噬菌体治疗的研究概况

噬菌体治疗的研究概况 钱震雯 ,岳启安 ,田凤丽 (潍坊医学院微生物教研室 ,山东 潍坊 261042) 中图分类号 :Q939.48 　　　　　文献标识码 :A 　　　　　文章编号 :100622084(2007) 1621256203 　　摘要 :近几十年来 ,由于抗生素的滥用导致的致病菌耐药性问题 ,已经对人类健康造成极大 威胁。细菌耐药性加剧使人类面临着严峻的现实———进入“后抗生素时代”。针对耐药菌日益 增多的情况 ,抗生素已无法达到理想的治疗效果 ,而噬菌体制剂作为一种新的治疗手段也倍受 人们关注。研究证明 ,噬菌体制剂具有许多抗生素无法比拟的优势 ,而且如对其进行适当的处 理 ,确实可在治疗中发挥其强大的抗菌作用。 关键词 :噬菌体 ;抗生素 ;耐药性 ;治疗 ;药物疗法 ,联合 StudyOverviewofPhagotherapy 　QIAN Zhen2wen , YUE Qi′an , TIAN Feng2li . ( Departmentof Microor2 ganism , Weifang Medical University, Weifang 261042 , China) Abstract:Drug2resistanceofpathogenicbacteriaresultingfromantibioticsabusageinrecentseveralde 2 cadeshasdonegreatthreatentohumanhealth.Aggravationofbacterialdrugresistancemakespeoplefacea draconicreality,thatispost 2antibioticsera.Withtheincreasingofdrugresistancebacteria,antibioticshave notachievedidealtherapeuticefficacy,phagotherapyisattractingmoreattentionfrompeopleasanewthera 2 peuticmethod.Studiesshowedthatphagotherapyhasmanyadvantagesthatmanyantibioticscannotachie 2 ved.Ifwecandealwithitusingafeasiblemethod,itwillreallyplaygreatantibacterialactionintherapy. Keywords :Bacteriophage;Antibiotics;Drug 2resistance;Therapy;Drugtherapy;Combination 　　细菌性感染是感染性疾病中最常见的类型 ,而抗生素自 发明以来 ,一直被认为是治疗细菌感染性疾病最有力的武器。 正因为这样 ,抗生素滥用的现象日益普遍 ,导致致病菌耐药性 日益加剧。据报道 ,目前在许多国家 25% 的肺炎链球菌已经 产生耐药性 ;美国 75%的细菌感染会对一种或多种抗生素产 生耐药性 ;日本 50% 以上的葡萄球菌分离株具有多重耐药 性 [1] 。随着越来越多耐药菌的出现 ,抗生素的治疗效果越来 越不明显 ,寻找新的抗菌制剂已经成为刻不容缓的课题。噬 菌体作为一种新兴的治疗方法 ,已经越来越受到医疗机构的 关注 ,美国医疗机构在 1999 年的国际噬菌体会议上预测 ,在 未来的 3～5 年内 ,美国医院将使用噬菌体制剂治疗抗生素无 法控制的感染 [2] 。 噬菌体是一类细菌依赖性的病毒 ,又称为细菌病毒 ,能在 菌体内快速增殖并最终裂解细菌从而达到抗菌效果。噬菌体 治疗就是利用噬菌体能裂解细菌的特性治疗临床人和动物的 细菌性感染。与传统抗生素治疗易产生残留和耐药菌等缺点 相比 ,噬菌体治疗更显示出其优越性。不可避免的是噬菌体 治疗同样有其局限的一面。随着人们对噬菌体分子生物学基 础的逐渐了解 ,可通过分子生物学技术等对已有噬菌体进行 探索性的改造 ,扬长避短 ,以期获得更好的治疗效果。 