2. 用新鲜的 LB 培养液在 1.5ml 离心管中将上述甘油菌 1:106 和 1:108 稀释； 3. 取稀释菌液各 10ul 加入 90ul LB 培养液在 1.5ml 离心管中振荡混匀，涂布 LB/Amp 平板(φ90mm); 37℃倒置培养过夜或 30℃培养 24-36hr,计数平板上单克隆菌落数； 4. 确定待扩增的 DNA 文库滴度（cfu/ml）=克隆数×108(1:106 稀释)或克隆数×1010(1:108 稀释)； 5. 按照>2-4×104cfu/平板的浓度，涂布 LB/Amp 平板(φ150mm)，共 100 块；37℃倒 置培养过夜； 6. 在超净台上，将所有生长菌落的平板上加适量 LB 培养液，将菌落刮下，转入 2000ml LB/ Amp 培养液中，37℃振荡培养 2-4hr; 7. 留取适量培养菌液以 50%无菌甘油稀释至 25%终浓度，分装，保存于-70℃; 8. 其余培养菌液 8000rpm×10min, 4℃，收集细菌；用质粒 DNA 纯化试剂盒大量抽提 质粒 DNA。 5 构建于 AD 载体的 cDNA 文库的纯化 一. 试剂： 质粒 DNA 提取缓冲液 名称 缓冲液 配 方 P1 悬浮缓冲液 50mM Tris-Cl,pH8.0; 10mM EDTA; 100ug/ml RNase A P2 裂解缓冲液 200mM NaOH; 1%SDS P3 中和缓冲液 3.0M KAc,pH5.5 QBT 平衡缓冲液 750mM NaCl; 50mM MOPS,pH7.0; 15%异丙醇; 0.15％TritonX-100 QC 洗涤缓冲液 1.0M NaCl; 50mM MOPS,pH7.0; 15%异丙醇 QF 洗脱缓冲液 1.25M NaCl; 50mM Tris-Cl, pH8.5; 15%异丙醇 二. 实验步骤： 1. 培养菌液离心 6000 rpm×10min，4℃,每 500ml 的培养物的沉淀重悬于 50ml P1 缓冲 液; 2. 加入 50m1 P2 缓冲液，倒置 4-6 次混匀，室温孵育 5min; 3. 加入 4℃预冷的 50ml P3 缓冲液，快速倒置 4-6 次混匀，冰浴 30min (其间再倒置混 匀 4-6 次); 4. 将上述混合液再倒置混匀，离心 12000rpm× 30min, 4℃，保留上清； 5. 上清再离心 12000rpm× 15min, 4℃，留上清； 6. 将上清液上样于经 35m1QBT 缓冲液平衡的 QIAGEN-tip 层析柱； 7. 以 100ml QC 缓冲液洗涤层析柱 2 次； 8. 以 35m1 QF 缓冲液洗脱吸附于层析柱上的 DNA； 9. 以 0.7 倍体积异丙醇沉淀 DNA，离心 12500 rpm × 30min，4℃，小心去除上清； 10. 以 7m1 70％乙醇洗涤沉淀 DNA，离心 12500 rpm × 10min，4℃，小心去除上清； 11. 将沉淀的质粒 DNA 溶于 5ml TE，pH8.0 缓冲液，转移至新的无菌离心管中，用 2.5 倍体积无水乙醇；l/10 体积 3.0M NaAc，pH5.2，于-20℃静置过夜； 12. 离心 12500rpm × 20min，4℃,去除上清，沉淀用 70％乙醇洗涤，超净台风干； 13. 干燥的 DNA 溶于适量体积 TE，定量，分装 100-200ug/管(用于 1 次转化反应，约 40ul)，保存于-20℃。 6 pGBKT7/bait 小规模转化酵母菌 AH109 一. 试剂： 1. 培养基： YPDA 液体培养基，(121°C，灭菌 15min) A. YPD (Clontech 公司) 15.0g B. 0.2%Adenine 4.5ml C. ddH2O → 300.0 ml SD/-Trp 固体培养基，(121°C，灭菌 15min) A. SD Agar Base (Clontech 公司) 4.67g B. 10 × DO (-Leu-Trp) (Clontech 公司) 10.0 ml C. 20 × Leu 5.0 ml D. ddH2O → 100.0 ml 铺 5 块平板(90-100mm) 2. 