应用BOLD MRI评价马兜铃酸和庆大霉素对急性肾小管

http://www.paper.edu.cn -1- 中国科技论文在线 应用 BOLD MRI评价马兜铃酸和庆大霉素对急性肾 小管坏死大鼠模型的肾组织氧合水平的影响 曹菊 1，杨学东 2，王霄英 2，屈磊 1，刘刚 1，李晓玫 1 1. 北京大学第一医院肾内科，北京（100034） 2. 北京大学第一医院医学影像科，北京（100034） E-mail：xiaomei0708@gmail.com 摘 要：目的 探讨马兜铃酸（AA）及庆大霉素所致急性肾小管坏死（ATN）大鼠的肾组 织氧合水平特点。 方法 28 只健康雄性 Wistar 大鼠随机分为对照组（n＝12）、AAN 模型 组（n＝7）和庆大霉素组（GM，n = 9），分别背部皮下注射生理盐水、马兜铃酸钠盐生理 盐水溶液（AA-I 25mg·kg-1·d-1）和庆大霉素（200 mg·kg-1·d-1）共 4日，于给药后第 7日处死。 给药后第 4日及第 7日行大鼠肾脏 BOLD MR成像，并留取血、尿及肾脏标本，观察肾功能 及肾脏病理改变。 结果 AAN组大鼠第 7天时血肌酐及尿 NAG酶水平显著增高，肾脏病 理结果显示，病变部位主要位于皮髓交界区，表现为肾小管弥漫性坏死，无间质水肿或炎细 胞浸润。BOLD-MRI 显示，AAN 组与对照组相比，肾髓质 R2*在第 4 天（50.6±15.6/s vs. 35.6±4.3/s, P<0.01）和第 7天（58.4±14.8/s vs. 37.8±3.6/s, P<0.01）均显著升高，肾皮质 R2* 在第 7天较对照组显著升高（40.3±14.7/s vs. 28.7±3.2/s, P<0.05）。GM组大鼠第 7天时血肌 酐及尿 NAG 酶水平均显著升高，但其肾脏 R2*变化趋势与 AAN 组明显不同，主要表现为 肾皮质 R2*值在第 7天较对照组明显降低（17.7±2.7/s vs. 28.7±3.2/s, P<0.01）。 结论 急性 AAN 大鼠模型中肾组织存在缺氧，其特征为肾髓质的氧合水平降低早期出现并持续存在， 肾皮质的氧合水平在后期逐渐降低，与 GM所致 ATN有所不同，可能是促进肾间质纤维化 持续进展的原因之一。 关键词：马兜铃酸肾病；急性肾小管坏死；血氧水平依赖核磁成像 马兜铃酸（Aristolochic Acid，AA）引起的急性肾小管坏死中，肾小管上皮细胞损伤后 呈低再生状态，且伴有早期出现并呈快速进展的肾间质纤维化，发生机制尚未完全明确[1 - 2]。 既往研究间接提示肾脏局部的缺血缺氧可能参与了AAN的发病机制[3 - 4]，然而，受 检测 工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训 方法 的制约，至今尚缺乏AAN中肾脏组织氧合水平变化的直接评价证据。近年出现的血氧水平 依赖核磁成像(Blood oxygenation level-dependent MRI，BOLD MRI)利用含氧血红蛋白为自体 探针，可直接检测组织氧分压，正逐渐被开发并应用于临床[5]。本研究中，我们利用BOLD MRI观察肾脏组织氧合状态的变化，旨在探讨AAN及庆大霉素所致ATN发病过程中肾组织 缺血缺氧状态的变化特征及其与肾功能和病理改变之间的关系。 1 材料与方法 1.1 材料 清洁级雄性 Wistar 大鼠 28 只，购自中国医学科学院试验动物研究所（合格证号：SCXK （京）2005－0013），并饲养于北京大学第一医院动物实验室。大鼠经适应性饲养 2d 后，随 机分为 3 组。（1）对照组（n＝12）：背部皮下注射 0.9%生理盐水 1ml/d，共 4d，于给药后 第 7 日处死；（2）AAN 组（n＝7）：背部皮下注射马兜铃酸钠盐生理盐水溶液（AA-I 25 mg·kg-1·d-1），共 4d；（3）GM 组（n = 9）：背部皮下注射庆大霉素生理盐水溶液（200 mg·kg-1·d-1），共 4d。各组大鼠于第 6 日入代谢笼，禁食自由饮水。第 7 日留取 24h 尿后于 北大医院门诊核磁室行 MRI 扫描。MRI 扫描后立即处死大鼠，留取血标本和肾脏病理标本 本课题得到高等学校博士学科点专项科研基金（20060001126）资助。 http://www.paper.edu.cn -2- 中国科技论文在线 待检测。 