5、纳米抗炎药物

1 第 5 章 纳米抗炎药物 5.1 概述 非甾体抗炎药物 (NSAIDs) 是治疗风湿性疾病的常用药物 , 临床上常用于治疗骨关节、 肌肉 和软组织的炎症。据不完全统计 , 全世界大约有一亿多人在服用 NSAIDs,其中有一半以上是 60 岁以上的老年患者。在中国，各种原因引起的急慢性疼痛病人约占门诊就诊患者总人数 的 1/5 ～ 1/4 。可以说 NSAIDs 是全球处方药中最常用的一类 [1] 。1899 年德国拜耳公司通过水 杨酸乙酰化所得阿司匹林成为第一个产品。阿司匹林推向市场 , 标志着现代抗炎治疗时代的 开始。但阿司匹林引起胃肠道的副反应限制了它的使用。 20 世纪 50 年代出现的吡唑啉酮类 药物如保泰松 , 因其具更强的抗炎和止痛作用 , 风靡药坛达 20 余年 , 但因其引起骨髓和其他 系统的毒副反应而被视为需慎用的药物。 20 世纪 60 年代上市的吲哚乙酸类药物吲哚美辛 , 以其强抗炎、 止痛和解热作用以及价格低廉 , 至今仍在广泛使用 , 但由于吲哚美辛对胃肠、 肝 和肾的不良作用以及不适于老年人且有心血管并发症者使用 , 也逐渐被新一代药物取代。 20 世纪 70 年代推出以布洛芬为代 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 的丙酸类药物；以双氯芬酸钠为代表的苯乙酸类药物；以 炎痛喜康为代表的喜康类药物； 以依托劳那酯为代表的邻氨苯甲酸类药物等。 这些品种与阿 司匹林相比 , 均以疗效更好 , 或副反应更少而广泛应用于临床 , 其中布洛芬和双氯芬酸钠更受 青睐。 20 世纪 90 年代上市的同类产品有舒林酸、阿西美辛及萘普酮类等药品 , 另外选择性 环氧化酶 -2 （COX-2）抑制剂 , 如尼美舒利，特异性 COX-2抑制药如罗非昔布 (rofecoxib), 先后在墨西哥、 美国、英国和中国上市， 以其显著的疗效和较低的不良反应而受到重视 [2,3,4] 。 纳米 NSAIDs 具有降低副作用，提高疗效以及药剂学的缓释特征，越来越受研究者的青昧， 目前研究最多的是吲哚美辛和双氯芬酸钠 [5] 。 5.1.1 作用机制 NSAIDs 的共同作用机制是通过抑制环氧化酶 (cyclooxygenase,COX) 而减少前列腺素 (prostaglandin,PG) 的生成。最近研究发现 , COX和其产物在鸡胚成纤维细胞中有阻止细胞 凋亡的作用，而 NSAIDs能导致鸡胚成纤维细胞程序性死亡即凋亡 [6,7] 。如上所述 ,NSAIDs 抑 制 COX,减少 PG生成 , 使炎症部位的充血、渗出、肿胀、疼痛等炎症反应均得以控制。为此 NSAIDs 发挥了它的抗炎作用。但由于机体的某些组织如胃粘膜、肾单元中具有生理功能的 前列腺素亦被 NSAIDS所抑制 , 因此服用后会出现一些不良反应 , 其中以影响胃肠而有上腹不 适、消化不良、 胃粘膜溃疡并伴以出血穿孔最为常见。 现已明确各个 NSAID的疗效基本相似 , 但不良反应却有差异 , 以胃肠不良反应来进行比较则看出吲哚美辛、炎痛昔康、酮布芬的不 良反应大于布洛芬、萘普生、双氯芬酸等。约有 1%的服用 NSAIDs者出现肾的不良反应。有 人认为软骨的正常代谢亦与其内含生理性 PGE有关 [8] 。 现已清楚 ,COX-1 是一种结构同型酶 , 分布广泛 , 存在于 PG合成细胞的内质网中。 COX-1 的功能是合成生理性 PG,以维持胃粘膜完整性 , 调节血小板的聚集和外周血管阻力 , 并调节 肾血流量、肾内血流分布及钠的排泄。研究表明 : 阿斯匹林能不可逆地抑制 COX-1；吲哚美 辛、布洛芬、 吡罗息康与阿斯匹林作用不同 , 它们竞争性地抑制 COX-1的活性， 阻止 PG的合 成 [9] 。COX-2 在静息细胞中很少或不出现， 它是一种由有丝分裂素诱导产生的异构体。 有报 道称在成纤维细胞中存在 COX-2 [10]。慢性炎症时，在白介素 -1、内毒素等的作用下，诱导 人单核细胞、滑膜细胞及软骨细胞合成 COX-2 。表明炎症反应中， PG 产生增多为 COX-2 2 激活所致 [11]。实验证明 , 在整个炎症反应过程中， COX-2 是主要异构体 [12]。细胞因子如 IL-1 、 TNF 和生长因子等使 COX-2 合成增加，局部 PG 合成增多，在急性炎症中，发生血管反应 及组织损伤，而在慢性炎症过程中，则出现血管生成，细胞增殖 [13] 。 对 COX-1 和 COX-2 的作用不同 , 是不同 NSAIDs 药理作用和不良反应不一致的原因之 一；对 COX-1 抑制作用的强弱与不良反应的发生成正比； 对 COX-2 的抑制主要使炎症反应 减轻和症状改善， 取得需要的治疗效果。 Vane认为阿斯匹林抑制 COX-1 的作用强于 COX-2 而不宜用作治疗关节炎等慢性疾病， 但却可用小剂量抑制血栓素以预防心脑血管病变。 对乙 酰氨基酚虽是个良好解热镇痛药， 但对 COX-1 和 COX-2 的抑制作用都很弱， 却能减少脑组 织中的前列腺素，故临床上将该药用于治疗头痛和退热。 目前，普遍将 COX-1 和 COX-2 的 选择性抑制作用以 IC50 即 COX-2/COX-1 的比值来表示，比值越大，表明药物对 COX-1 的 选择性抑制作用越强，其不良反应亦越大。尼美舒利的比值＜ 0.007，其不良反应较小；吲 哚美辛的比值为 60，其不良反应则较大 [14,15] 。 5.1.2 NSAIDs 分类 根据化学结构分为羧酸类、烯酸类及其他三类。 根据对 COX-1 和 COX-2 的作用可将 NSAIDs 分为四类 [16 ，17， 18]。 选择性 COX-1 抑制剂 低剂量阿司匹林选择性抑制血小板 COX-1 的活性，发挥抗血栓 作用。 非选择性环氧酶抑制剂 对 COX-1 和 COX-2 均有抑制作用，包括高剂量阿司匹林、 吲哚美辛、 吡罗昔康、 双氯芬酸、 布洛芬等。 这类药物不仅具有抗炎作用， 而且抑制胃肠道、 肾脏、血小板产生 PGs, 从而导致胃肠道、肾脏不良反应的发生和抑制血小板聚集。大剂量 阿司匹林、 吲哚美辛、吡罗昔康等对 COX-2 的作用与对 COX-1 的作用相似， 故不良反应较 小。 选择性 COX-2 抑制剂 尼美舒利、美洛昔康、 水杨酸等选择性抑制 COX-2 的活性， 对 血小板、胃肠道、肾的 PGs 合成几乎无影响，对阿司匹林诱发哮喘的病人较安全。 高度选择性 COX-2 抑制剂 塞来昔布 (celecoxib) ，罗非昔布 (rofecoxib) 。 