其它贮备液： 50% PEG 4000 (Sigma 公司, wt.=3,350)，用前抽滤或高压蒸汽灭菌; 100% DMSO (Sigma 公司); 10 × TE: 0.1 M Tris-HCl (pH7.5)，10mM EDTA，高压蒸汽灭菌; 10 × LiAc: 1M LiAc 用乙酸调 pH7.5，高压蒸汽灭菌; 10 × Dropout/ -Trp-Leu 溶液: 3.2 g DO Supplement(-Leu-Trp) 溶于 500ml ddH2O 中; 20 × Leu: 200 mg L-Leucine (Sigma 公司)溶于 100ml ddH2O 中; 0.2%Adenine: 0.2g Adenine Hemisulfate Salt(Sigma 公司)溶于 100ml ddH2O 中; ddH2O: 高压蒸汽灭菌; 二. 实验步骤： 1. 从 YPDA 平板上挑取生长 1-3 周、直径 2-3 mm 的 AH109 单克隆，接入 1 ml YPDA 液体培养基中，振荡打散菌落，然后接入 50 ml YPDA 液体培养基中，30°C 恒温， 250rpm 振荡培养过夜（16-18hr），至 OD600>1.5； 2. 取适量过夜菌液接种于 300 ml 新鲜的 YPDA 液体培养基，至 OD600=0.2-0.3，30°C 恒温，250rpm 振荡培养至 OD600=0.4-0.6 (约 3hr)； 7 3. 室温离心 2500rpm × 5min，弃上清；加入 25-50 ml ddH2O 或 TE 重悬洗涤酵母沉 淀细胞，离心弃上清，重复洗涤一次，沉淀用 1.5 ml 1×TE/LiAc 重悬后，即为酵母 感受态细胞（若仅用于转染质粒，则可置于 4°C 可几天内使用）； 4. 准备下列试剂： 2×转化反应 10 × TE 10 × LiAc 50% PEG ddH2O A. 1×TE/LiAc 1.50 ml 150 ul 150 ul / l.20 ml B. PEG/LiAc 1.20 ml 120 ul 120 ul 960ul / C. 1×TE 1.00 ml 100 ul / / 900ul 5. 分装待转化的质粒 DNA，振荡混匀： pGBKT7-bait 0.1ug Sperm DNA*(10 mg/ml) 0.1mg *Sperm DNA 新配制时水浴煮沸 20 分钟，立即插入冰浴，保存于-20°C 6. 每管加入 100ul 用 1×TE/LiAc 重悬的酵母感受态细胞，振荡混匀； 7. 各加入 600ul PEG/LiAc，剧烈振荡（提高转化效率），30°C 恒温，200rpm 振荡培 养 30min； 8. 各加入 70ul DMSO，缓缓倒置混匀(不能振荡)，42°C 水浴热休克 15min，迅速插入 冰浴冷却 1-2min； 9. 室温离心 14,000rpm × 5sec，尽量弃尽上清，以 0.5 ml 1×TE 重悬沉淀细胞，取 100ul 涂布 SD/ -Trp 固体培养板，30°C 倒置培养 3 天待菌落长出。 8 钓饵蛋白自身激活报道基因的活性检测 —pGBKT7/bait 与 pACT2 小规模共转化酵母 一. 试剂： 1. 培养基： YPDA 液体培养基，(121°C，灭菌 15min) A. YPD (Clontech 公司) 15.0g B. 0.2%Adenine 4.5ml C. ddH2O → 300.0 ml SD/-Trp-Leu 固体培养基，(121°C，灭菌 15min) A. SD Agar Base (Clontech 公司) 4.67g B. 10 × DO (-Leu-Trp) (Clontech 公司) 10.0 ml C. ddH2O → 100.0 ml 铺 5 块平板(90-100mm) SD/-Trp-Leu-His-Ade/3-AT/X-α-GAL 固体培养基 (121°C，灭菌 15min) A. SD Agar Base (Clontech 公司) 4.67g B. 10 × DO (-Leu-Trp-His-Ade) (Clontech 公司) 10.0 ml C. ddH2O → 100.0 ml 121°C，灭菌 15min，冷却到 50℃加入适量 5M 3-AT（至终浓度 15mM）与 100ul X-α-GAL (20mg/ml)，铺 5 块平板(90-100mm)； 2. 