1 　噬菌体治疗的早期研究概况 英国的 EdwardTwort于 1915年在培养葡萄球菌时首次发 现了噬菌体 ,法国的 Felixd′Herelle在 1917年研究痢疾志贺杆 菌时亦发现了噬菌体 ,并用鸡伤寒、兔痢疾及人痢疾杆菌初步 证实了噬菌体可作为细菌性疾病的一种有效治疗因子 [3] 。 早在 19 世纪初噬菌体治疗就已经取得过可喜的成果。 Bruynoghe和 Maisin于 1921 年率先用噬菌体制剂治疗皮肤葡 萄球菌感染 [4] 。1934年美国科学家就报道了噬菌体疗法抗肠 球菌感染的成功率可达 80%, 在波兰 ,临床用噬菌体治疗金 葡菌、绿脓杆菌、肺炎球菌及大肠杆菌感染的成功率可达 90%, 俄罗斯科学家正在试验的噬菌体疗法已对泌尿系统感 染和化脓性炎症取得了显著疗效 [5] 。 据报道 ,噬菌体治疗的给药方式 有皮下注射、口服、局部及全身用药 , 治疗的疾病包括化脓性伤口感染、胃 肠炎、脓毒症、骨髓炎、皮炎、脓胸及肺 炎等。可治疗的病原菌包括葡萄球 菌、链球菌、克雷伯菌、埃希杆菌、变形 杆菌、铜绿假单胞菌、志贺菌及沙门菌 等 [6] 。 但噬菌体治疗的早期研究亦存在 许多问题 : ①由于噬菌体裂解细菌具 有高度特异性 ,故噬菌体的宿主范围 窄。②由于早期噬菌体是由细菌的粗 裂解物中分离得到 ,故噬菌体纯度不高。其中混有很多杂质 , 包括细菌内毒素 ,这些杂质会对噬菌体的治疗作用产生负面 影响。③对噬菌体行为模式缺乏深层次了解。常因无法区分 溶原性和裂解性噬菌体而错把溶原性噬菌体用做治疗 ,导致 疗效降低甚至无效。④噬菌体的稳定性差。早期的噬菌体制 剂常需加入汞制剂或氧化剂或是将其加热以确保无菌 ,但经 过这些处理后 ,噬菌体的活性均有降低 ,其疗效亦受到影响。 ⑤噬菌体制剂使用条件要求过高。⑥对噬菌体治疗的疗效无 法给出客观的评价 ,许多临床试验没有试验对照组 [729] 。 由于后来抗生素的迅速发展 ,加上噬菌体治疗本身存在 的诸多缺陷 ,噬菌体的研究工作几乎处于停滞状态 ,直到近几 十年来大量耐药菌的出现使抗生素的无效性愈来愈明显 ,噬 菌体治疗才又被人们所重视。 2 　治疗性噬菌体的选择 根据对宿主菌的作用方式不同 ,可将噬菌体分成温和噬 菌体和毒性噬菌体两类。毒性噬菌体感染细菌后即可在菌体 内快速增殖最终导致细菌的裂解 ,温和噬菌体感染细菌后可 出现两种结果 :一种是和毒性噬菌体一样裂解细菌 ,另一种是 不导致细菌裂解 ,而是将其基因组 DNA整合到宿主菌染色质 当中 ,成为宿主菌基因组的一部分 ,不单独复制 ,并能随宿主 菌增殖而传给下一代 ,该过程称为溶原性。带有噬菌体基因 组的宿主菌称为溶原性菌 ,整合到溶原性菌当中的噬菌体称 为前噬菌体。带有前噬菌体的溶原性菌可抵抗相应毒性噬菌 体的溶菌作用 , 故必须选择毒性噬菌体用于噬菌体治 疗 [3,10,11] 。 3 　噬菌体的溶菌机制 毒性噬菌体在成功地吸附于宿主菌之后 ,便开始其穿入 溶菌过程 ,因其结构和基因控制的不同而显示不同的溶菌机 制。 3.1 　抑制宿主菌胞壁质的合成导致宿主菌溶解 　此为小基 因组噬菌体的溶菌机制。缺乏溶壁酶的小基因组噬菌体利用 ·6521· 医学综述 2007年 8 月第 13 卷第 16 期　MedicalRecapitulate,August2007,Vol.13,No.16 多肽在不同阶段抑制宿主菌的胞壁质合成酶 ,从而在不同阶 段溶解宿主菌。如大肠杆菌单链 RNA噬菌体 Qβ并没有独立 的溶解基因 ,主要利用衣壳蛋白 A2 抑制宿主菌胞壁质生物 合成关键步骤的催化剂 MurA,通过靶向正常细胞胞壁生物合 成途径中的不同阶段的酶 ,而导致新合成的肽聚糖降解 ,逐渐 使宿主细胞溶解 [12] 。 3.2 　通过溶解酶的作用导致宿主菌细胞壁破坏溶解 　除了 丝状噬菌体以外 (丝状噬菌体并不裂解宿主菌 ,而是以分泌的 形式扩增噬菌体病毒颗粒) ,几乎所有的噬菌体都是通过裂解 宿主菌结束其感染周期 [13] 。其中双链 DNA噬菌体是通过溶 壁酶的作用溶解、破坏其宿主菌的细胞壁而裂解细菌的。溶 壁酶可以打开细胞壁上各种分子的共价键使细胞壁水解 ,从 而杀死细菌。