5.1.3 不良反应 [19,20] 胃肠道不良反应 NSAIDs 对胃肠黏膜组织的损伤最常见。病变主要位于胃窦、幽门前、胃体部。用药者 中， 50%可见胃黏膜糜烂， 20%～30%可能引发溃疡出血 , 甚至小肠出血 , 结肠出血 , 回肠吸 收功能障碍等 [21]。另有研究表明 NSAIDs 肠肝循环可能在肠损伤中起重要作用 [22] 。 肾脏不良反应 NSAIDs 可能引发轻微水钠潴留、亦可致高血钾、蛋白尿、管型尿、血尿 , 甚至急性间质 性肾炎、可逆性急性肾功能不全、肾乳头坏死等。布洛芬、萘普生可致肾病综合征 , 酮洛芬 可致膜性肾病，吲哚美辛可致肾衰和水肿。 肝损害 肝脏毒性作用较小， 但 15%的患者服用 NSAIDs 后可有血清转氨酶水平升高， 胆红素增 多，凝血活酶时间延长，严重肝功能损害少见，且停药后均可恢复正常。 其他不良反应 [23 ，24] ① 常见中枢神经不良反应有嗜睡、神志恍惚、 精神忧郁等。②减少血小板黏附作用，使 出血时间延长。③少数患者发生过敏反应，如风疹、过敏性鼻炎、哮喘。④阿司匹林、美洛 3 昔康等可引起荨麻疹、瘙痒、剥脱性皮炎等皮肤损害。 5.1.4 NSAIDs 的研究进展 由于 NSAIDs 对胃和肾脏的不良反应不容忽视，人们不断去开发更有效更安全性的 NSAIDs 。从目前的研究趋势看，这类药物药理作用和剂型各有特点。 （1）延长半衰期，方便患者用药 吡罗喜康 (炎痛喜康 )系第一个长效抗风湿药， t1/2 为 45 小时，每日一次服 20 mg 即可。 （2）改变剂型 , 减轻对消化道的副作用 双氯芬酸双释胶囊， 由两种不同释放功能的微粒组成； 一是肠溶包衣微粒， 能在肠道内 崩解，快速释放出双氯芬酸，很快被吸收；另一是缓释型微粒，能长时间释放双氯芬酸。这 两种微粒配合， 使其药物动力学过程得到改善。另外，有扶它林乳膏， 吲哚美辛贴片以及吲 哚美辛控释片、 布洛芬控释微粒。 这些可延缓和定向释放药物， 从而减少药物对胃肠道的刺 激。 （3）研制复方制剂，增强镇痛作用，减少副作用 奥湿克每片含双氯芬酸钠 50mg, 米索前列腺素 20 μg。方中米索前列腺素除具有抑制胃 酸分泌的作用外 , 尚具有细胞保护作用， 适合于预防和治疗口服 NSAIDs 引起的胃和十二指 肠溃疡。达宁含无水萘磺酸右丙氧芬 50 mg, 对乙酰氨基酚 250 mg。鲁南贝特含氯唑沙宗 50 mg，对乙酰氨基酚 250 mg。这两个复方制剂都有协同镇痛效应。 （4）改变化学结构，减少对胃黏膜的刺激 非普拉宗是具有胃黏膜的保护作用的 NSAIDs 。其化学结构中引入了抗溃疡作用的功能 基—戊烯基，既保留了消炎镇痛作用，又减轻了药物对胃黏膜的刺激作用。 （5）选择性地抑制 COX-2 ，降低对胃和肾脏的不良反应 美洛喜康、依托度酸为选择性 COX-2 抑制药，它们对 COX-2/COX-1 的抑制强度比分 别为 3～ 77∶1 及 10∶1，而新型特异性 COX-2 抑制剂主要是 coxib 类两种药 :塞来昔布和罗 非昔布，对 COX-2/COX-1 的比率分别为 375∶ 1 和 800∶1，呈现对 COX-2 选择性更高，两 者在化学结构上有差异， 但在药理机制和药效方面大致相同， 对上消化道安全性与安慰剂类 似。 （6）抑制 5-脂氧化酶，减少白三烯的生成 替尼达普和替美加定对 COX 及 5-脂氧化酶都有抑制作用。抑制 5-脂氧化酶，减少了白 三烯的生成，使消炎镇痛作用更强，而不易诱发哮喘。 （7）研制 NSAIDs 纳米制剂，增强疗效，减少副作用 [25] 采用双氯芬酸柔性纳米脂质体外用治疗类风湿性关节炎， 并以口服双氯芬酸钠双释放肠 溶胶囊 (即戴芬胶囊 )作对照。治疗 1 周后，外用双氯芬酸柔性纳米脂质体和口服戴芬胶囊对 类风湿性关节炎病人的晨僵、关节疼痛、肿胀、压痛、关节功能障碍等均较治前明显改善。 在改善关节疼痛和关节压痛方面， 治疗组明显优于对照组。 且治疗组副作用甚微， 仅 2 例出 现轻度皮疹和瘙痒， 继续用药可耐受， 不良反应发生率仅 8%。而对照组出现胃痛、 胃灼热、 头晕、恶心等不适，其不良反应发生率高达 55% [26]。阿司匹林纳米制剂与等剂量普通阿司 匹林制剂比较，其抗炎作用强度增加两倍 [27]。吲哚美辛纳米囊制剂的毒性明显低于吲哚美 辛普通制剂， 认为系吲哚美辛载入纳米囊的核心， 与细胞的直接作用减少， 有利于减轻毒性 反应 [28]。 5.2 阿司匹林纳米制剂 [27,29] 5.2.1. 纳米载药系统聚乙二醇 600（PEG600 ）与芳香二酯共聚物的合成 4 将 5-羟基间苯二甲酸甲酯与 PEG600 放入圆底烧瓶中，加入适量酶，在 90℃真空条件 下反应 48 小时；经过滤、透析、冷冻干燥得聚合物 3；等量的聚合物 3 与溴烷（醇、酸） 溶于丙酮中，加入碳酸钾进行反应，过滤，真空干燥，得聚合物 7，8，9。见图 5-1。 图 5-1 聚乙二醇 600 与芳香二酯共聚物的合成 5.2.2 纳米囊的制备及其理化特征 共聚物 7 和疏水性药物阿司匹林分别用氯仿溶解后， 按 5﹕1（ W/W ）的比例混合 15 分 钟，在真空下除去有机溶剂，得高粘度药物与聚合物的混合物 , 在不断振摇情况下将该混合 物溶于水中去形成纳米囊。将含药的纳米囊悬浮液用 0.2 μm 的过滤器过滤，除去阿司匹林 结晶和非溶解性药物结晶。滤液进行冷冻干燥并测定其包封率为 80%以上。采用紫外法测 定纳米囊中阿司匹林含量为 20%。采用静电光散射技术测定其大小，阿司匹林纳米囊的直 径为 19.5±1.5。图 5-2 显示阿司匹林、空纳米囊和阿司匹林纳米囊的吸收光谱。阿司匹林 纳米囊在 285 nm 处有最大吸收， 另在 310 nm 处同样有最大吸收 （该吸收来源于空纳米囊） 。 图 5-2 阿司匹林、空纳米囊和阿司匹林纳米囊的紫外吸收光谱 5.2.3 药理作用 动物实验表明： 阿司匹林纳米囊制剂与等剂量普通阿司匹林制剂以及空纳米囊均具有抗 炎作用。以小鼠耳肿胀程度为指标， 与模型组相比 ,其对耳肿胀强度的降低率分别为 62%,32% 和 18%。见图 5-3。该纳米载药系统增加阿司匹林药理作用 1.8-2 倍。 5 图5-3 阿司匹林 PEG纳米囊抗炎作用 a. 模型组 b. 空纳米囊 c. 阿司匹林纳米囊 d. 普通阿司匹林 5.3 吲哚美辛纳米制剂 5.3.1 吲哚美辛（ IMC ）纳米囊（Ⅰ）—载药系统为 Pluronic / 聚己内酯（ PCL ）共聚物 [28] 1. 