1.2 MRI 扫描 使用 GE Sigma Excite 3.0T 磁共振扫描仪，3 英寸专用表面线圈，大鼠予 2％戊巴比妥钠 （购自北京化学试剂公司）40mg/kg 腹腔注射麻醉后取仰卧位，四肢固定。扫描轴位 T1WI、 T2WI 及 BOLD。BOLD 成像用多回波 GRE 序列，具体参数：TR/TE/FA/BW/Matrix/层厚/ 间隔分别为 100ms/2-31.4ms（16 个回波）/450/31.3kHz/ 96×96/3mm/0mm。由 1 名有经验的 MRI 医师对所有检查的肾脏 T1WI、T2WI 图像进行单盲评价，观察肾脏皮髓质形态及信号。 1.3 生化指标检测及肾脏病理检查 尿标本记录尿量后于 1500r/min 离心 5min，留取上清（COULTER LX20 型自动生化分 析仪，美国 BECKMAN 公司）分别进行尿液 NAG（酶法）、MA（免疫比浊法）的检测。大 鼠经腹主动脉取血，血标本置室温中 1h 后 2000r/min 离心 10min，留取血清检测血清肌酐 （Scr）浓度（COULTER LX20 型自动生化分析仪，美国 BECKMAN 公司）。肾脏组织病理 学观察：肾组织标本用10％甲醛固定，4℃保存，按常规制备光镜标本，行HE染色。用Olympus 显微镜观察肾组织病理改变并拍照。 1.4 数据测量 本课题组已经在先前的研究中证明不同观察者间和同一观察者自身测量的数据具有较 高的重复性[6]。故本研究由一名研究者单盲完成数据测量。方法为将扫描数据传至 AW 4.2 工作站，用 Functool 软件生成 R2*图，然后测量右肾皮髓质的 R2*，对于右肾因肠气等原因 有明显伪影者测量左肾数据。R2*测量方法：尽量在靠近肾门水平，选取 1～2 个层面的皮 髓质上测量，避开伪影干扰区，分别选取至少 4 个 ROI（每个 ROI 的像素数大于 5），计算 其平均值。 1.5 统计学处理 所有计量资料以均数± 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 差表示，组间比较采用多组秩和检验及两两组间比较。所有 统计学处理均由 SPSS 13.0 for windows 统计软件完成，当 P<0.05 时认为差异有统计学意义。 2 结 果 2.1 大鼠一般情况 与对照组相比，AAN 组大鼠于第 2 日开始出现活动减少，精神较差，毛发异常，体重 增长缓慢，在第 4 天出现体重下降，AAN 组有 2 只大鼠在第 7 天死亡。GM 组大鼠第 4 日 起出现活动减少，精神较差，毛发异常，体重增长缓慢，在第 7 日出现体重下降。 2.2 肾小球功能及肾小管功能的变化 如表 1 所示，AAN 组的血肌酐水平及尿 NAG 酶水平（经体重校正）在第 7 天时均较 对照组显著升高。尿 MA 较对照组呈增高趋势，差异无统计学意义。GM 组的血肌酐水平及 尿 NAG 酶水平也较对照组显著增高，尿 MA 水平与对照组相比，无统计学意义差异。 2.3 肾脏病理改变 如图 1 所示，在光学显微镜下，对照组大鼠肾脏形态学表现基本正常，AAN 组大鼠肾 脏皮髓交界处弥漫性小管坏死，基底膜断裂，无明显炎症细胞浸润；皮质可见弥漫性肾小管 http://www.paper.edu.cn -3- 中国科技论文在线 上皮细胞肿胀，空泡变性，可见局灶性肾小管上皮细胞坏死 脱落，偶见裸基底膜，局部无明显水肿，无明显炎性细胞浸润。AAN 组大鼠的肾小球未见 明显病变。GM 组大鼠肾皮质近曲小管上皮细胞浑浊肿胀、空泡变性，刷状缘脱落，伴有小 管上皮细胞坏死，脱落入管腔，管腔内可见坏死物质，无明显间质水肿，少量炎症细胞浸润。 表 1 三组大鼠第 7 天的肾小球功能及肾小管功能 注：a与对照组相比，P<0.05 2.4 肾脏 BOLD MR 变化 图 2 为大鼠肾脏肾门层面 BOLD 图像，可见 AAN 组大鼠较对照组及 GM 组大鼠肾脏 髓质信号均增高。 表 2 显示 3 组大鼠肾脏皮髓质在第 0、4、7 天的 R2*值。第 0 天对照组 2 只大鼠和 AAN 组 1 只大鼠因伪影明显，无法测量肾组织 R2*值，第 7 天对照组 3 只大鼠伪影明显，无法测 量肾组织 R2*值。