实时荧光定量PCR技术在转基因检测中的应用

实时荧光定量 PCR技术在转基因检测中的应用 收稿日期：2008-03-05 基金项目：东北农业大学创新团队项目（CXT004-3-2） 作者简介：敖金霞（1977-），女，黑龙江人，博士研究生，助 研，主要从事转基因作物基因检测技术方面研究。 *通讯作者：教授，博士生导师，E-mail: gaoxj5390@sina. com. cn 敖金霞1，高学军1*，仇有文1，郭士成2 （ 1． 东北农业大学生命科学与生物技术研究中心，农业部转基因生物产品成分监督检测测试中心，哈尔滨 150030； 2． 东北农业大学生命科学学院，哈尔滨 150030） 摘 要：实时荧光定量 PCR技术是一种新型的核酸定性、定量检测、分析技术。随着转基因产品大规模商 业化，转基因生物的环境安全和食用安全性问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 引起了全球范围内广泛的争论和关注。实时监测、定量准确、 灵敏度高、反应速度快、重复性好及 PCR反应后不需电泳检测等优点，使 RQ-PCR逐步成为转基因检测的重 要工具。 关键词：实时荧光定量 PCR；TaqMan 探针法；SYBR Green I染料法；转基因检测 中图分类号：TS207.3 文献标识码：A 随着有关转基因成分标签法的建立和对于转 基因食品的重视程度及量化要求的提高，定性 PCR 因其在转基因检测中的高敏感性差易造成假 阳性现象，以及操作误差和一些反应抑制因素带 来的假阴性现象，使其已经不能再满足人们的需 要。在这种基础之上实时荧光定量 PCR（Real-time quantitative polymerase chain reaction，RQ-PCR）发 展起来，RQ-PCR技术不仅实现了对 DNA模板的 定量，而且具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、 能实现多重反应、自动化程度高、无污染性、具 实时性和准确性等特点。目前实时荧光定量 PCR 已广泛应用于分子生物学、农业、医学等学科的 应用和基础研究领域，并已经在转基因检测中发 挥了不可替代的作用[1-2]。 1 RQ- PCR的基本原理 实时荧光定量 PCR 技术是指在 PCR 反应体 系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时 监测整个 PCR 进程，最后通过 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 曲线，对待 测样品中的未知模板进行定量分析的方法。标记 方法根据 RQ-PCR所使用的荧光化学物质，主要 可分为：DNA结合染料法（SYBR Green I染料法）、 TaqMan探针法、分子信标法。另外还有 MGB探针 法、荧光标记引物、杂交探针（Hybridization Probe） 法等。下面仅对几种常用的 RQ-PCR 方法介绍如 下。 1．1 TaqMan 探针法 TaqMan 探针是一段人工设计的可以和目标序 列上、下游引物之间的序列配对的寡核苷酸，5' 标记一个 报告 软件系统测试报告下载sgs报告如何下载关于路面塌陷情况报告535n,sgs报告怎么下载竣工报告下载 荧光基团，3' 标记一个淬灭荧光基 团。当探针完整时，报告基团发射的荧光信号被 淬灭基团吸收。但在进行延伸反应时，Taq 酶的 5' →3' 外切酶活性将探针酶切降解，失去荧光信 号。随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基 团不断积累。因此荧光强度与扩增产物的数量呈 正比。 1．2 SYBR Green I染料法 SYBR Green I是一种结合于小沟中的双链 DNA 结合染料。在 PCR反应体系中，加入 SYBR荧光染 料，SYBR Green I荧光染料在延伸过程中特异性地 掺入 DNA双链后发射荧光信号，而没有掺入链中的 SYBR染料分子不发射任何荧光信号，从而保证荧光 信号的增加与 PCR产物的增加完全同步[2]。 2 RQ- PCR在转基因检测中的应用 RQ-PCR的一系列优点使其在转基因产品的定 性检测、品系鉴定、转基因成分含量的检测中被广 泛的应用。 第 40卷 第 6期 东 北 农 业 大 学 学 报 40(6): 141~144 2009年 6月 Journal of Northeast Agricultural University June 2009 文章编号 1005－9369（2009）06－0141－04 2.1 确定是否为转基因产品的定性检测 利用荧光定量 PCR技术，根据检测样品 CT值 的范围，即可快速准确的判断转基因成分的有无。 到目前为止我国已经自行设计了实时荧光 PCR定 性检测引物 32 对和相对应的探针，建立了转基因 产品实时荧光 PCR定性检测方法，该方法能检测 目前国内外已报道的主要商品化转基因品种。RQ- PCR用于转基因大豆、玉米、小麦、油菜等农作 物的检测，目前主要检测这些转基因作物中特有的 启动子 35 S、终止子 NOS、耐除草剂基因 EPSPS 或抗虫基因 CryIA（b）等转基因成分，以确定是否 为转基因产品 [3]。Hernandez 等建立了检测转基因 玉米 Mon810的加工产品中转基因成分的实时荧光 定量 PCR技术[4]。Taverniers 等利用荧光定量 PCR 技术，对抗草丁膦油菜籽中 Barnase基因进行了检 测，并对 14批油菜籽样品进行了检测分析[5]。另外， Marta等利用 DNA结合染料 SYBR Green I 和扩增 产物的熔解曲线分析对多种转基因成分进行多重实时 定量 PCR检测，得到了针对 Maximizer 176、Bt11、 MON810、GA21和 GTS 0-3-2的扩增产物并通过 其特定的 Tm 值进行鉴定，灵敏度达到了 0.1%[6]。 