纳米载药系统 Pluronic / 聚己内酯（ PCL ）共聚物的合成 [30] Pluronic为聚环氧乙烯（ PEO） -聚氧丙烯（ PPO） -聚环氧乙烯（ PEO）的共聚物。称取 一定量的 PEO-PPO-PEO共聚物及 ε-己内酯单体，置于带抽真空装置的 100 mL圆底烧瓶中， 在混合前预热， 以便在熔融状态下更好混合。 混合后，冷却烧瓶， 往烧瓶中加适量的催化剂 辛酸锡。烧瓶抽真空，密封，放入 140℃真空烘箱中。 12小时 后，反应物冷却至室温并溶解 在二氯甲烷中。 该溶液用超大剂量的甲醇萃取， 除去未反应的 PEO-PPO-PEO共聚物、 ε-己内 酯单体和催化剂。沉淀物过滤并用二乙醚冲洗数次后，在 40℃真空烤箱中烤 3天。其反应过 程如图 5-4。共聚物的组成采凝胶渗透层析（ GPC）和 1 H NMR 测定，结果见表 5-3。 表5-3 Pluronic /PCL 二嵌段共聚物相对分子质量和质量比 样品 质量比 相对分子质量 多分散性 PCL/Pluronic/PCL Calc. Mn Mw Mw/Mn CF127 0.5:1:0.5 25200 20800 22227 1.62 CF87 0.5:1:0.5 15400 12786 14004 1.44 CF87-1 1.35:1:1.35 25200 25596 27700 1.32 CF88 0.5:1:0.5 22800 17844 19412 1.46 CF68 0.5:1:0.5 16800 13259 13763 1.63 CF68-1 0.86:1:0.86 22800 28808 24438 1.32 Calcs. 利用重量比计算； M n. 利用 1 H NMR测定； M w. Mw/Mn. 利用 GPC分析； Pluronic (PEO-PPO-PEO 共聚物 ): F-127, Mn=12 600, PEO 重量比为 70%; F-87, M n=7700, PEO重量 比为 70%; F-88, Mn= 11 400, PEO 重量比为 80%; F-68, Mn= 8400, PEO 重量比为 80%。 6 图5-4 Pluronic /PCL 二嵌段共聚物合成线路图 2. 纳米囊的制备 [31-35] 聚醚 /聚己内酯（ PCL）共聚物 100 mg 溶于有机溶剂二甲基甲酰胺 10 mL 中，接着加入 吲哚美辛 100 mg 在室温下搅拌，形成两性分子共聚物纳米囊后，除去有机溶剂。利用纤维 素膜袋为透析膜，加 3L 水为透析液进行 24 小时透析，每隔 3-6 小时更换一次水。透析后， 收集透析袋中的纳米囊溶液， 超声，1000 rpm 离心 3 分钟 除去聚集的粒子和吲哚美辛单体。 纳米囊溶液冷冻干燥，即得。 3. 粒径及分布 纳米囊的粒径及分布采用动态光散射（ DLS ）分光光度计在 633nm 处测定。利用累积方 法分析 DLS 数据，从中得到粒子的粒径。图 5-5 显示出共聚物纳米囊在载药前和载药后在 20℃时的粒径分布情况。其数据结果见表 5-4。 图 5-5 Pluronic /PCL 二嵌段共聚物纳米囊 (CF87-1) 粒径分布 a. 未载药纳米囊 b. IMC 载药纳米囊 7 表5-4 Pluronic /PCL 二嵌段共聚物纳米囊载药量和粒径 样品 未载药纳米囊 载药纳米囊 载药量 (%) 直径 (nm) S.D. ( n=5) 直径 (nm) S. D. (n=5) 均值 S.D. ( n=3) CF127 160.8 6.48 183.4 9.67 14.18 5.00 CF87 132.6 2.70 174.4 11.28 17.15 1.47 CF87-1 133.5 5.16 179.9 3.30 18.64 4.85 CF88 140.4 11.67 152.8 6.16 16.27 2.95 CF68 116.4 3.21 142.9 11.12 13.82 2.13 CF68-1 192.0 9.17 195.0 6.80 14.41 3.04 4. 药物载药量（ DLE ） 吲哚美辛纳米囊的载药量采用紫外分光光度法在 319nm处测量。 DLE 的计算采用纳米囊 中吲哚美辛的重量除以载有吲哚美辛纳米囊总重量。其结果见表 5-4。 5. 体外释放 精密称取适量的吲哚美辛纳米囊悬浮于 0.1 mol·L -1的磷酸盐缓冲液 （PBS，pH 7.4）5 mL 中。纳米囊溶液被放进透析膜袋中并置于 PBS 250 mL 释放介质中不断搅拌。为观察药物从 纳米囊中释放曲线对温度的敏感性，释放介质的温度每 6小时从 15℃升到 45℃，直到 24小时 后，这种升温变化每 24小时变化一次。在预先确定的时间点，从释放介质中取 3 ml溶液以紫 外分光光度法测定吲哚美辛的释放浓度， 同时补上相同量的新鲜介质， 以非纳米吲哚美辛为 对照。结果显示，非纳米吲哚美辛在 36小时内显示快速释放，释放量大于 97%；而纳米囊中 的吲哚美辛显示出显著持续释放特点， 100小时内释放量不到 30%。图 5-6为吲哚美辛从 Pluronic /PCL 嵌段共聚物纳米囊中释放曲线。该图显示温度在 15℃至 45℃交替变化情况下 相对释放度。从图中可以看出，吲哚美辛从纳米囊中释放是随着温度的升高而降低。 图 5-6 吲哚美辛从 Pluronic /PCL 共聚物纳米囊中释放特征 药物的释放依赖于许多因素，包括粒子大小，结晶度、表面特性、相对分子质量、聚合 物组成、膨胀率、降解率、药物亲合力以及聚合 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 的水合作用等等。在 Pluronic /PCL 嵌 段共聚物纳米囊释药系统中，可以考虑的因素包括药物与共聚物的亲合力、共聚物的降解。 因为共聚物 （聚己内酯） 降解十分缓慢， 不大可能影响药物释放行为， 因此认为吲哚美辛亲 合力的作用在纳米囊体外释放中起着非常重要的作用。 因为纳米囊显示温度的敏感性， 在高 8 温状态下，它的粒径下降，此外， PPO嵌段的溶解性和亲水性随着温度的上升而显著下降， 结果导致 PPO组成的外壳结构与聚己内酯内核的相互作用以及在中等疏水性特性的吲哚美 辛和聚合链之间的亲合力增加。因此，就出现了在高温下吲哚美辛从纳米囊中的释放下降。 而当温度下降时，吲哚美辛从纳米囊中的释放将增加 [36,37] 。 6. 毒性 Pluronic /PCL 嵌段共聚物的生物毒性利用正常人纤维原细胞进行研究。 以非纳米化的吲 哚美辛为对照组，采用 MTT 法评价孵化后细胞成活率。