其它贮备液： 50% PEG 4000 (Sigma 公司，wt.=3,350)，用前抽滤或高压蒸汽灭菌； 100% DMSO (Sigma 公司)； 10 × TE: 0.1 M Tris-HCl (pH7.5)，10mM EDTA，高压蒸汽灭菌； 10 × LiAc: 1M LiAc 用乙酸调 pH7.5，高压蒸汽灭菌； 10 × Dropout/ -Trp-Leu 溶液: 3.2 g DO Supplement(-Leu-Trp) 溶于 500ml ddH2O 中； 10 × Dropout/ -Trp-Leu-His-Ade 溶液: 3.0 g DO Supplement (-Trp-Leu-His-Ade)溶于 500ml ddH2O 中； 0.2%Adenine: 0.2g Adenine Hemisulfate Salt(Sigma 公司)溶于 100ml ddH2O 中； 3-AT（5M）: 4.202g 3-AT 溶于 10ml ddH2O, 温水浴(<50℃)溶解,无菌滤器过滤后 分装 10 个 EP 管,- 20℃保存; X-α-GAL(20mg/ml): 25mg X-α-GAL 溶于 1.25ml DMF 中； dddH2O: 高压蒸汽灭菌; 9 二. 实验步骤： 1. 从 YPDA 平板上挑取生长 1-3 周、直径 2-3 mm 的 AH109 单克隆，接入 1 ml YPDA 液体培养基中，振荡打散菌落，然后接入 50 ml YPDA 液体培养基中，30°C 恒温， 250rpm 振荡培养过夜（16-18hr），至 OD600>1.5； 2. 取适量过夜菌液接种于 300 ml 新鲜的 YPDA 培养基中，至 OD600=0.2-0.3，30°C 恒温，250rpm 振荡培养至 OD600=0.4-0.6 (约 3hr)； 3. 室温离心 2500rpm × 5min，弃上清；加入 25-50 ml ddH2O 或 TE 重悬洗涤酵母沉 淀细胞，离心弃上清，重复洗涤一次，沉淀用 1.5 ml 1×TE/LiAc 重悬后，即为酵母 感受态细胞； 4. 准备下列试剂： 3×转化反应 10 × TE 10 × LiAc 50% PEG ddH2O A. 1×TE/LiAc 1.50 ml 150 ul 150 ul / l.20 ml B. PEG/LiAc 2.00 ml 200 ul 200 ul 1.6ml / C. 1×TE 1.00 ml 100 ul / / 900 ul 5. 分装待转化的质粒 DNA，振荡混匀： 实验组 阳性对照 阴性对照 用量 pGBKT7-bait pGBKT7-53 pGBKT7-lam 0.2 ug pACT2 pGADT7-T pGADT7-T 0.1 ug Sperm DNA*(10 mg/ml) 0.1 mg *Sperm DNA 新配制时水浴煮沸 20 分钟，立即插入冰浴，保存于-20°C 6. 每管加入 100ul 用 1×TE/LiAc 重悬的酵母感受态细胞，振荡混匀； 7. 各加入 600ul PEG/LiAc，剧烈振荡（提高转化效率），30°C 恒温，200rpm 振荡培 养 30min； 8. 各加入 70ul DMSO，缓缓倒置混匀(不能振荡)，42°C 水浴热休克 15min，迅速插入 冰浴冷却 1-2min； 9. 室温离心 14,000rpm × 5sec，尽量弃尽上清，各以 0.1 ml 1×TE 重悬沉淀细胞，涂布 SD/ -Trp-Leu 固体培养板，30°C 倒置培养 3 天； 10. 挑取菌落点种于 SD/-Trp-Leu-His-Ade/3-AT/X-α-GAL 平板，30°C倒置培养 1-2天。 实验组菌落若无生长，说明钓饵无自身激活能力；实验组菌落若生长且变蓝，说明 钓饵有自身激活能力。 10 文库质粒大规模转化已携带钓饵质粒的酵母 一. 试剂： 1. 