在第 0 天时，AAN 组与对照组大鼠间肾脏皮质和髓质 R2*值无统计学差 异；第 4 天时，AAN 组大鼠肾脏髓质 R2*值较对照组明显增高（50.6±15.6/s vs. 35.6±4.3/s， P<0.01），而两组大鼠肾脏皮质的 R2*值无统计学意义差异；第 7 天时，AAN 组大鼠肾脏髓 质 R2*值仍显著高于对照组（58.4±14.8/s vs. 37.8±3.6/s，P<0.01），AAN 组大鼠肾脏皮质 R2* 值较对照组升高（40.3±14.7/s vs. 28.7±3.2/s，P<0.05），差异有统计学意义。GM 组大鼠与 AAN 组大鼠肾脏皮髓质 R2*值变化不同，在第 0 天和第 4 天，GM 组与对照组大鼠间肾脏 皮质和髓质 R2*值无统计学意义差异，第 7 天 GM 组肾脏皮质 R2*值较对照组明显降低 （17.7±2.7/s vs. 28.7±3.2/s, P<0.001），差异具有统计学意义，肾脏髓质 R2*值较对照组也有 所降低（34.0±2.6/s vs. 37.8±3.6/s, P<0.05）。 组别 鼠数 （只） 血 肌 酐 （μmol·L-1·g-1） 尿 MA（mg·L -1 ·g-1） 尿 NAG（u·L-1·g-1） 对照组 12 0.21±0.06 0.029±0.020 0.041±0.016 AAN 组 5 2.94±0.81 a 0.19±0.22 0.075±0.027 a GM 组 9 0.86±0.30 a 0.039±0.045 0.12±0.069 a A B http://www.paper.edu.cn -4- 中国科技论文在线 图 1 大鼠的肾脏病理变化（HE 染色） A：对照组大鼠 40x；B：对照组大鼠 200x； C：AAN 组大鼠 40x；D：AAN 组大鼠 200x； E：GM 组大鼠 40x；F：GM 组大鼠 200x 图 2 大鼠肾脏肾门层面 BOLD 图 A：对照组大鼠；B：AAN 组大鼠；C：GM 组大鼠； 长箭头所示为肾皮质呈低信号，短箭头所示为肾髓质呈高信号。 表 2 第 0、4、7 天三组大鼠肾脏皮髓质 R2* 组别 部位 第 0 天 第 4 天 第 7 天 皮质 25.0±2.0/s 26.5±2.4/s 28.7±3.2/s 对照组 髓质 33.5±2.8/s 35.6±4.3/s 37.8±3.6/s AAN 组 皮质 28.4±3.3/s 27.6±4.8/s 40.3±14.7/s a D C E F BA C http://www.paper.edu.cn -5- 中国科技论文在线 髓质 36.0±3.8/s 50.6±15.6/s a 58.4±14.8/s a 皮质 25.3±2.0/s 26.6±1.2/s 17.7±2.7/s a GM 组 髓质 34.0±2.6/s 32.5±2.3/s 34.0±2.6/s a 注：a与对照组相比，P<0.05 3 讨 论 BOLD MRI 作为一种核磁技术，可用于检测毛细血管氧分压水平，而毛细血管与组织 的氧分压基本一致，从而反映了组织的氧分压。毛细血管氧分压与氧合血红蛋白和去氧血红 蛋白的比值相关，由于去氧血红蛋白具有顺磁性，氧分压的变化可改变血液的磁性。BOLD MRI 即通过多回波（TE）梯度回波（mGRE）等序列检测血液核磁信号，由 R2*（1/T2*， 单位 Hz）来反映去氧血红蛋白的浓度，从而间接反映组织氧分压水平。R2*与去氧血红蛋 白浓度相关，当组织氧分压降低时升高[5]。 近几年分别在动物和健康志愿者中证实 R2*作为 BOLD MRI 的量化指标能较可靠地反 映肾脏局部氧合状况，Li 等及 Simon-Zoula 等的研究也显示健康人肾脏 R2*具有较好的重复 性[7 - 8]。本课题组前期研究结果显示，大鼠肾脏皮髓质基础 R2*值个体间及个体内的差异在 4%～7％。所以 BOLD MRI 作为一种无创方法，可稳定、可靠地评价肾脏皮髓质氧分压水 平[6, 9]。 与其他急性小管间质肾病不同，AAN 可表现为 ATN、肾小管功能障碍或慢性肾衰竭， 但其进程均为持续进展性的肾小管间质疾病，大部分患者肾功能逐渐恶化，最后进入终末期 肾脏病阶段[1, 10]，但其发病机制尚未明确。以往研究提示缺血缺氧机制可能参与了其肾小管 修复不良及肾间质纤维化的进程。然而，由于受氧分压水平检测方法的制约[11]，迄今为止 尚缺乏关于急性 AAN 肾脏组织氧合水平变化的直接证据，难以判断在 AAN 中是否确实存 在持续性的组织缺血缺氧，从而难以评价在 AAN 的进展中组织缺氧与病变进展的关系及其 意义。