巴斯德毕赤酵母表达系统

文章编号 :100128751 (2002) 0620246205 巴斯德毕赤酵母表达系统 唐元家 　余柏松 　综述 (中国医药集团四川抗菌素工业研究所 , 　成都 610051) 　　摘要 : 　巴斯德毕赤酵母表达系统在 DNA 重组技术中得到越来越广泛的应用。该酵母具有独特的生物学特 性 ,作为真核表达系统 ,具有严格调控外源蛋白的表达 ,加工修饰表达产物 ,表达量高 ,营养要求低等优点 ;在该表 达系统中 ,主要有 3 种表达宿主菌 ,其载体包括整合型载体和自我复制型游离载体 ,其转化和表达比大肠埃希氏菌 系统复杂 ;巴斯德毕赤酵母中表达产物可分泌至胞外 ,从而获得较高表达量和利于表达产物的分离纯化。 关键词 : 　巴斯德毕赤酵母 ; 　外源蛋白 ; 　表达 中图分类号 : 　Q816 　文献标识码 : 　A 　收稿日期 :2001209227 　修订日期 :2002206215 　作者简介 :唐元家 ,男 ,生于 1975 年 ,在读硕士研究生 ,主要从事基因工程药物的研究。 余柏松 ,男 ,生于 1957 年 ,硕士 ,研究员 ,主要从事生物药物的研究及开发。 　　基因工程技术的发展为生物体生产外源蛋白展示 了广阔的前景。到目前为止 ,已发展了多种蛋白质表 达系统 ,比如大肠埃希氏菌表达系统 ,酵母表达系统 , 高等真核细胞表达系统等。长期以来 ,人们用大肠埃 希氏菌作为宿主表达了多种蛋白。这是因为大肠埃希 氏菌具有若干优点 ,如遗传背景和生化特性清楚 ,容易 操作 ,生长迅速 ,营养要求简单等。但这一系统本身也 存在若干缺陷 : (1)缺少真核生物的蛋白翻译后的修饰 和加工 ,如剪切、糖基化、形成二硫键等 ; (2) 表达的蛋 白多形成不溶性包含体 ,需要经过复杂的复性才能恢 复构象和活性 ; (3) 背景蛋白很多 ,纯化麻烦 ; (4) 表达 量一般不是很高。从 1979 年开始 ,为了克服大肠埃希 氏菌表达系统的缺点 ,发展了酵母表达系统。最先使 用的是酿酒酵母 ,它具有繁殖速度快 ,能高密度发酵 , 可以进行蛋白质翻译后的修饰和加工等优点。1981 年 Hitzeman 等用酿酒酵母表达人干扰素获得成功〔1〕。 此后用该系统还表达了其它多种原核和真核蛋白 ,但 酿酒酵母系统也具有局限性 ,如缺乏强有力的启动子 , 分泌效率差 ,表达菌株不够稳定 ,表达质粒易于丢失 等。有鉴于此 ,人们发展了新一代的酵母表达系统 ———巴斯德毕赤酵母 ( Pichia pastoris) 表达系统 ,即甲 醇酵母表达系统。 1 　巴斯德毕赤酵母表达系统的优点 巴斯德毕赤酵母表达系统是近年来发展迅速、应 用广泛的一种真核表达系统 ,有许多其它蛋白表达系 统所不具备的优点。(1) 具有强有力的乙醇氧化酶 (AOX1)基因启动子 ,可严格调控外源蛋白的表达 ; (2) 作为真核表达系统 ,可对表达的蛋白进行加工折叠和 翻译后修饰 ,从而使表达出的蛋白具有生物活性。比 如 ,用原核表达系统表达人组织型基质金属蛋白酶抑 制剂 ( TIMP) ,虽然获得了大量重组蛋白 ,但是由于重 组蛋白形成包含体 ,难以使 TIMP 分子内的 6 对二硫键 正确折叠配对 ,始终未能得到有活性的全长分子。