培养基： SD/-Trp 液体培养基 (121°C，灭菌 15min) A. SD Base (Clontech 公司) 1.335g B. 10 × DO (-Leu-Trp) (Clontech 公司) 5.0 ml C. 20 × Leu 2.5 ml D. ddH2O → 50.0ml YPDA 液体培养基 (121°C，灭菌 15min) A. YPD (Clontech 公司) 15.0g B. 0.2%Adenine 4.5ml C. ddH2O → 300.0 ml SD/-Trp-Leu 固体培养基 (121°C，灭菌 15min) A. SD Agar Base (Clontech 公司) 32.69g B. 10 × DO (-Leu-Trp) (Clontech 公司) 70.0 ml C. ddH2O → 700.0 ml × 5 铺 10×5 块平板 （150mm） 2. 其它贮备液： 50% PEG 4000 (Sigma 公司，wt.=3,350)，用前抽滤或高压蒸汽灭菌； 100% DMSO (Sigma 公司)； 10 × TE: 0.1 M Tris-HCl (pH7.5)，10mM EDTA，高压蒸汽灭菌； 10 × LiAc: 1M LiAc 用乙酸调 pH7.5，高压蒸汽灭菌； 10 × Dropout/ -Trp-Leu 溶液: 3.2g DO Supplement (-Leu-Trp) 溶于 500ml ddH2O中； 20 × Leu: 200 mg L-Leucine 溶于 100ml ddH2O 中； 0.2%Adenine: 0.2g Adenine Hemisulfate Salt(Sigma 公司)溶于 100ml ddH2O 中； ddH2O: 高压蒸汽灭菌; 二. 实验步骤： 1. 从 SD/-Trp 平板上挑取直径 2-3 mm、携带 pGBKT7-bait 质粒（小规模转化）的 AH109 单克隆，接入 1 ml SD/-Trp 液体培养基中，振荡打散菌落，然后接入 50 ml SD/-Trp 液体培养基中，30°C 恒温，250rpm 振荡培养过夜（16-18hr），至 OD600>1.5; 2. 取适量过夜菌液接种于 300 ml 新鲜的 YPDA 培养基，至 OD600=0.2-0.3，30°C 恒 温，250rpm 振荡培养至 OD600=0.4-0.6 (约 3hr); 3. 室温离心 5000rpm × 5min，弃上清, 加入 25-50 ml ddH2O 或 TE 重悬洗涤酵母沉淀 11 细胞，离心弃上清，重复洗涤一次，沉淀用 1.5 ml 1×TE/LiAc 重悬后，即为酵母感 受态细胞; 4. 准备下列试剂： 10 × TE 10 × LiAc 50% PEG ddH2O 1×TE/LiAc 1.50 ml 150 ul 150 ul / l.20 ml PEG/LiAc 10 ml 1.0ml 1.0ml 8.0ml / 1×TE 10 ml 1.0ml / / 9.0ml 5. 取 1ml 用 1.5 ml 1×TE/LiAc 重悬的酵母感受态细胞，加入以下成分，振荡混匀： cDNA 文库质粒 100ug 10 mg/ml Sperm DNA* 200ul *Sperm DNA 新配制时水浴煮沸 20 分钟，立即插入冰浴，保存于-20°C 6. 加入 6ml PEG/LiAc，剧烈振荡（提高转化效率），30°C恒温，200rpm 振荡培养 30min; 7. 加入 700ul DMSO，缓缓倒置混匀(不能振荡)，42°C 水浴热休克 15min(间歇轻柔混 匀)，迅速插入冰浴冷却 1-2min; 8. 室温离心 2500rpm × 5min，尽量弃尽上清，以 10ml 1×TE 重悬沉淀细胞，取 200 ul 涂布φ150mm 的 SD/ -Trp-Leu 固体培养板（共 50 块），同时取 12ul 菌液加 108ul 1×TE 后作 1:10，1:102，1:103 稀释，涂布 3 块φ90mm 的 SD/ -Trp-Leu 固体培养板 （用于计算转化效率），30°C 倒置培养 3-5 天。 