Alary等通过实验比较了常规实时荧光定量 PCR和 双重荧光定量 PCR方法，证明了二者所得结论基 本一致，因此可以预计多重荧光定量 PCR方法必 将成为转基因检测的重要方法[7]。 2.2 转基因产品品系的鉴定 针对特定的转基因植物品系，设计特异性荧 光定量 PCR引物，可以进行准确的品系鉴定。目 前，荧光定量 PCR 技术已经被用在大豆、玉米、 油菜等转基因植物的品系鉴定中。如 Kim等利用 TaqMan方法建立了鉴定转基因油菜 RT73品系的方 法[8]。Peanoa等利用荧光定量 PCR技术实现了对进 口抗草丁膦油菜籽中的 Barnase基因进行了品系检 测[9]。Shindo等应用 TaqMan 荧光探针，成功建立 了检测转基因玉米 Bt176品系的实时荧光 PCR方 法。在所有的转基因植物中转基因玉米的品系相对 较多[10]，目前已经利用 TaqMan探针等实时荧光定 量 PCR 方法已经建立了商品化的转基因玉米 Bt176Bt11、MON810、GA21等品系的检测方法[11]。 对于其他品系如 Mon810、T25、NK603 等通过实 验证明均可通过实时荧光定量 PCR技术进行品系 验证[12]。 2.3 转基因产品含量的检测 根据 RQ-PCR的定量原理，可以快速的得到 检测样品的转基因成分的准确含量。我国己经初步 建立了以 TaqMan 为探针的荧光定量 PCR 法，在 部分口岸已进行转基因产品的定量检测，目前 TaqMan探针已经被用在转基因农作物或初加工制 品（玉米、棉花、水稻、烟草、大豆、豆粉）进行定 量检测，检测灵敏度均达到了 0.1%（w/w）[13]。Hird等 利用 RQ-PCR对若干植物及其加工产品的转基因成 分进行了检测，检测结果显示 RQ-PCR的转基因大 豆检测结果与标准含量的误差仅为 1.0%，在三种不 同玉米标准品中误差仅为：2.0%、10.0%、7.0%[14]。 Song 等采用实时荧光定量 PCR技术，通过使用特 异的引物和探针，对玉米中的内源基因 Invertase 和转基因玉米 Mon810、Event 176中的外源基因进 行了定量检测，建立了商业化转基因玉米 Mon 810 和 Event 176的定量 PCR检测方法。该方法的检测 灵敏度小于 0.01%，是国际上设定的转基因最低限 量的 100倍[15]。此外荧光定量 PCR在转基因水稻[16]、 转基因动物[17]、转基因烟草的定量研究中同样发挥 着其他转基因定量检测无可比拟的优越性[18]。一些 国家如西班牙，意大利和法国规定普通小麦在面条 和粗粒小麦粉中的含量，Arne 等证实利用 RQ- PCR 是估计这些食品中普通小麦量的理想技术[19]。 3 RQ- PCR技术的展望 RQ-PCR 技术自面世以来，短短的几年内就 被广泛应用到生物学的各个领域，涉及到的范围包 括 DNA、mRNA 和病毒荷载量的定量、核酸多态 性分析、基因突变分析等多个领域。准确、灵敏、 快速的 RQ-PCR技术己发展成为一项完全自动化 的核酸定量技术，大大降低了假阳性率，工作效率 高，结果重现性好，且不必使用对人体有害的染色 剂等优点。 和所有刚出现的技术一样，RQ-PCR 在作为 标准技术应用之前仍存在许多问题：① 参照物的 选择：在标准曲线定量中，标准品的制备是一个必 不可少的过程。目前由于没有统一标准，各个实验 室所用的生成标准曲线的样品各不相同，致使实验 结果缺乏可比性；② 探针制备的成本和新的荧光 染料的开发；③ 分析灵敏度的进一步提高及重复 性问题[20]；④ 自动化仪器和试剂成本较高；⑤ 样 ·142· 东 北 农 业 大 学 学 报 第 40卷 品处理制备及多基因同时分析等。随着 RQ-PCR 技术与生物芯片技术、肽核酸技术，荧光探针定量 技术等先进技术的整合，RQ-PCR应用前景将越来 越广阔。同时 RQ-PCR 技术将会在转基因检测中 发挥不可替代的作用[21]。 [ 参 考 文 献 ] [ 1 ] Gianluca B, Lucia R, Franco D, et al. 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College of Life Sciences, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China) Abstract: Real-time quantitative PCR is a newly developed technique for both nucleic acid analysis and quantitative measurement. As the development of the Genetically Modified Organisms, the securities of the environ- ment and food result have been paied the whole world peoples’ widely attention. The merits of the real-time quantitative PCR, such as its good accur-acy, real-time, quickness, repeatability and there be no need to take the electrophoresis, enable it to be one of the most important tools in the check of the GMO ． Key words: real-time quantitative PCR; TaqMan probe method; SYBR Green I method; Genetically Modi- fied Organisms ·144· 东 北 农 业 大 学 学 报 第 40卷