李 克勤等用巴斯德毕赤酵母表达系统获得了分泌型前正 确折叠的 TIMP21 ,重组蛋白的表达量达 40mg/ L〔2〕; (3) 营养要求低 ,生长快 ,培养基廉价 ,与昆虫、哺乳动物等 高等真核细胞相比 ,巴斯德毕赤酵母易于进行操作和 培养。巴斯德毕赤酵母对需氧生长有强的偏好 ,这一 生理学特性使得它既能高密度发酵生长 ,亦有利于工 业放大生产 ; (4)表达量高。酿酒酵母中表皮生长因子 ( EGF)的表达量为 714mg/ L ,而在巴斯德毕赤酵母中的 表达量为 450mg/ L ,表达量提高约 60 倍。许多蛋白在 巴斯德毕赤酵母中的表达量可达到 g/ L 以上水平 ,如 破伤风毒素 C 片段表达量达 12g/ L〔3〕, Heva brasiliensis 羟腈裂合酶的表达水平高达 22g/ L〔4〕; (5) 在巴斯德毕 赤酵母中表达的蛋白既可存在于胞内 ,又可分泌到胞 外。由于巴斯德毕赤酵母自身分泌的蛋白 (背景蛋白) 非常少和培养基中不含其他的蛋白质 ,这样分泌的外 源蛋白占了培养液中总蛋白的绝大部分 ,因此十分有 利于外源蛋白的分离和纯化 ,如表达的重组水蛭素 (HIR) ,仅经过二步层析纯化 ,纯度高达 97 %以上〔5〕, 表达的人重组白细胞介素经过疏水层析、离子交换和 凝胶过滤三步纯度即可达到 99 %〔6〕; (6) 外源基因能 通过质粒整合到巴斯德毕赤酵母基因组上 ,这样得到 ·642· 国外医药抗生素分册 2002 年 11 月第 23 卷第 6 期 的基因工程菌株比较稳定。巴斯德毕赤酵母的遗传操 作技术和酿酒酵母非常相似 ,后者是现代分子生物学 中研究得比较透彻和应用很广的酵母表达体系 ; (7) 糖 基化程度低。和酿酒酵母相比 ,毕赤酵母中加到翻译 蛋白上的糖链长度平均每条侧链为 8～14 个甘露糖残 基 ,较之酿酒酵母每条侧链平均 50～150 甘露糖残基 短得多。此外酿酒酵母核心多糖末端存在α21 ,3 糖苷 链 ,而毕赤酵母没有。一般认为酿酒酵母中糖蛋白的 α21 ,3 糖苷使得这些蛋白具有高度的抗原性 ,因而无治 疗用途。 2 　巴斯德毕赤酵母的生物学 巴斯德毕赤酵母是一种甲基营养型酵母。在缺乏 抑制性碳源 (如葡萄糖、甘油)时 ,能利用甲醇作为惟一 碳源。甲醇代谢的第一步是甲醇在乙醇氧化酶作用下 被氧化成甲醛 ,并产生过氧化氢。为了避免过氧化氢 对细胞的毒性 ,甲醇代谢的第一步在过氧化物酶体中 发生。乙醇氧化酶对氧的亲和力很弱 ,因此巴斯德毕 赤酵母代偿性地大量产生这种酶 ,调控这种酶的启动 子是强启动子 ,用来调控异源蛋白的表达。在巴斯德 毕赤酵母中有两种基因编码乙醇氧化酶 (即 AOX1 和 AOX2) ,细胞中绝大多数乙醇氧化酶的活力是由 AOX1 提供的。在甲醇培养的细胞中 ,该酶可占细胞总蛋白 的 30 %以上。AOX2 与 AOX1 的同源性虽然高达 97 % ,但只承担很少一部分活力。当 aox1 基因缺失只 存在 aox2 时 ,大部分的乙醇氧化酶活力丧失 ,细胞利 用甲醇能力降低 ,细胞在甲醇培养基上生长很慢 ,这种 菌株被称为Muts (Methanol utilization slow) ; aox1 基因存 在时 ,细胞利用甲醇能力正常 ,在甲醇培养基上生长较 快 ,这种菌株表型被称为 Mut + 。 aox1 基因的表达为转录水平调控。