附表 不同规模转化酵母感受态细胞 小规模 大规模 库规模 1. YPDA 或 SD 液体培养基扩增酵母 50ml 50ml 150ml 2. YPDA 液体培养基扩增酵母菌 300ml 300ml 1000ml 3. TE 或 ddH2O 洗涤酵母细胞 25-50ml 25-50ml 500ml 4. 准备 A. 1×TE/LiAc 1.50 ml 1.50ml 8.0ml B. PEG/LiAc 10ml 10ml 100ml C. 1×TE 0.5ml 1ml 或 10ml 10ml 5. 分装 A.DNA-BD vector 0.1ug 20-100ug 0.2-1.0mg B.AD vector 0.1ug 10-50ug 0.1-0.5mg C.Sperm DNA(10mg/ml) 10ul 200ul 2.0ml 6. 1×TE/LiAc 重悬感受态细胞 1.5ml 1.0ml 8.0ml 酵母感受态细胞 100ul×20 1.0ml 8.0ml 7. 加 PEG/LiAc，剧烈振荡 0.6ml×20 6.0ml 60.0ml 8. 加 DMSO，轻柔混匀 70ul×20 700ul 7.0ml 9. 室温离心后弃上清 14000rpm×5sec 2500rpm×5min 2500rpm×5min 10. 1×TE 重悬感受态细胞 0.1ml×20 6.0ml 10.0ml 铺固体选择培养基平板 φ90mm×20 φ150mm×50 φ150mm×50 12 注：小规模转化用于：（1）检验 DNA-BD/bait 有无自身激活报道基因的能力; （2）观测 DNA-BD/bait 对宿主的毒性作用; （3）对照实验; （4）筛库前先转入 DNA-BD/bait; 大规模、库规模转化用于：转入文库质粒或同时转化两种质粒筛库; 转化子的筛选与库质粒纯化 一. 培养基： SD/-Trp-Leu-His-Ade/3-AT/X-α-GAL 固体培养基 (121°C，灭菌 15min) A. SD Agar Base (Clontech 公司) 4.67g B. 10 × DO (-Leu-Trp-His-Ade) (Clontech 公司) 10.0 ml C. ddH2O → 100.0 ml 121°C，灭菌 15min，冷却到 50℃加入适量 5M 3-AT（至终浓度 15mM）与 100ul X-α-GAL(20mg/ml),铺 5 块平板(90-100mm) 65%甘油-硫酸镁缓冲液 A. 甘油 65ml B. Mg2SO4·2H2O 2.465g C. 2.0M Tris·HCl 1.25ml D. ddH2O → 100.0ml 二. 实验步骤： 1. 选择菌落数 30-300 的滴度平板计算转化效率与克隆总数： 假设 100ug 库质粒转化时重悬菌液 10ml, 以 100ul 菌液涂布的 1:100 的滴度板上菌 落数 100，则： 2. 筛库要求克隆总数超过文库克隆数（胎肝库为 1.6×106 克隆）的十倍；若克隆总数 低于 106 则需重新转化; 3. 将平板移至 4°C 冰箱，固化琼脂 3-4 小时; 转化效率： 克隆总数： 13 4. 超净台中，向每块平板滴加 5ml 1×TE，用涂布棒刮下菌落，收集于 50ml 离心管; 5. 室温离心 2500rpm×5min，弃上清。用无菌双蒸水反复洗涤 3-5 次; 6. 保存菌种：每管取 0.5ml 菌液与 0.5ml 65%甘油·硫酸镁混匀，-70°C 冻存; 7. 取适量菌液（使克隆总数达文库滴度的 5-10 倍），涂布 SD/ -Trp-Leu-His-Ade 筛选 平板，30°C 倒置培养 3-5 天至菌落出现; 8. 挑取菌落点种到 SD/ -Trp-Leu-His-Ade/3-AT/X-α-GAL 平板，30°C 倒置温育，显兰 色的菌落即阳性候选克隆; 9. 阳性候选克隆分区划线接种于 SD/ -Trp-Leu /X-α-GAL 平板上，30°C 倒置温育 3 天，使同一酵母菌中几种库质粒分离; 10. 挑取再次显兰色菌落重复上一步; 11. 