大肠杆菌的λ噬菌体是目前研究的最清楚的一 种噬菌体。λ噬菌体参与细胞裂解的基因 ,包括 S、R 和 RZ3 个基因。S基因产物为 Holin蛋白 ,其作用是在细胞膜上形成 “孔洞”,使 R 基因和 RZ基因产生的酶可以穿过细胞膜到达 细胞壁 ,从而使细胞壁水解。其中 R 基因的产物是一种转糖 基酶 ,可以降解细胞壁的肽聚糖。RZ基因的产物可能是一种 肽内切酶 ,它可以切割肽聚糖的寡糖之间的交联。R 和 RZ基 因的表达产物即所称的溶壁酶 [14] 。少数噬菌体的溶壁酶具 有信号肽序列 ,可不依赖 Holin蛋白穿过细胞膜 ,例如酒类酒 球菌噬菌体 fog44[15] 和植物乳酸杆菌噬菌体 gle[16] 。 4 　噬菌体治疗与抗生素的比较 4.1 　噬菌体特异性强 ,只针对相应的致病菌 ,而不会破坏正 常菌群。传统抗生素治疗在杀灭致病菌的同时 ,也破坏了消 化道及泌尿生殖道等部位的正常寄居菌 ,从而导致微生态失 衡 ,引起机会性感染甚至更严重的全身性感染。 4.2 　噬菌体治疗的副作用少。很少有噬菌体治疗引起严重 副反应的报道 ,偶尔可出现轻微的细菌内毒素反应。抗生素 则容易引起消化道反应 ,过敏反应等多种不良反应。 4.3 　噬菌体的指数增殖能力是噬菌体治疗的一个显著优势。 在适当的条件下 ,一个裂解周期内 ,每个噬菌体会产生 200 个 子代噬菌体 ,即噬菌体将以 (200) n 进行增殖 [6] 。用少量的噬 菌体制剂就可以杀灭细菌。而抗生素则无此能力。 4.4 　细菌不易对噬菌体产生抗性。Carlton[8] 指出 ,细菌对抗 生素产生耐性的突变频率是 10 -6 ,而对噬菌体产生抗性的突 变频率为 10 -7 ,联合用药的双突变率降为 10 -13 。而且噬菌体 可产生适当的变异以适应宿主菌的变异 ,传统抗生素则不具 备这种优势。 4.5 　噬菌体是宿主菌依赖性的 ,只在细菌感染部位发生作 用 ,随着宿主菌的清除而死亡 ,不会残留在体内 [17] ,而抗生素 则进入机体新陈代谢 ,最终排出体外 ,易在体内残留。 4.6 　噬菌体的研制开发所需的时间短 ,成本低 ,仅通过离心 就可以去除细菌碎片得到纯化 ,常温下易保存、运输 [17] 。且 从进化的观点来看 ,可以通过自然选择来筛选噬菌体治疗耐 药或耐噬菌体的细菌感染。 5 　噬菌体治疗的局限性 5.1 　噬菌体宿主特异性强 ,治疗的宿主谱很窄。故临床应用 时要求较高 ,需快速诊断出治病菌方能应用相应的噬菌体治疗。 5.2 　噬菌体在体内存留时间短。作为异源性物质 ,噬菌体可 刺激机体免疫系统产生免疫应答 ,产生的抗体可能抑制噬菌 体与相应宿主菌的结合 ,从而抑制其抗菌作用。此外 ,噬菌体 还会被机体防御系统尤其是网状内皮系统所快速清除 [6] 。 5.3 　噬菌体携带某些毒素基因。Takeda等 [18] 在 1978 年就报 道了编码大肠杆菌不耐热肠毒素的基因是由噬菌体介导的。 5.4 　噬菌体治疗的最佳时间和剂量不易掌握。对传统抗生 素治疗而言 ,用药越早越好 ,而噬菌体接种过早却不一定有 效。噬菌体控制细菌感染有两种方式 :被动治疗和主动治疗。 被动治疗就是初次给予大剂量的噬菌体 ,使噬菌体在数量上 远远超过细菌 ,高浓度的噬菌体仅通过初次感染即可一次性 杀灭细菌。主动治疗是利用噬菌体自我复制的特性在感染细 菌后反复增殖、裂解细菌以达到持续治疗的目的。噬菌体治 疗一个显著的现象就是细菌和噬菌体二者的感染与复制都是 密度依赖性的 ,只有在细菌增殖达到一定量后噬菌体才会在 菌体内复制增殖。如使用过早 ,噬菌体在菌体内增殖以前就 会被机体免疫系统所清除 [4,19] 。故最佳时间和剂量问题将是 噬菌体治疗的一大难点。 6 　展 　望 6.1 　新型抗菌药物2溶壁酶的应用前景 　噬菌体在自然界中 的总量约为 1030 ,通过表达溶壁酶使之成为与细菌斗争中的 胜利者。可以说 ,溶壁酶是人类还未去开发的极其有用的资 源。肉毒梭状芽孢杆菌、鼠疫耶氏菌、炭疽杆菌、结核杆菌、伤 寒沙门菌、引起莱姆病的伯氏疏螺旋体等重要的病原体都有 相应的噬菌体 ,可用于开发相应的溶壁酶抗菌药物 [20] 。 