aox1 基因的 调控是一个抑制机制加上诱导机制的过程 ,在以葡萄 糖或甘油为碳源的培养基上生长时抑制转录 ,而在以 甲醇为惟一生长碳源时诱导基因转录 ,蛋白质表达。 在一般情况下 ,胞内 AOX酶的变化直接反映了外源蛋 白的表达状况 ,因此通过分析检测胞内 AOX酶的含量 和变化速率 ,就可以确定外源基因所处的状态。顾小 勇等根据细胞氧化甲醇过程中消耗氧的情况 ,通过测 定溶氧的变化 ,建立一种简便、可行的检测方法〔7〕。 甲醇酵母生长适宜温度一般为 28～30 ℃。诱导 期间如果温度超过 32 ℃,不利于蛋白表达 ,甚至会导 致细胞死亡。以甘油或葡萄糖为碳源时 ,Muts 和Mut + 生长速度并无区别 ;而以甲醇为碳源时 ,Mut + 的生长 比 Muts 的生长明显更快。 3 　宿主菌和载体 巴斯德毕赤酵母表达宿主菌于 20 世纪 80 年代初 开发获得 ,大多数应用宿主菌是通过对野生型石油酵 母 Y211430 进行突变改造而来 ,在组氨酸脱氢酶基因 ( his4)处有一突变 ,用于转化后筛选重组菌株 (表 1) 。 表 1 　　　巴斯德毕赤酵母表达宿主菌 菌株 基因型 表型 Y211430 Wile type 野生型 GS115 his4 Mut + His2 KM71 aox1Δ: : sarg4 his4 arg4 Mut + His2 MC10023 aox1Δ: : sarg4 aox2Δ: : phis4 his4 arg4 Mu t + His2 SMD1168 pep4Δhis4 Mut + His2蛋白酶不足 SMD1165 prb1 his4 Mut + His2蛋白酶不足 SMD1163 pep4 prb1 his4 Mut + His2蛋白酶不足 目前主要有 3 种表达宿主菌 ,它们的区别在于 aox1 和/ 或 aox2 基因的缺失而造成对甲醇利用能力 高低的变化。最常用的宿主菌为 GS115 ( his4) ,它含 aox1 和 aox2 基因 ,在含甲醇的培养基上以野生型速 率生长。KM71 ( his4 arg4 aox1 : : arg4) 宿主菌的 aox1 已被酿酒酵母的 arg4 所代替 ,因此 ,此宿主菌只有依 赖 aox2 基因合成 AOX2 ,在甲醇中低速生长。MC10023 ( aox1Δ : : sarg4 aox2Δ: : phis4 his4 arg4) 的 aox1 和 aox2 都被去除 ,不能在含甲醇的培养基上生长〔8 ,9 ,21〕。 上述的宿主菌进一步改造 ,还可得到其它衍生的宿主 菌 ,目前不同基因型已达十几种 SMD1163 ( his4 pep4 prb1) ,SMD1165 ( his4 prb1) 和 SMD1168 ( his4 pep4) 是 最近开发的一类蛋白酶缺失的宿主菌 ,它们为表达外 源蛋白提供了一个减少降解的环境 ,有广泛的应用价 值。 巴斯德毕赤酵母的表达载体包括整合型载体和自 我复制的游离载体 ,现在一般都用整合型载体 (表 2) 。 载体通常含有启动子 ,如 aox1、gap (3′磷酸甘油醛脱氢 酶) 、f ld1 (甲醛脱氢酶) 等基因启动子 ,多克隆位点区 (MHC) , aox1 转录终止子 ( aoxt) ,组氨酸脱氢酶基因 ( his4)以及来自大肠埃希氏菌质粒 pBR322 的氨苄西 林耐药 (Ap r) 和 ColElori 序列。