图 5-7显示吲哚美辛载药量为 17.15% 的CF87样品的毒性实验结果，依图可见，在相同浓度下非纳米化吲哚美辛的毒性明显高于 Pluronic /PCL 嵌段聚合物纳米化吲哚美辛。 随着浓度增加， 这种趋势更明显。 在0.064 μg/mL 浓度时， 吲哚美辛纳米囊显示 80%以上的细胞生存率， 而非纳米化的吲哚美辛细胞生存率不 足50%。其生存率随着浓度的升高而下降。 吲哚美辛纳米囊的毒性降低可用吲哚美辛与细胞的相互作用和吲哚美辛从聚合物纳米 囊中释放特来性解释。 药物被载入聚合物纳米囊的核心， 导致吲哚美辛与细胞的直接作用减 少；亲水性的外壳能减少纳米囊之间以及纳米囊与细胞间的相互作用； 吲哚美辛从聚合物纳 米中持续释放的特性，有利于维持细胞的生存。 图5-7 正常人纤维原细胞孵化三天后 IMC 载药 Pluronic /PCL 嵌段共聚物纳米囊细胞毒性 生存率 (%)=(Nt /Nc )× 100, Nt为纳米 IMC和非纳米化 IMC处理后活细胞数量， Nc 为未处理 组活细胞数量。 5.3.2 吲哚美辛纳米囊（Ⅱ）—载药系统为甲氧基聚乙二醇 MePEG/ 聚丙交酯 [38] 1. 纳米囊的制备 取MePEG/聚丙交酯二嵌段共聚物 100 mg溶于二甲基甲酰胺 10 mL中，继而加入不同重 量比的共聚物（ 1︰0.25—1︰1）并在窒温下不断搅拌。利用纤维素透析膜，溶液用 3L的超 纯水透析 24小时，形成纳米囊样的吲哚美辛载药胶束。纳米囊溶液进行超声、离心，清除非 包裹的吲哚美辛和聚集粒子。上清纳米囊溶液进行冷冻干燥，即得。 2. 理化特征 MePEG/聚丙交酯纳米囊的组成和相对分子质量采用 GPC和 1HNMR 测定，结果见表 5-5。 如表 5-5所示， 摩尔质量的聚丙交酯与 MePEG 的变化量程为 35-100，MePEG/聚丙交酯二嵌段 9 具有不同的亲水性和亲脂性片段组成。通过透析法制备 MePEG/聚丙交酯纳米囊，其粒径及 粒径分布采用 DLS 法进行测量 ,平均粒径小于 200 nm, 其分散性呈单峰模型，分布范围窄 ,且 其粒径大小随着嵌段相对分子质量的大小逐渐增加而升高。 表5-6显示出纳米囊的大小随着载药量的增加而增加，当共聚物载体与药物的比例从 1.0/0.25到1.0/1.0时，样本（ ML50 ，采用 GPC测量 Mn 为10.8×103）的粒径大小分别为 135 ±0.015 nm ，139±0.044 nm，143±0.070 nm 和154±0.013 nm。然而，载药纳米囊的粒径 并没有超过 200 nm，粒径大小分布并未因载药量的变化而受影响。 表5-6显示纳米制剂中吲哚美辛的量随着药物对 MePEG/聚丙交酯共聚物的进料量的比 率增高而增加，当进料量的比率达到 1﹕1时，纳米囊 DLE 达33.01%。然而，当进料量药物 / 共聚物的比例超过 1﹕1时，载药纳米囊将大量聚集， 这可能归因于吲哚美辛的疏水性。 因此， 药物与共聚物的最佳比例为 1﹕1。 表5-5 MePEG/ 聚丙交酯二嵌段共聚物相对分子质量和组成 MePEG/聚丙交酯 MePEG/聚丙交酯 多分 粒径大小 样品 进料 摩尔 质量百分组成 Mn (× 10 3) 散性 (nm) e 摩尔比 a 组成 b GPC c NMRd Calc a GPCc NMR d (M w/Mn) 均值 SD MePEG 0 0 100.0:0.0 100.0:0.0 5 5.5 5.3 1.13 — — ML35 35 21.2 64.5:35.5 64.1:35.9 9.3 8.6 8.3 1.13 91 0.073 ML50 50 36.4 51.4:48.6 52.3:47.7 11.2 10.8 10.2 1.15 128 0.037 ML70 70 45.6 45.8:54.2 40.9:59.1 15.1 12.1 13 1.18 138 0.044 ML100 100 67.5 36.3:63.7 34.8:65.2 19.4 15.3 15.3 1.11 141 0.112 a 采用 Fluka 方法依据 MePEG中Mw(5000) 测定； b 依据在 GPC实验中共聚物与 MePEG均聚物总 Mn的差异进行评价； c 采用 GPC分析； d 依据 1H NMR光谱测定 (CDCl3) ；e 依据动态光散射测 定 表5-6 IMC 载药 MePEG/ 聚丙交酯纳米囊粒径大小和载药量 样品 a 近料量比 DLE （%） b 粒径 大小 c （共聚物 /IMC ） 均值 SD ML50a 1.00:0.25 7.89 135 0.015 ML50b 1.00:0.50 19.61 139 0.044 ML50c 1.00:0.75 27.13 143 0.07 ML50d 1.00:1.00 33.01 154 0.013 a 载药纳米粒采用 ML35和ML50嵌段共聚物制备； b DLE为纳米囊中吲哚美辛量 / 载药纳米囊 量； c 采用静态光散射测量。 3. 药代动力学分析 [39,40] 在静脉注射两种制剂（普通制剂和载药纳米囊 ML50 ）后平均血浆 IMC 浓度曲线见图 5-9；血浆 IMC 浓度曲线显示包含一个分布相和一个慢速的消除相，其 IMC 的药代动力学参 数见表 5-7 。从图 5-9可看出，当注射给药 10 mg/kg 后， IMC 的血浆浓度立即达到高的浓度， 在1小时时间内， 其血浆浓度维持在 0.58 μg /mL 以上，接着 IMC 的血浆浓度快速下降。载药 ML50 纳米组而言与普通 IMC 组相比较， IMC 的处置呈延迟消除模型。血浆浓度的初值 C0为 时间 -浓度曲线的外推值，普通 IMC 组的 C0值为 0.98 μg /ml 明显高于载药 ML50 纳米组的 0.32 μg / mL；载药 ML50 纳米组平均血浆清除率 CL p为2.92L/h ，明显高于普通 IMC 组的 1.08L/h 。 表明纳米囊组在单位时间内血浆清除含 IMC 血浆量增加。 由于载药 ML50 纳米囊具有持续释 10 药特点，其在体内药时曲线下面积 AUC （2.03 μg·h/mL ）远远低于普通 IMC 药物组的 AUC （8.95 μg·h/mL ）；纳米组的 MRT （h ）和 Vdss的值明显高于普通药物组，分别是普通药物 组（对照组） 的 2.73和9.10倍。纳米组的消除半衰期为 54.64小时，明显长于普通药物组的 11.17 小时。