因此，在前期研究证实 BOLD MRI 为一可靠的无创检测氧分压水平的方法后，我们 应用这一方法观察了急性马兜铃酸肾病大鼠模型肾脏皮髓质组织氧合水平的变化，试图为回 答上述问题提供实验依据，为寻找可能临床应用的 AAN 治疗 措施 《全国民用建筑工程设计技术措施》规划•建筑•景观全国民用建筑工程设计技术措施》规划•建筑•景观软件质量保证措施下载工地伤害及预防措施下载关于贯彻落实的具体措施 奠定基础。 GM 组 ATN 大鼠肾脏病理可见肾皮质部位小管变性、坏死，肾组织氧合水平变化的特 征为肾皮质的 R2*值在第 7 天较对照组明显降低，提示肾皮质氧合水平升高。肾脏组织的氧 合水平反映了局部氧供与氧耗之间的平衡关系，氧合水平的增高可由于氧供增加、氧耗减少 或二者共同作用所致。首先，间质炎症反应可能会影响血管活性物质的平衡状态，促进舒血 管物质产生并增加管周微血管的血流量。其次肾小管正常结构被破坏后，细胞极性的丧失以 及 Na+-K+-ATP 功能受抑使得细胞不能再维持物质转运、重吸收，减少了损伤肾小管上皮细 胞的做功，从而造成了肾皮质氧合水平的增高[12]。 本研究制备的急性 AAN 大鼠模型主要表现为体重下降及显著的肾小球和肾小管功能异 常，病理上出现以肾脏皮髓交界部位为主的严重肾小管坏死。上述特征与以往国内学者以及 Lebeau 等所 报告 软件系统测试报告下载sgs报告如何下载关于路面塌陷情况报告535n,sgs报告怎么下载竣工报告下载 的急性 AAN 大鼠模型基本一致[13]。BOLD MRI 结果显示：AAN 组大鼠造 模后第 4 天的肾脏髓质 R2*值即开始增高，第 7 天 R2*值持续显著升高；而肾脏皮质 R2*在 造模的早期变化不明显，仅在第 7 天时较基线增高。上述结果表明，在急性 AAN 大鼠肾脏 中存在缺氧，缺氧的主要部位在肾髓质，肾皮质虽然可能也存在一定程度的缺氧，但髓质的 缺氧状态不仅出现的早，而且也较皮质更为严重。本课题组前期研究所发现的肾组织 HIF-1α 表达增加支持上述 AAN 肾组织缺氧状态的存在[4]。在本研究中，我们观察到急性 AAN 大 http://www.paper.edu.cn -6- 中国科技论文在线 鼠的肾小管坏死部位主要位于皮髓交界区，而这一部位由于供氧少、耗能多，属于对缺血缺 氧损伤最为敏感的区域。同时与 GM 组肾脏氧合水平升高明显不同，AAN 组大鼠肾脏氧合 水平降低，这提示尽管 AA 毒性作用所致小管上皮细胞坏死使做功耗氧减少，但可能由于同 时存在贫血；血管病变[14]；前列腺素系统异常及缩血管物质高表达或活性增强等多种因素， 使得 AAN 时肾组织的供氧减少更为显著，从而造成肾组织缺氧。 根据本组模型的病变分布特点、肾髓质的 R2*值升高较皮质变化早且程度重，以及停止 给药后其 R2*值持续高水平并伴随严重组织病变的多方面特征，高度提示在 AAN 的发病中 除 AA 的直接肾小管上皮毒性作用外，肾髓质部的缺血缺氧可能也是致病的重要机制之一。 本研究由于实验条件所限，仅观察了急性 AAN 大鼠模型第 7 天时的病理、生化及 BOLD MRI 改变，说明在急性 AAN 阶段存在缺血缺氧，而对于大鼠肾功能有所恢复或稳定在一定水平 后，肾脏组织的缺氧状态是否持续存在未能继续观察，因此，有待进一步的研究明确。 近年来，关于组织缺血缺氧在 AKI 的发生发展以及 CKD 持续进展中的病理生理作用得 到了许多新的认识。对于 CKD 的研究已表明，肾小管间质的慢性缺氧性损伤可能是各种 CKD 进展至终末期肾衰竭（ESRD）的共同途径。持续缺氧的存在可造成肾脏疾病持续进展， 是肾间质纤维化发生和发展的重要机制之一。由此可见，适时干预上述导致缺血缺氧的因素 以改善 AAN 患者的肾脏组织氧合水平将有可能延缓甚至阻止 AAN 的进展，有关措施值得 进行研究。 参考文献 [1] 李晓玫，杨莉，于洋，等. 木通所致肾小管间质肾病及其临床病理特点分析. 中华内科杂志, 2001, 40： 681－687. 