Aox 启动子是强启动 子 ,可严格控制外源蛋白的表达。与 aox 启动子的诱 导表达不同 , gap 启动子具有很强的组成型表达能力。 f ld1 启动子也是强启动子 ,能在以甲醇为惟一碳源或 以甲胺为惟一氮源 (葡萄糖、甘油等为碳源) 条件下表 达〔10〕。表达载体均不含酵母复制原点 ,也就是说导入 酵母体内的重组表达载体只有和酵母染色体上的同源 区发生重组整合到染色体上 ,外源基因才能够稳定存 在。整合位点一般位于 his4 区或 aox1 区 ,对于载体 ·742·国外医药抗生素分册 2002 年 11 月第 23 卷第 6 期 的改进包括建立在体外插入多个目的基因拷贝载体 , 如 pAO815、pPICZ、p GAPZ等载体。由于提高整合的拷 贝数有可能提高外源基因的表达量 ,因此人们又发展 了可以快速筛选高拷贝整合转化子的载体 , 如 pPIC9K。该载体包含来自转座子 Tn903 的卡那霉素耐 药基因 ( Kanr) ,可依靠基因剂量效应 ,对 G418 的抗性 水平快速筛选出高拷贝整合的转化子〔11〕。Invitrogen 公司的 pPICZα、pPICZ、p GAP Z、p GAPZα等载体 ,不仅可 利用高剂量的 Zeocin 来筛选含多拷贝载体的转化菌 株 ,同时这些载体的 c2myc 抗原决定簇可方便地检测 外源蛋白 ,C末端的多聚组氨酸 (6 个 His) 为方便使用 树脂来纯化外源蛋白质提供了条件〔12〕。 表 2 　　　常用的巴斯德毕赤酵母表达载体 载　体 表达方式 选择标记 特　点 pHIL2D2 胞内 his4 在 not1 位点整合产生Mut s 转化子 pAO815 胞内 his4 适合构建形成多个串联的表达框 pPIC3K 胞内 His4 和 kanr 可筛选含多拷贝载体的转化子 pPICZ 胞内 bler 可筛选含多拷贝载体的转化子 pHWO10 胞内 His4 外源蛋白的表达受组成型启动子控制 p GAPZ 胞内 bler 外源蛋白的表达受组成型启动子控制 pHIL2S1 分泌 his4 PHO1 为分泌信号肽 pPIC9K 分泌 his4 和 kanr 可筛选含多拷贝载体的转化子 pPICZα 分泌 bler 可筛选含多拷贝载体的转化子 p GAPZα 分泌 bler 外源蛋白的表达受组成型启动子控制 4 　巴斯德毕赤酵母的转化 和大肠埃希氏菌不同 ,毕赤酵母转化较为复杂。 只有外源基因整合到染色体上才能够稳定存在 ,如果 转化后的重组载体未能整合到染色体上 ,而是以游离 的附加体形式存在 ,那么这种转化子是不稳定的 ,重组 载体极易丢失。对于巴斯德毕赤酵母而言 ,重组可分 为两种情况 ;一是单交换 ,即插入 ,外源基因通过重组 插入到酵母染色体上 , aox1 仍然保留 ,得到的转化子 表型为 Mut + ;另一种情况是双交换 ,即替换 ,外源基因 通过重组替换了染色体上的 aox1 基因 ,这样得到的转 化子表型为 Muts。同源重组有时会产生多拷贝的整 合 ,一般占转化子的 1 %～10 %。这是因为一个拷贝 整合到染色体上以后 ,整合位点依然存在 ,则另外的拷 贝又可整合上去。 