载药 ML50 纳米囊的 Cmax低和 MRT 延长，可见， MePEG/聚丙交酯嵌段共聚物纳米 囊载药系统对于 IMC 持续释药和体内延迟消除的作用具有重要意义。 图5-8 吲哚美辛（ IMC ）与载药纳米囊（ ML50 ）静脉注射后平均血浆 IMC 浓度曲线 表5-7 普通 IMC 和 IMC 载药纳米囊在大鼠体内药代动力学参数（均数 ±SD ，n=10) 参数 普通 IMC （对照组） a P 值 b IMC 载药纳米囊（ ML50 ） c 初始血浆浓度（ C0，μg / mL） 0.98 ± 0.11 <0.05 0.32 ± 0.04 曲线下面积（ AUC ，μg·h/mL ） 8.95 ± 3.06 <0.01 2.03 ± 1.02 平均滞留时间（ MRT ，h ) 19.44 ± 5.54 <0.01 53.10 ± 25.95 稳态分布容积（ Vdss, L ） 15.46 ± 6.97 <0.01 140.74 ± 76.10 半衰期（ t1/2, h） 11.17 ± 4.29 <0.01 54.64 ± 17.68 血浆清除率（ CLp, L/h ） 1.08 ± 0.35 <0.01 2.92 ± 1.39 a 在静脉注射单剂量 10mg/kg IMC 之后； b 非配对 t 检验组间比较 p值；c 指载药量为 33.01% 载药 MePEG/聚丙交酯纳米囊。 4. LD 50和器官毒性 [41,42] 为了评价 MePEG/聚丙交酯二嵌段共聚物纳米囊的生物相容性， 对MePEG/聚丙交酯二嵌 段共聚物进行小鼠急性毒性研究。小鼠共分成 6个组，每组动物 10只，单剂量腹腔注射不同 剂量的 MePEG/聚丙交酯纳米囊（ ML50 ，20-60mg/25g ）后，评价其 LD 50；观察用药 48小时 内的不良反应。利用 Litchfield-Wilcoxon 方法计算 MePEG/聚丙交酯纳米囊的 LD 50为 1.545g/kg。 IMC 在临床上广泛应用的抗炎和解热镇痛药，其临床剂量为每次 25-75mg。如果 考虑到纳米囊的载药量为 33.0%,那么 MePEG/聚丙交酯二嵌段共聚物纳米囊的剂量将比 LD 50 所用的量更低。 按LD 50的半剂量水平每天一次腹腔注射给小鼠， 一周后， 通过光镜和电镜分 别观察每个器官（心脏、肺脏、肝脏和肾脏）的病理学组织变化。结果表明，纳米囊组与正 常对照组比较，未出现任何病理组织学变化。 11 5.3.3 吲哚美辛纳米囊（Ⅲ）——载药系统为甲氧基聚乙二醇 MePEG/ 聚己内酯 PCL [43] 1. 理化特征 MePEG/PCL 的组成和相对分子质量采用 GPC和 1HNMR 测量，结果见表 5-8。MePEG/PCL 纳米囊的粒径大小均小于 200 nm，粒径分布窄且呈单分散模型。 在载入吲哚美辛成为载药纳 米囊后，其粒径大小稍微增加。然而，其粒径大小分布与载药前基本一致。 MePEG/PCL 载药系统中载药量可采用嵌段共聚物相对分子质量以及共聚物与药物质量 比进行控制。从表 5-9可看出，在 MePEG/PCL 纳米囊中的载药量随着相对分子质量和疏水性 嵌段长度增加而增加。表 5-9亦显示纳米囊中载药量随着药物对 MePEG/PCL 二嵌段共聚物进 料量比增加而增加。最大载药量为 42.03%。 表5-8 MePEG/PCL 二嵌段共聚物相对分子质量和组成 进料 摩尔 重量百分组成 平均相对分子质量 多分 样品 摩尔比 a 组成 (wt%) b (wt%) c 散性 PCL/ MePEG PCL/ MePEG MePEG:PCL MePEG:PCL Calc d Expt ’1. e Expt ’1. c Mw/Mn MePEG 0 0 100:0 100:0 5000 5541 5333 1.128 MEP35 35 21.8 68.9:31.1 66.9:33.1 8995 8037 7971 1.256 MEP50 50 40.1 54.8:45.2 51.7:48.3 10707 10116 10317 1.250 MEP70 70 54.2 47.2:52.8 39.9:60.1 12990 11734 13367 1.102 MEP100 100 81.5 37.3:62.7 37.1:62.9 16414 14839 14401 1.102 MEP150 150 109.9 30.6:69.4 29.3:70.7 22121 18085 18205 1.178 a 在 GPC实验中依据 MePEG中Mn测定； b依据在 GPC实验中共聚物与 MePEG均聚物总 Mn的差异进 行评价； c 依据 1H NMR光谱测定 (CDCl3) ；d 从MePEG计算得出 (MW=5000, Fluka) ；e 采 用 GPC分析测定。 2. 体外毒性研究 [43] 利用正常人纤维原细胞研究 MePEG /PCL嵌段共聚物的生物毒性。以非纳米化的吲哚美 辛为对照组，采用 MTT 法评价孵化后细胞成活率。图 5-9显示吲哚美辛载药量为 41.98%的 MePEG /PCL 纳米囊样品的体外毒性实验结果，在相同的剂量下 ,普通吲哚美辛制剂的细胞毒 性明显高于载药吲哚美辛纳米囊的毒性。 并且这种趋势随着吲哚美辛浓度的增加而加强， 尤 其是在浓度为 0.064 μg/ml 时，吲哚美辛载药 MePEG /PCL 纳米囊显示出较高（ 85%）的细胞生 存率，而普通吲哚美辛细胞生存率低于 50%。 3. LD 50和器官毒性 为了评价 MePEG/PCL 嵌段共聚物纳米囊对雄性 ICR小鼠急性毒性，小鼠共分成 6个组， 每组动物 10只。单剂量腹腔注射不同剂量的 MePEG/PCL 纳米囊（ 0.8-2.4g/kg ）后，评价其 LD 50。并观察用药 48小时内的中毒现象。利用 Litchfield-Wilcoxon 方法计算 MePEG/PCL 纳 米囊的 LD 50为1.47g/kg 。按 LD 50的半剂量每天 1次腹腔注射给小鼠，在第 8天，通过光镜和电 镜分别观察主要器官的病理学组织变化。 结果表明， 纳米囊组与正常对照组比较， 主要器官 如：心脏、肺脏、肝脏和肾脏未出现任何病理组织学变化。 