此次所得兰色菌落点种于 SD/ -Trp-Leu-His-Ade/3-AT/X-α-GAL 平板，30°C 倒置温 育 1-2 天，显兰色的菌落即可用于质粒提取鉴定。 14 酵母双杂合系统阳性克隆的鉴定 —— 酵母质粒 DNA 的提取 一. 试剂与培养基： SD/-Leu 培养液，(121°C，灭菌 15min) A. SD Base (Clontech 公司) 2.67g B. 10 × DO (-Leu-Trp) 10.0 ml C. 20 ×Trp 5.0 ml D. ddH2O → 100.0 ml 酵母裂解液:2%Triton X-100; 1% SDS; 100mM NaCl; 10mM Tris,pH8.0; 1mM EDTA A. 10% Triton X-100 20.0ml B. 10%SDS 10.0ml C. NaCl 0.58g D. Tris 0.12g E. EDTANa2·2H2O 0.12g F. 1.0N HCl → pH8.0 G. ddH2O → 100.0ml 二. 实验步骤： 1. 挑取经过酵母营养缺陷平板筛选并分离的兰色酵母单菌落，接种于 5.0ml SD/-Leu 液体培养基，30°C 恒温，250rpm 振荡培养 1-2 天，使丢失 pGBKT7/bait 质粒; 2. 室温离心 5000rpm×1min，弃上清; 3. 加入酵母裂解液 200ul，振荡重悬菌团; 4. 加入玻璃珠(sigma)0.2g，苯酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）0.2ml, 涡流振荡 5min; 5. -70℃保存过夜或液氮冻存 10 min; 6. 室温复融，再振荡 5 min; 7. 室温离心 12000 rpm×10min，上清转移至新的 1.5 ml 离心管中，加入 3MNaAc （1/10V）20ul，无水乙醇（2.5V）500ul，-70℃冻存 30-60min; 8. 离心 12500 rpm×10min，4℃，弃上清；70%乙醇洗涤沉淀，于 37℃烘箱或超净台 干燥 DNA；以 20-30ul 无菌 ddH2O 重悬 DNA，保存于-20℃。 15 大肠杆菌感受态细胞的制备（电转化） 一．培养基： SOB 液体培养基，115℃，101b/in2 灭菌 15min A. bacto-Tryptone 10.0g B. bacto-Yeast Extract 2.5g C. NaCl 0.25g D. KCl 0.09g E. MgCl2·6H2O 1.02g F. ddH2O → 500.0ml 二. 实验步骤： 1． 挑取 LB 固体培养基上生长的 E.coliKC8 单菌落，接种于 5ml LB 液体培养基中，37℃恒 温，250 rpm 振荡培养过夜; 2． 将 2.5ml 新鲜菌液接种于 500mlSOB 培养液中，37℃恒温，250 rpm 振荡培养至 OD600=0.5-0.6（约 2.5-3hr）; 3． 将培养菌液收集于离心管中，冰水浴 15-20min; 4． 离心 6000 rpm×10min，4℃，弃上清；以 5ml 预冷的无菌 ddH2O 重悬菌团，再加入 500ml 预冷的无菌 ddH2O 洗涤沉淀细菌; 5． 重复上述步骤 1 次，以充分去除培养基中残余的盐离子成分; 6． 用 40-50ml 预冷的无菌 10%甘油重悬沉淀细菌，转移至 50ml 无菌离心管中，离心 6000 rpm×10min，4℃，弃上清；重复此步骤 1 次; 7． 以等体积（约 1.5-2.0ml）预冷的无菌 10%甘油重悬上述沉淀的感受态细胞，分装 200ul/ 管（5 次转化反应），冻存于-70℃备用。 文库质粒 DNA 电转化大肠杆菌 E.coliKC8 1． 冰浴条件下，取 2ul 待转化质粒 DNA 加入 40ul 感受态细胞中，混匀; 2． 加入间距 0.1cm 样品杯，电转化（1.8KV，25uF，200Ω）; 3． 迅速加入 1ml 新鲜 LB 培养液，混匀，转入 1.5ml 离心管，37℃恒温，250rpm 振摇孵育 1h; 4． 离心 2500rpm×5min，4℃，弃上清，保留 100ul 菌液涂布 LB/Amp 平板，37℃倒置温育。 