6.2 　噬菌体联合应用或与抗生素联合应用 　由于噬菌体的 宿主特异性强 ,无法治疗多重感染 ,不同宿主谱的几种噬菌体 联合应用或与抗生素联合应用 ,理论上应该可以扩大抗菌谱。 但有试验报道 ,同时使用噬菌体和抗生素会使治疗有效率由 95.2% 降至 84.9%, 有研究发现治疗过敏性鼻炎、皮炎或结膜 炎的疗效会由 86.3% 下降至 82.5%, 故联合用药的设想还需 要进一步试验 [6] 。 6.3 　筛选、培育能在体内长期循环的噬菌体 　为延缓机体免 疫系统对噬菌体的清除 ,延长噬菌体在体内存留时间 ,可以通 过连续传代并筛选那些发生变异后能在体内长期循环的噬菌 体 [17] 。美国已研制出“系列病原体培育法”可以分离长期循 环的噬菌体。这些长期循环的噬菌体能高效清除细菌 ,克服 了野生型噬菌体太快被清除 ,以致没有时间到达并杀灭细菌 的缺点 [5] 。 6.4 　通过人工自然选择筛选广谱噬菌体 　将高滴度噬菌体 与其非特异性的宿主菌混合培养 ,筛选出宿主特异性谱发生 突变的具有宽噬性的噬菌体。但宽噬菌体突变株的稳定性以 及噬菌体突变的遗传、变异、基因调控和寄生机制还需要进一 步的研究 [17] 。 6.5 　分子生物学技术对噬菌体的改造 　随着噬菌体展示技 术和噬菌体抗体库技术的逐步成熟 ,噬菌体不断展示出多方 面的优势。用分子生物学技术对已有噬菌体进行改造 ,可扩 大其宿主谱 ,延长其在体内存留时间。改造后可作为基因工 程载体 ,表达特异性抗体 ,生产特异性功能蛋白等 ,这些分子 克隆技术也将和噬菌体治疗结合起来 ,发挥更完善的治疗作 用。此外 ,对基因 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 产品特别是细胞内表达的产物 ,可用基 因工程、发酵和分离相耦合的思路来破细胞壁 ,生产和分离目 标产物 ,这为我们充分利用克隆噬菌体裂解基因来破壁、分离 ·7521·医学综述 2007年 8 月第 13 卷第 16 期　MedicalRecapitulate,August2007,Vol.13,No.16 获取细胞内产物提供了广阔的应用前景 [10] 。 噬菌体作为一种新兴的抗菌疗法 ,愈来愈体现出其优越 性 ,随着分子生物学技术的成熟 ,噬菌体治疗还会展示出更大 的发展空间。 参考文献 : [1] 　Merril CR,SchollD,AdhyaSL.Theprospectforbacteriophagetherapy inWesternmedicine[J].Nature,2003,2 (6) :4892497. [2] 　鲁会军 ,韩文瑜 ,雷连成. 治疗性噬菌体制剂研究进展[J]. 中国 兽药杂志 ,2002,36 (6) :39241. [3] 　黄文林. 分子病毒学[M]. 北京 :人民卫生出版社 ,2002.130. [4] 　Payne RJ,PhilD,JansenVA.Phagetherapy:thepeculiarkineticsof self2replicatingpharmaceuticals[J].ClinPharmacolTher,2000,68 (3) :2252230. [5] 　蒲昭和. 噬菌体2制服病菌的新武器[J]. 首都医药 ,2002,9 (6) : 29. [6] 　吕欣. 噬菌体在细菌性感染治疗中的应用及展望[J]. 国外医学 病毒学分册 ,2001,8 (6) :1902192. [7] 　SulakvelidzeA,AlavidzeA,MorrisJGJr.Bacteriophagetherapy[J]. AntimicrobialAgentsChemotherapy,2001,45(3) :6492659. [8] 　Carlton RM.Phagetherapy:pasthistoryandfutureprospects[J].Arch ImmunolTherExp,1999,47 (5) :2672274. [9] 　AliskyJ,IczkowskiK,RapoportA, et al .Bacteriophagesshowpromise asantimicrobialagents[J].Infect,1998,36 (1) :5215. [10] 　刘明河. 