12 表 5-9 MePEG/PCL 二嵌段共聚物纳米囊载药量 编号 样品 MePEG/PCL 药物进料比 载药量 共聚物 药物 : 聚合物 (DLE) (%) a 1 DIP25 MEP70 0.25:1.00 16.33 2 DIP50 MEP70 0.50:1.00 20.99 3 DIP75 MEP70 0.75:1.00 31.96 4 DIP100 MEP70 1.00:1.00 41.98 5 DMEP35 MEP35 1.00:1.00 25.83 6 DMEP50 MEP50 1.00:1.00 34.08 7 DMEP70 MEP70 1.00:1.00 41.98 8 DMEP100 MEP100 1.00:1.00 42.03 a DLE为纳米囊中吲哚美辛的量 / 载药纳米囊的量 图5-9 正常人纤维原细胞孵化三天后 IMC 载药 MePEG/PCL 嵌段共聚物纳米囊细胞毒性 细胞生存率 (%)=(Nt /Nc ) ×100, Nt为纳米 IMC和非纳米化 IMC处理后活细胞数量， Nc为未 处理组活细胞数量 。 5.3.4 吲哚美辛纳米囊（Ⅳ）—载药系统为聚氰基丙烯酸正丁酯 PNBCA [45] 1. 纳米囊的制备 [46,47] 含有吲哚美辛、苯甲酸苄酯和磷酯的乙醇溶液 100 mL，通过注射器，在 600 rpm磁力搅 拌下， 缓缓加入含泊咯沙姆水溶液中，通过 10小时以上的界面聚合作用，纳米囊便形成。胶 体悬液在真空 40℃浓缩至 40 mL，通过一个烧结玻璃杯（ 10-16μm）过滤。制备吲哚美辛纳 米囊的处方组成为吲哚美辛 0.05g, 氰基丙烯酸正丁酯 0.5 mL, 苯甲酸苄酯 2 mL, 磷酯 1.0 g, Pluronic F-68 1.0 g 和水 40 mL。 2. 纳米囊的理化特征 图5-11显示出采用界面聚合作用制备含吲哚美辛 PNBCA 纳米囊的扫描电子显微镜图。 吲哚美辛 PNBCA 纳米囊呈表面光滑的球形。从图中测定 50个纳米囊的大小，其粒径大小在 100-360 nm之间，平均直径为 188±7 nm。在PNBCA 纳米囊中吲哚美辛的百分含量为其总浓 度的 76.6%±1.2%。 13 图5-10 吲哚美辛 PNBCA 纳米囊的扫描电子显微镜照片 3. 体外皮肤渗透作用 [48,49,50] 为了研究吲哚美辛 PNBCA 纳米囊对大鼠皮肤的渗透作用， 0.5%（W/V ）吲哚美辛纳米 囊制剂被分散在 pH7.4 磷酸缓冲液 （Ⅰ）或 25%（ W/W ）PLF-127（Pluronic F-127 ）凝胶（Ⅱ） 中，并且置入供给室中，对照组为 0.5%（W/V ）普通吲哚美辛加入到 25%（W/W ） PLF-127 凝胶（Ⅲ）中。同时在接受室置入等体积 pH7.4 磷酸缓冲液，温度为 37℃。药物通过皮肤的 累积量对时间的曲线见图 5-11。吲哚美辛皮肤渗透参数见表 5-10。结果表明纳米囊制剂 （Ⅰ） 在稳态时渗出量为 3.29 μg/cm2 h，在8小时内的累积量为 13.43 μ g/cm2, 分别是普通制剂（Ⅲ） 的13.8倍和 9.3倍，为 0.24 μg/cm2 h和1.44 μ g/cm2 。然而，当吲哚美辛分散在 25%（W/W ） PLF-127 凝胶（Ⅱ）时，显示出较小的渗出量和累积量，这可能是 PLF-127 凝胶粘滞环境所 致。结果表明， PNBCA 纳米囊有能力在 8小时期间内通过大鼠皮肤。共焦激光显微法同样证 实纳米粒能渗过大鼠皮肤角质层到达表皮。 当接受介质 pH值在 5以下时，吲哚美辛的体外释放非常小；在生理 pH值7.4时，吲哚美 辛呈水溶性。 由于药物在纳米囊内亲脂相和水相之间分配的结果， 这种体外释放是缓慢和不 完全的。 为了阐明在 pH 值7.4时吲哚美辛从 PNBCA 纳米囊中体外释放的影响因素， 采用纤维 素膜代替大鼠皮肤进行研究。纤维素膜的孔径为 5nm ,而纳米囊的平均粒径为 188 nm, 因此 在该研究体系中纳米囊是不能通过纤维素膜， 药物的渗透仅依靠从纳米囊中释放出游离的药 物才能从供给室渗透到接受室。 药物通过人工纤维素膜的累积量对时间的曲线见图 5-12。吲 哚美辛纳米囊 pH7.4 磷酸缓冲液（Ⅰ）和吲哚美辛 25%（W/W ）PLF-127 凝胶（Ⅲ），两种 制剂释药过程均呈线性关系，其渗透过程符合零级动力学。吲哚美辛从 PNBCA 纳米囊中释 放速率（ 7.2±0.7×10-2mg/cm 2 h, n=3）明显高于其从凝胶剂中的释放速率（ 2.6±0.3× 10-2mg/cm 2 h, n=3）。在8小时内仅有最初载药量的 12.4%从PNBCA 纳米囊中释放。 结果表明， 14 供给室吲哚美辛从纳米囊中释放不足以解释用大鼠皮肤作为隔膜时药物在接受室的总量。 因 此，药物通过大鼠皮肤渗透一定是由纳米囊的渗透作用产生的。 图5-11 PNBCA 纳米囊及普通制剂中吲哚美辛渗出大鼠皮肤累积量 表5-10 吲哚美辛从不同制剂中透过大鼠皮肤渗出量和累积量 (均值± S.E.n=4) 制剂 渗出量（ 6-8h) 累积量（ 8h ) μg/cm2 h μg/cm2 h PNBCA 纳米囊在 pH7.4 磷酸缓冲液（Ⅰ） 3.29 ± 0.82 13.43 ± 3.30 PNBCA 纳米囊在 PLF-127 凝胶中（Ⅱ） 0.74 ± 0.19 4.46 ± 0.64 25%（W/W）PLF-127 凝胶（Ⅲ） 0. 24 ± 0.08 1.4 4 ± 0.40 图5-12 PNBCA 纳米囊及普通制剂中吲哚美辛渗过纤维素膜累积量 15 4. 大鼠在体经皮吸收 [51,52] 吲哚美辛在体经皮实验采用大鼠腹部规定的面积内应用完整的吲哚美辛纳米囊和吲哚 美辛的 25%（W/W ）PLF-127 凝胶（Ⅲ），药物浓度为 1%(W/V) 。采用高效液相色谱法测定 吲哚美辛大鼠体内的血药浓度。图 5-13显示的是两种制剂在 6小时内的血浆浓度时间曲线。 表5-11计算出动力学参数。从图中可以看出在 6小时内应用完整的 PNBCA 纳米囊比 25% （W/W ）PLF-127凝胶（Ⅲ）有更高的吲哚美辛药物血浆浓度，其结果与体外释放研究基本 一致。由于有更高的血浆浓度，其纳米囊的 AUC 值是 PLF-127 凝胶（Ⅲ）的 3.3倍。 观察皮肤表面应用纳米囊和 PLF-127 凝胶（Ⅲ）发现，当 PLF-127 凝胶应用在皮肤表面 时，由于水从凝胶中蒸发，它在皮肤表面形成一层光滑薄薄的膜；同时由于药物与 PLF-127 凝胶的疏水域的亲和力，结果导致其血药浓度偏低。而纳米囊制剂则慢慢从皮肤表面消失。 从这些观察结果可以说明， PNBCA 纳米囊能通过表皮、角质层进入血液循环。这可能是由 于超细的粒子大小和他们亲水性和疏水性表面特征所致。 图 5-13 吲哚美辛从 PNBCA 纳米囊和 25% PLF-127 凝胶中大鼠体内经皮吸收药时曲线 表5-11. 