转化巴斯德毕赤酵母的常见方法有四种 : 原生质 体转化法、电转化法、聚乙二醇 ( PEG) 法和氯化锂 (LiCl) 法。一般说来 , 原生质球和电转化法效率较 高〔11〕 (约 103 ～104 转化子/μgDNA) 。电转化简单 , 原生质球方法复杂。PEG 方法和 LiCl 方法很简单 , 但这两种方法转化效率较低 , 且不易形成多拷贝〔12〕。 实验中发现原生质球法转化形成的转化子有时能达到 很高的拷贝数 , 但以 Zeocin 为筛选标记的表达载体 时 , 不宜使用原生质球法转化 , 因为 Zeocin 对原生质 体有致死性。 5 　外源蛋白在巴斯德毕赤酵母中的表达 目前巴斯德毕赤酵母表达系统在国内外的应用非 常广泛 ,许多难于用其它系统表达的蛋白在这一系统 中得到成功表达 ,且表达量较为可观。到目前为止 ,已 用这个系统成功的表达了 200 种以上蛋白 ,包括病毒 的、细菌的、真菌的、动植物和人的一些蛋白〔13〕。 5. 1 　巴斯德毕赤酵母表达系统表达外源蛋白的一般 步骤 在巴斯德毕赤酵母中表达蛋白的步骤比大肠埃希 氏菌要复杂得多。一般的步骤为 : (1)目的基因的克隆 　选用合适的内切酶把外源基因克隆于表达载体的多 克隆位点区 ,如果选用的是分泌型表达载体 ,则外源基 因的阅读框架和信号肽的阅读框架应该保持一致。 (2)重组载体线性化 　重组载体只有被线性化 ,整合效 率才能大大提高 ,环状质粒整合效率是很低的。(3) 转 化　一般选用原生质球或电击法。(4) 筛选 　可先利 用载体和营养缺陷型菌株的互补性或对抗生素的抗性 来进行初筛 ,复筛可用多聚链式反应 ( PCR) 。对于大 量转化子的筛选 ,可用原位点杂交法进行〔14〕。用原位 点杂交不仅可以筛选大量转化子 ,还可以鉴定多拷贝。 (5)外源蛋白的表达 　如果表达载体的启动子是组成 型启动子 ,则表达比较简单 ;如果载体的启动子是醇诱 导型启动子 ,则外源蛋白的表达分为 2 步 ,即菌体生长 和蛋白诱导表达。(6) 放大 　表达的条件 (如通气状 况 ,pH值 ,培养基的组成等) ,经优化以后就可以按比 例放大 ,从摇瓶培养转至大规模发酵。 5. 2 　重组蛋白的分泌表达 分泌表达是一种理想的蛋白生产方式。一些在其 它系统不能分泌的蛋白能在巴斯德毕赤酵母中分泌表 达 ,如人肠组织蛋白酶 E(CTSE) 在大肠埃希氏菌中表 达时以包含体形式存在 ,在哺乳细胞中为胞内表达 ,而 在巴斯德毕赤酵母中表达产物可分泌至胞外〔15〕。为 了分泌外源蛋白 ,可在表达载体的启动子后加入一个 编码信号肽的序列。尽管现在许多不同的信号序列成 功地用来分泌表达外源蛋白 ,但不同的信号肽 ,分泌效 率不一样 ,如用 PHO1、酵母 Mα和天然外源基因信号 肽表达小鼠 52HT5A52羟色胺受体 ,发现天然信号肽的 表达量比 PH01 信号肽要高〔16〕,因此要达到外源蛋白 的最高表达 ,应尝试不同的信号肽。 5. 3 　重组蛋白的翻译后修饰加工 ·842· 国外医药抗生素分册 2002 年 11 月第 23 卷第 6 期 巴斯德毕赤酵母含有典型高等真核生物的许多翻 译后修饰功能 ,这些功能包括信号肽的加工、蛋白质折 叠、二硫键的形成和 O2及 N2型糖基化等。