细菌病毒2噬菌体的应用概况[J]. 微生物学杂志 ,2002, 22(4) :56261. [11] 　贾盘兴. 噬菌体分子生物学 :基本知识和技能 [M]. 北京 :北京 科学出版社 ,2001.97299. [12] 　Bernhardt TG,WangIN,StruckDK, et al .Aproteinantibioticinthe phageQβ virion:diversityinlysistargets[J].Science,2001,292 (5525) :232622329. [13] 　徐焰. 噬菌体溶菌机制研究进展 [J]. 重庆医学 ,2003,32 (1) : 1062108. [14] 　Jespers L,SonveauxE,FestrezI, et al .Overexpressionofthephage lambdalysozymeclonedinEscherichiacoli:useofadegenerativemix 2 tureofsyntheticribosomebindingsitesandincreaseoftheproteinsta 2 bilityinvivo[J].ProteinEng,1991,4 (4) :4852492. [15] 　SÃo2JoséC,ParreiraR,VieiraG, et al .TheN 2terminalregionofthe oenococcusoenibacteriophagefog44lysinbehavesasabonafidesignal peptideinEscherichiacoliandasacis 2inhibitoryelement,preventing lyticactivityonoenococcalcells[J].JBacteriol,2000,182 (20) :58232 5831. [16] 　KakikawaM,YokoikI,KimotoH, et al .Molecularanalysisofthelysis proteinLysencodedbyLactobacillusplantrumphagephigle[J].Gene, 2002,299 (122) :2272234. [17] 　陈晓春 ,王继文 ,曹永长 ,等. 噬菌体在疾病治疗方面的应用与 研究[J]. 动物医学进展 ,2005,26 (1) :32235. [18] 　Takeda Y,MurphyJR.Bacteriophageconversionofheat 2labileentero 2 toxininEscherichiacoli[J].JBacteriol,1978,133 (1) :1722177. [19] 　Payne RJ,JansenVA.Understandingbacteriophagetherapyasadensi 2 ty2dependentkineticprocess[J].TheorBiol,2001,208 (1) :37248. [20] 　叶道成. 噬菌体溶壁酶研究进展[J]. 中国生物工程杂志 ,2005, 25(10) :78282. 收稿日期 :2006210222 　修回日期 :2007207214 HBV母婴传播及母婴阻断研究 曾祥娥 (综述) ,廖 　滔 (审校) (柳州市妇幼保健院产科 ,广西 柳州 545001) 中图分类号 :R512.62;R71 　　　　文献标识码 :A 　　　　　文章编号 :100622084(2007) 1621258203 　　摘要 :乙型肝炎病毒感染是一个全世界公共卫生问题 ,30% ～50% 慢性乙型肝炎病毒 携带者由母婴传播造成 ,年龄越小 ,变成慢性乙型肝炎病毒携带者概率越高。因此母婴阻 断是控制我国乙型肝炎流行 ,改善国民素质的关键。本文就乙型肝炎病毒的母婴传播及 母婴阻断进行综述。 