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Renal Division, Departments of Medicine, First hospital, Peking University, Beijing (100034) 2. Department of Radiology, First hospital, Peking University, Beijing (100034) Abstract Objects To investigate the characteristics of renal oxygenation status in aristolochic acids I (AA-I) induced ATN rat model by method of blood oxygenation level-dependent MRI (BOLD-MRI) and compare it with ATN model caused by gentamicin. Methods 28 male Wistar rats were randomly divided into control, AAN and GM groups, which were subcutaneously injected with normal saline, AA-I (25 mg·kg-1·d-1) or GM (200 mg·kg-1·d-1) respectively for 4 days. Intrarenal oxygenation was measured by BOLD-MRI at 4th day and 7th day. Renal histopathological changes and renal function were also observed at day 7. Results Serum level of creatinine and urinary NAG were obviously elevated at day 7 in AAN and gentamicin group. Diffuse tubular necrosis confined to the margin of renal cortex and medulla without edema or infiltration of inflammation cells was the main pathological finding in AAN group. BOLD-MRI revealed that renal medullar R2* was elevated significantly at both day 4 (50.6±15.6/s vs. 35.6±4.3/s, P<0.01) and day 7 (58.4±14.8/s vs. 37.8±3.6/s, P<0.01) in AAN group when compared to control, showing opposite changes to GM group whose R2* was decreased at the same time. In addition, the renal cortical R2* in AAN group was also higher than that of control (40.3±14.7/s vs. 28.7±3.2/s, P<0.05) at day 7, showing opposite changes to GM group. Conclusion Intrarenal hypoxia exists in acute AAN rats, which initiates in the medulla following an involvement in renal cortex. The phenomenon of persistent low level of intrarenal oxygenation is different from change of GM-induced ATN, which may contribute to the progression of renal interstitial fibrosis in AAN. Keywords: Aristolochic acid nephropathy; Acute tubular necrosis; Blood oxygenation level-dependent MRI