比如 ,人基 质金属蛋白酶29 (hMMP29) 有 3 个糖基化位点 ,颜春洪 等用巴斯德毕赤酵母表达系统表达获得了相对分子质 量为 92126ku 的重组 hMMP29 ,相对分子质量略大于天 然 hMMP29 (91127ku) ,这是由于酵母中蛋白的糖基化 方式和哺乳动物不同〔13 ,17〕所致 ,但糖基化方式的不同 并没有明显影响蛋白的活性〔18〕。 5. 4 　影响外源蛋白表达的因素 虽然许多外源蛋白在巴斯德毕赤酵母中可高效表 达 ,达到 g/ L 以上水平 ,但仍有一些蛋白表达量相对较 低。多种因素可以影响外源蛋白表达。 5. 4. 1 　外源基因的内在特性 　主要包括 mRNA 5′端 非翻译区 (5′2UTR) 、基因的 A + T 组成和密码子的使 用频率三个方面。5′2UTR 的核苷酸序列和长度影响 外源基因的表达 ,由于巴斯德毕赤酵母中乙醇氧化酶 的表达量极高 (占胞内可溶蛋白的 30 %以上) ,极少有 外源蛋白能达到这么高的水平 ,因此为了有高的蛋白 表达量 ,维持外源基因 mRNA 5′2UTR 尽可能和 AOX1 mR NA 5′2UTR 相似是必需的 ,最好是保持两者一致。 A + T含量高的基因在巴斯德毕赤酵母中表达时偶尔 会造成转录提前终止 ,这是因为 AT 丰富区可能存在 转录提前终止信号。因此对 AT 含量丰富的基因最好 是重新 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 序列 ,使其 A + T 含量在 30 %～55 %范围 内。用这种方法使破伤风毒素 C 片段得到高效表 达〔3〕。Paul〔19〕等通过对 110 个酵母基因使用密码子的 统计学分析 ,确证了密码子的偏爱性与基因的表达量 密切相关。在酵母中表达量较高的基因往往采用的是 酵母所偏爱的密码子。赵翔等通过分析巴斯德毕赤酵 母的 28 个蛋白编码基因的同义密码子使用情况 ,计算 出该酵母的密码子用法 ,并确定出巴斯德毕赤酵母的 19 个高表达优越密码子〔20〕。 5. 4. 2 　载体和宿主菌 　用巴斯德毕赤酵母表达外源 蛋白时有多种表达载体可供选择。既有胞内表达的 , 又有分泌表达的 ;既有组成性表达的 ,又有诱导性表达 的。分泌表达又有多种表达信号肽可以选择。可以根 据具体情况选择高表达载体。比如 ,外源蛋白的表达 也受宿主菌遗传特性和生长特性等的影响 ,比如说 ,如 果外源蛋白对蛋白酶敏感 ,使用蛋白酶缺陷的受体菌 可减弱蛋白酶的作用 ,此外通过调整培养基的 pH 值 , 在培养基中添加 1 %酪蛋白水解物也可减弱蛋白酶的 水解作用〔21 ,22〕。转化子的表型对外源蛋白的表达也 有影响 ,一般说来 ,蛋白胞内表达时 ,优先考虑用 Muts 表型 ;对于分泌表达 ,Mut + 和 Muts 都可使用。在高生 物量的发酵中 ,Mut + 生长更快 ,较之 Muts 对于提高外 源蛋白的表达量更有效。有时 Muts菌株虽然在诱导阶 段生长缓慢 ,但外源蛋白的表达反而更高 ,更有利于蛋 白的正确折叠 , 如 PepT1 的表达在 Mut s 菌株中较 高〔23〕。也可以在不改变现有表达载体及宿主菌的前 提下 ,通过从 Muts 菌中分离 Mut + 自发突变体来使外 源蛋白的表达量增加〔24〕。 5. 4. 