吲哚美辛两种制剂大鼠在体经皮吸收生物利用度参数比较 制剂 Tmax Cmax AUC(0-h) （h） ( μg/ml) ( μg/ml) PNBCA 纳米囊 4.17 ± 0.75 2.24 ± 0.56 6.76 ± 1.71 25%（W/W）PLF-127 凝胶 3.00 ± 0.52 2.24 ± 0.56 2.04 ± 0.53 5.4 双氯芬酸纳米制剂 5.4.1 双氯芬酸钠纳米粒 [53] 1. 纳米悬浮液的制备 油相由苯甲酸苄酯 (BnB)3.3 mL, 双氯芬酸钠 0.1g, 山梨聚糖单硬脂酸酯 0.766 g, 聚已内 酯(PCL) 或甲基丙烯酸甲酯 -甲基丙烯酸聚合物 (EUD)1g 和丙酮 267.0 ml 组成； 水相为 533 mL 水中含 0.766 g聚山梨醇酯 80。在适度磁力搅拌下将油相加入水相。 除去丙酮， 在真空下浓缩， 调节悬浮液的体积至 100 mL( 双氯芬酸钠含量为 1mg/mL) ，即得。 2. 理化特性 除了用 EUD 制备纳米球的直径为 84nm外，胶体悬浮液的粒子直径在 200-300nm 范围内， 16 pH值为 4.81-5.63，药物的含量为 1mg/mL ，见表 5-12。 3. 冷冻干燥粉末的制备 [54,55] 每种悬浮液取 2 ml，加入 3%的 Aerosil 200( 一种高分散硅胶 )，样本慢慢冷冻到 -20℃后， 在真空下继续冷冻 24小时 , 冷凝器温度为 -55℃，得到疏松可分散的块状粉末。这些粉末中 药物的回收率分别为 92.6±1.1%（冷冻干燥 PCL纳米球）， 99.3±3.2%（冷冻干燥 PCL-MI 纳米囊）， 97.3±1.1%（冷冻干燥 PCL-BnB 纳米分散体）， 90.2±5.5%（冷冻干燥 EDU 纳米 球）， 101.1±1.9%（冷冻干燥 EDU-MI 纳米囊），和 101.1±1.4%（冷冻干燥 EDU-BnB 纳米 囊）。扫描电镜显示，所有的冷冻干燥粉末形状相似，非球形。图 5-14a显示出原料二氧化 硅的冷冻干燥后表面结构形态；图 5-14b显示出含二氧化硅的 PCL纳米球冷冻干燥后表面结 构形态；图 5-14c显示出含二氧化硅的 PCL-MI 纳米囊冷冻干燥后表面结构形态；图 5-14d 显 示出不含二氧化硅的 PCL纳米球的冷冻干燥后表面结构形态。 从图中可看出， 不加二氧化硅 的冷冻干燥纳米粒的直径为 150-200nm与冷冻干燥前悬浮液纳米粒直径相似。 表5-12 采用 PCL 、EUD 、BnB和MI 制备双氯芬酸钠纳米粒（ NS）、 纳米囊（ NC ）及纳米分散体（ ND ）的粒径、 pH 和药物含量 制剂 粒径（ nm） pH 药物含量（ mg/mL) NS-PCL 195 ± 59 4.81 ± 0.71 0.90 ± 0.05 NC-MI-PCL 327 ± 97 5.00 ± 0.18 0.97 ± 0.04 ND-BnB-PCL 276 ± 82 5.63 ± 0.24 1.02 ± 0.02 NS-EUD 84 ± 36 5.19 ± 0.21 0.95 ± 0.03 NC-MI-EUD 225 ± 76 5.03 ± 0.04 1.02 ± 0.0 1 NC-BnB-EUD 202 ± 80 5.22 ± 0.07 1.11 ± 0.14 图5-14 双氯芬酸钠纳米粒扫描电镜照片 (宽度 = 1.39 mm) (a) 冷冻干燥原料二氧化硅 ; (b) 含二氧化硅冷冻干燥 PCL纳米球 ; (c) 含二氧化硅冷冻干燥 PCL-MI纳米囊 ; (d) 不含二氧化硅冷冻干燥 PCL纳米球。 4. 胃肠道耐受性 17 采用雄性 Wistar 大鼠（ 200-300g）研究纳米制剂胃肠道耐受性，大鼠共分 8组，分别为 双氯芬酸钠盐溶液（ S），冷冻干燥游离双氯芬酸（ FD-D ），冷冻干燥双氯芬酸载药 PCL 纳 米球（ FD-NS-PCL ），冷冻干燥双氯芬酸载药 EDU 纳米球（ FD-NS-EDU ），冷冻干燥双氯 芬酸载药 PCL-MI 纳米囊（ FD-NC-MI-PCL ），冷冻干燥双氯芬酸载药 PCL-BnB 纳米分散体 （FD-ND-BnB-PCL ），冷冻干燥双氯芬酸载药 EDU-MI 纳米囊（ FD-NC-MI-EDU ）和冷冻干 燥双氯芬酸载药 EDU- BnB 纳米囊（ FD-NC- BnB -EDU ）。大鼠每天给药 1次，每次 20mg/kg, 连续 3天。药物均溶于或分散于水中，含双氯芬酸钠 2mg/ml, 灌胃给药。 72小时后，观察胃、 十二指肠及空回肠的损伤情况。 其损伤情况采用放大镜观察器官粘膜受损大小进行评分， 即 损伤指数 [56]。 对于胃和十二指肠而言，所有的制剂均显示低损伤指数，且无显著性差异。但给予双氯 芬酸钠盐溶液组大鼠的十二指肠显得更薄更脆。 对于空回肠而言， 双氯芬酸钠盐溶液组的损 伤指数明显高于冷冻干燥游离双氯芬酸组、 冷冻干燥双氯芬酸载药纳米球、 冷冻干燥双氯芬 酸载药 MI 纳米囊。采用 BnB 制备的制剂，损伤指数与双氯芬酸钠盐溶液组相似。从图 5-15 中可看出， 除采用 BnB 制备制剂外， 所有冷冻干燥的粉末的总损伤指数均明显低于双氯芬酸 钠盐溶液组。冷冻干燥游离双氯芬酸的保护作用表明二氧化硅对药物肠道耐受性的改善作 用。冷冻干燥双氯芬酸载药 PCL纳米球以及冷冻干燥双氯芬酸载药 PCL-MI 纳米囊的损伤指 数与冷冻干燥游离双氯芬酸组没有什么差别， 而含有 BnB 的制剂则有较高的损伤指数。 这可 能是由于共聚物的分解， 使BnB 直接作用于肠壁， 而在体内 BnB 能分解成苯甲酸和苄型乙醇， 可能导致对肠壁的损伤。 图5-15 灌胃给双氯芬酸钠制剂后各器官平均受损指数 双氯芬酸钠盐溶液组 (S), 冷冻干燥 (FD-D) ，冷冻干燥载药 PCL纳米球 (FD-NS-PCL), 冷冻干 燥载药 EDU纳米球 (FD-NS-EUD), 冷冻干燥载药 PCL-MI纳米囊 (FD-NC-MI-PCL), 冷冻干燥载 药PCL-BnB纳米分散体 (FD-ND-BnB-PCL), 冷冻干燥载药 EDU-MI纳米囊 (FD-NC-MI-EUD) ， 冷 冻干燥载药 EDU- BnB纳米囊 (FD-NC-BnB-EUD) 。 5.4.2 双氯芬酸钠柔性纳米脂质体（Ⅰ） [57] 柔性纳米脂质体是一种新型经皮肤给药载体， 某些表面活性剂加入类脂材料制成具有高 度自身形变、 可高效地穿过比其自身小数倍的皮肤孔道的类脂聚集体， 可使一些难以透皮的 大分子药物成功地进入皮肤甚至进入体循环。