16 碱裂解法小量制备细菌质粒 DNA 1. 挑取 LB 固体培养基上生长的 E.coli.入单菌落，接种于 2.0ml LB 液体培养基中，37℃恒 温，250rpm 振荡培养过夜(约 12-14hr) ; 2. 取 1.5m1 新鲜过夜菌，室温离心 8000rpm×1min,弃尽上清; 3. 将沉淀细菌振荡悬浮于 100u1 溶液 I ; (溶液 I：50mM 葡萄糖；25mM Tris·Cl; 10mM EDTA，pH8.0) A. 2.0M Tris-C1，pH8.0 6.25ml B. 0.4M EDTA, pH8.0 12.50ml C. 葡萄糖 4.730g D. ddH2O → 500ml 4. 加 200u1 新鲜配制的溶液Ⅱ，倒置数次混匀; (溶液Ⅱ：0.2M NaOH；1％SDS) A. 10M NaOH 0.1 ml B. SDS 0.5 ml C. ddH2O 4.4 ml 5. 加入 150u1 预冷的溶液 III，振荡混匀；离心 12000rpm× 5min，4℃，弃沉淀; (溶液Ⅲ：KAc 缓冲液，3.0MK+; 5.0M Ac-) A. 5MKAc 300.0 ml B. 冰乙酸 57.5 m1 C. ddH2O 142.5 m1 6. 上清加入 450ul 的苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1),振荡混匀,离心 12000rpm× 5min,4℃; 7. 取上层水相，加 0.9ml 预冷无水乙醇,-20℃静置 2hr 以上,离心 12000rpm×l5min,4℃; 8. 将沉淀 DNA 用 70%乙醇洗 1 次，37℃烘箱或超净台干燥 DNA; 9. 沉淀 DNA 重溶于 20ul TE 缓冲液(含 RNase 10-20ug)，37℃水浴 1-2hr 后进一步酶切 分析或保存于-20℃。 (TE 缓冲液：l0mM Tris-Cl;1mM EDTA) A． Tris 1.2lg B． EDTANa2·2H2O 0.37g C. ddH20 800.0ml D. 1.0N HCl 调 pH 至所需 E． ddH20 → 1000.0ml 17 DNA 的限制性内切酶分析 1. 限制性内切酶分析一般在 0.5ml 或 1.5ml Eppendorf 离心管内进行，在适当的温度(通常 为 37℃)水浴消化 1-2hr; 2. 一般每 20u1 反应体系如下： A． DNA(0.2-2ug/ul) 7.0ul B． 10×酶切缓冲液 2.0ul C． 限制性内切酶(10-20U／ul) 1.0ul D． ddH2O 10.0ul 3. 用于制备时，反应总体积可达 50-200ul，各反应组分相应增加。 4. 多酶消化时若缓冲液条件相同，可同时加入；否则，先做低温或低盐的酶消化，再做高 温或高盐的酶解。 本试验目的是将文库质粒按酶切图谱归类，因此所用酶为高频酶：HaeIII 或 AluI 酶。 DNA 片段的连接 1. DNA 片段的连接一般在 0.5ml 或 1.5m1 Eppendorf 离心管内进行，一般每 20 ul 反应体系 如下，在适当的温度(通常为 12-15℃)水浴 8-14hr： A．载体 DNA(0.1-2ug/ul) 2.0ul B．插入 DNA(0.1-2ug/ul) 10.0ul C．10×T4 连接缓冲液 2.0ul D．T4 DNA 连接酶(1.0U／u1) 1.5-2.0ul E．ddH2O 4.5-5.0ul 2. 单酶位点连接时，为避免自身环化可进行脱磷酸化反应，一般在限制性酶切反应结束时， 每 20L11 反应体系加入 2.0ul 10×CIP 缓冲液和 1-1.5U CIP 酶，37℃水浴 30-60min，补 加 0.5M EDTA，pH8.0 1.0ul，75℃热变性 5min 灭活 CIP，然后苯酚：氯仿：异戊醇抽 提，乙醇沉淀回收酶解 DNA 片段，再进行连接反应。 3. 平端连接时，使用高浓度 T4 DNA 连接酶(5-10U/ul)，并加入 15％终浓度的 PEG8000。 18