3 　基因拷贝数　一般情况下 ,外源基因整合的拷 贝数愈高 ,蛋白表达量愈大 ,如表达鼠表皮生长因子 (mEGF)〔21〕时多拷贝产生非常高的表达量。并非所有 高拷贝的转化子都能产生高的表达量 ,特别在分泌表 达时 ,这可能是由于高水平表达阻断分泌途径所致。 有时有意增加拷贝数对表达量并没有什么效果〔25〕,辛 利等在用巴斯德毕赤酵母表达人血管抑素时发现 ,拷 贝数超过 1 的菌株表达血管抑素的量要高于单拷贝的 菌株 ,然而拷贝数超过 2 以后 ,重组蛋白的表达量并没 有明显的增长〔26〕。在极少数情况下拷贝数的增加反 而会导致蛋白产量的下降。因此在筛选出高拷贝转化 子、鉴定表达的同时 ,有必要以单拷贝转化子作为对 照 ,比较两者表达量。 5. 4. 4 　培养条件 　主要包括培养基、通气量、pH、甲 醇含量和培养时间等。充足的通气量对于诱导阶段外 源蛋白的表达极其重要 ,充足的氧气是巴斯德毕赤酵 母高效表达所必需的。培养基主要对生物量和诱导表 达有影响。官孝群等在表达血管生成抑制因子 K4K5 时发现 ,在诱导阶段不同的培养基诱导表达外源蛋白 的水平不一样〔27〕。一般说来 ,高的生物量导致总的蛋 白表达量增大。比如 ,在表达 mEGF 时 ,在含酵母膏和 蛋白胨的培养基中单拷贝转化子表达量为 20μg/ L ,但 在不含酵母膏和蛋白胨的基本培养基中表达量为 1μg/L〔25〕。但是生物量越大 ,培养基中的氧和营养供 给就越受限制。培养时间长 ,也会产生比较大的生物 量 ,在表达某些蛋白时发现 ,培养时间过长会发生蛋白 质的过量水解〔28〕。因此一个高的细胞密度不一定有 利于外源蛋白的表达 ,这有赖于所要表达的外源蛋白 的性质 (如溶解度、稳定性、毒性等) 。如果是利用甲醇 诱导外源蛋白表达 ,则在诱导期间每天应往培养基中 补加甲醇 ,以弥补甲醇的消耗和蒸发。一般每天添加 到培养基中的甲醇含量为培养基体积 015 % ,但由于 培养条件和转化子表型不同 ,添加甲醇的量也有所不 同。 6 　巴斯德毕赤酵母表达系统的应用 近年来巴斯德毕赤酵母表达系统在细胞、分子生 ·942·国外医药抗生素分册 2002 年 11 月第 23 卷第 6 期 物学的理论和应用领域的研究越来越广泛。(1) 巴斯 德毕赤酵母表达系统成功地表达了多种外源蛋白 ,表 达产物除了人畜药用制品外 ,还包括来自植物、动物和 细菌的各种酶、膜受体蛋白、含辅基的蛋白质以及可用 于研究晶体结构的蛋白质〔13〕等。巴斯德毕赤酵母表 达系统还可以同时表达酶组分比例适当的一个酶系而 以全细胞作为生物催化剂〔29〕。(2) 巴斯德毕赤酵母作 为一种有用的模型系统用于现代细胞生物学的基础研 究 ,主要用于研究过氧化物酶体输入和组装、过氧化物 酶体选择性自噬降解的分子机制和真核细胞分泌途径 的结构与功能等。 对巴斯德毕赤酵母表达系统的广泛研究 ,促进了 人们对分子生物学领域许多问题的认识。随着研究的 深入 ,巴斯毕赤酵母表达系统也将更完善 ,在将来的理 论和应用领域中会发挥出越来越重要的作用。 参 考 文 献 [1 ] Hitzeman RA , Hagie FE ,Levine HL , et al. 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