关键词 :乙型肝炎病毒 ;母婴传播 ;母婴阻断 ProgressofMother 2infantTransmissionandBlockofHBV 　ZENG Xiang2e , LIAO Tao. ( The Departmentof Obstirics, Maternal and Children Health Hospital of Liuzhou ,Liuzhou 545001 , China) Abstract:HepaticBvirtusisaworldwideproblemofpublichealth.30% ～50%chroniccarriers wereinfectedbymonther 2infantdissemination.Morelittleinfectoryage,morehigherratethatdevelop 2 pingintochroniccarrier;Somother 2infantblockofHBVisthekeyincontrollingHBVprevalenceand improvingnationalquality.Thearticlereviewsprogressesofmother 2infantdissminationandblockof HBV. Keywords :HepaticBvirtus;Mother 2infantdissemination;Mother2infantblock 　　乙型肝炎病毒 (hepaticBvirtus,HBV )感染是一个全世界 公共卫生问题 ,全世界感染 HBV者达 20 亿 ,其中慢性携带者 3.5 亿。我国是乙型肝炎的高发区 ,乙型肝炎表面抗原 (HBsAg)携带者高达 10%～15% [1] ,30%～50%的慢性携带者 由母婴传播造成 [2] ,感染年龄越小 ,变成慢性携带者的概率越 高 [3] 。因此 ,HBV母婴阻断是控制我国乙型肝炎流行 ,改善国 民素质的关键。 1 　母婴传播途径 1.1 　宫内感染 　宫内感染是母婴传播途径之一 ,近年研究示 宫内感染率为 9.1% ～36.7% [4] 。宫内感染以妊娠晚期及产 前为主 ,可能在出生前通过胎盘感染。HBV可感染胎盘组织 中的各类细胞并传染给胎儿。HBV经胎盘宫内感染的机制 可能是孕妇绒毛间隙血中的 HBV感染蜕膜细胞 ,再逐层感染 胎盘细胞 ,直至绒毛细胞血管内皮细胞或 HBV直接感染绒毛滋养细胞至绒毛内皮 细胞而引起胎儿感染 [5] 。影响宫内感染的 因素有 :HBsAg 高滴度、HBeAg( + ) 、HBV2 DNA 含量高 , 宫 内 感 染 的 概 率 越 大。 HBeAg的存在代表 HBV复制活跃 ,其血液 的感染力强 , 因而 更 容 易 受 到 感 染。 HBeAg有可能直接参与 HBV的宫内传播。 HBeAg以游离状态和结合状态 ( IgG) 存在 , 结合状态的 HBeAg可通过胎盘上 IgG受到 体经胎盘进入胎儿循环 [6] 。出生后 1 周内 HBsAg即阳转的考虑宫内感染。新生儿感染后有 90% ～95% 成为慢性乙型肝炎携带者。宫内感染与妊娠期限有关 ,宫内 感染发生接近足月 ,并且越接近足月 ,宫内感染的风险越大。 妊娠早期或中期合并急性乙型肝炎 ,只有 10% 婴儿可成为 HBsAg阳性 ,如在妊娠晚期 ,则有 70%婴儿成为阳性 [7] 。 1.2 　产时感染 　产时感染是母婴传播的主要途径 ,占 40%～ 50% [4] ,胎儿可通过有传染性母亲的血液、羊水及阴道分泌物 或分娩过程中宫收缩使胎盘绒毛血管破裂 ,母血渗入胎儿血 循环 ,只要有 10～8mL母血进入胎儿体内即可使胎儿感染。 在未使用乙型肝炎免疫球蛋白或乙型肝炎疫苗预防母婴传播 之前 ,大多数婴儿慢性携带者由产时感染而起 ,Lin 等 [8] 比较 了不同分娩方式的母亲血液渗透到胎儿的量 ,发现剖宫产时 母血渗透最少。因此提出 HBV感染母亲剖宫产以减少婴儿 ·8521· 医学综述 2007年 8 月第 13 卷第 16 期　MedicalRecapitulate,August2007,Vol.13,No.16