因此有望成为经皮给药的有效载体。 1. 脂质体混悬液的制备 定量称取大豆磷脂和胆酸钠共 lOO mg，溶于无水乙醇 25 ml 中，于 37℃恒温水浴中旋转 18 蒸发除去乙醇， 使磷脂等成膜材料在烧瓶壁形成类脂薄膜。 然后加入含双氯芬酸钠 O．9％NaCl 溶液：无水乙醇 (13 ：1) 的复合水合介质 l m L，涡旋振荡 15分钟后，在冰水浴中超声适当时 间，得到柔性脂质体混悬液。 按上述方法制备不含胆酸钠的普通脂质体混悬液。 在室温下分 别将脂质体混悬液过 0．80、0．45、0．22 μm的微孔滤膜得到纳米脂质体。 2. 理化性质表征 曾 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 制备五个处方的混悬液，编号为处方 I 、II 、IIl 、IV及V， 其胆酸钠加入量是逐 步增加。 处方 I 至V的澄明度变化见表 5-13 。说明随着胆酸钠含量增加， 脂质体的刚性越来越 小，脂质体更易破碎重构，粒径也越小。 当胆酸钠达到一定量时， 体系已成为胶束溶液 ( 处 方V) 。用激光散射仪在 514．5nm处测定以适当比例稀释的柔性脂质体的平均粒径和粒度分布。 用处方 IV 进行了脂质体粒度分布测定。该处方的粒径分布从 65.48nm到121.08nm，平均粒径 为89.04nm，粒径分布较为均匀。这可能由于胆酸钠的加入，使得脂质体具有较大的变形性 而易于破裂 。将样品与 3％磷钨酸以 l ：3体积混合， 然后将涂有膜的铜网浸入， 数秒后取出， 用滤纸吸去多余的液体， 晾干， 置透射电镜下观察柔性脂质体的形态。 纳米脂质体是粒径均 匀的球状或近球状物。 透过滤膜的相对透过速率在不同外压 (60、110、160、260、360、460mmHg) 下，考察脂质体混悬液变形透过微孔滤膜的相对透过速率。结果表明， 随着压力的增加，其 透过率增加；在同一压力下，随着胆酸钠含量的增加，透过速率先增大，然后降低。可能由 于胆酸钠含量增到一定值后， 脂质体的结构遭到破坏， 胆酸钠引起脂质体变形性增强可能与 其扰乱磷脂酰顺序，引起顺序参数显著下降等因素有关。 3. 体外透皮实验 将经过处理的大鼠皮肤置于改良的 Franz 扩散池上， 皮肤的角质层朝向接受室。 接受室内 置生理盐水并电磁搅拌。在 24h内不同的时间取样。双氯芬酸钠含量的测定用紫外分光光度 计采用双波长法测定药物浓度， 计算累积透过量 Q21 。双氯芬酸钠饱和溶液用生理盐水配制。 标准曲线为： C(μg／mL)：29.7325 △A一0.1716 (r ：0．9988) 。 双氯芬酸钠在不同处方中的透皮扩散数据见表 5-13 。结果表明， 双氯芬酸钠在混悬液中 的透皮速率比其饱和溶液快， 处方 IV的透皮速率最快， 且其规律性与粘度结果一致。 说明脂 质体的柔性对促进双氯芬酸钠的透皮扩散起着关键的作用。 柔性脂质体有望成为经皮给药的 有效转运载体。 表5-13 不同处方中双氯芬酸钠柔性脂质体的透皮扩散 处方序号 澄明度 粘度 透过速率（ μg/cm2/h ） 增渗倍数 r 累积透过量（ μg/cm 2） I 混浊 0.2132 6.14 1.90 133.6 II 较混浊 0.1673 15.78 4.89 216.1 Ⅲ 稍混浊 0.1390 18.94 5.86 251.0 Ⅳ 较透明 0.1292 26.31 8.15 324.9 V 透明 0.1979 11.95 3.70 188.8 饱和溶液 3.23 51.57 r 为各处方的透皮速率与饱和溶液透皮速率之比。 5.4.3 双氯芬酸钠柔性纳米脂质体（Ⅱ） [26] 1. 双氯芬酸柔性纳米脂质体配制与用法 以双氯芬酸、卵磷脂、胆固醇及鞘磷脂等药物基质为组方，用超声波分散法制备而成。 每次适量 (每个关节用药 0.5 ～1.0 g) ，直接涂擦患处，反复按摩 1～2 分钟，每天 3次。对照 组给予口服双氯芬酸钠双释放肠溶胶囊，每次 75mg，每天 1次。两组均以 4周为 1个疗程，治 疗期间停用其他治疗方法及药物，并每周观察其症状体征及疗效。 2. 临床疗效 19 采用双氯芬酸柔性纳米脂质体 （治疗组）外用与双氯芬酸钠双释放肠溶胶囊 ( 对照组 ) 口 服治疗类风湿关节炎（ RA）。结果表明，治疗 1周后，外用双氯芬酸柔性纳米脂质体和口服 胶囊对 RA病人的晨僵、关节疼痛、肿胀、 压痛、 关节功能障碍等均较治疗前有明显的改善作 用，在改善关节疼痛和关节压痛方面， 治疗组明显优于对照组 (P<0.01) ，提示双氯芬酸柔性 纳米脂质体是治疗类风湿关节炎疼痛的较好药物。两组临床疗效比较，治疗组总有效率为 83％；对照组总有效率为 80％。详见表 5-14 。 表5-14 双氯芬酸柔性纳米脂质体治疗 RA的 疗效比较 [ 例数 ( ％ )] 组别 例数 显效 有效 进步 无效 总有效率 (%) 治疗组 24 10(42) 10(42) 3(12) 1(4) 83* 对照组 20 9(45) 7(35) 3(15) 1(5) 80 注： * 与对照组比较． P>0．05 3. 不良反应 治疗组仅 2例患者治疗过程中出现轻度的皮疹和瘙痒，继续用药可耐受，不良反应发生 率仅 8％。而对照组出现胃痛、胃灼热、头晕、恶心等不适，不良反应发生率为 55％，结果 见表 5-15 。结果表明， 双氯芬酸柔性纳米脂质体能有效减轻 RA患者的疼痛和炎症的症状， 其 疗效明显优于口服双氯芬酸钠胶囊， 且无胃肠道反应， 患者乐于接受， 为较好的治疗 RA的外 用制剂。 表5-15 双氯芬酸纳米脂质体治疗治疗 RA 的不良反应 [ 例数 ( ％ )] 不良反应发生率 组别 例数 胃痛 胃灼热 恶心 皮疹 瘙痒 上腹饱胀 反酸 头晕 总发生率 轻度 中度 重度 治疗组 24 0 0 0 2(8) 2(8) 0 0 0 2(8)* 2 0 0 对照组 20 3(15) 2(10) 4(20) 0 0 1(5) 3(15) 1(5) 11(55) 8(73) 2(18) 1(9) 注： * 与对照组比较， P<0．01 5.5 布洛芬纳米制剂 5. 5.1 布洛芬（ IBU ）Eudragit RS100 （RS）纳米悬浮液 [58] 1. 纳米粒的制备 按不同的搅拌速度和不同药物 /共聚物重量的比例制备纳米粒的数据见表 5-16。在室温 下，药物和共聚物混溶于乙醇 2 ml中，该溶液用一特氟纶管子注射器缓慢（ 0.5mL/min ）注 入含吐温 80 (0.02%, W/V) 和苯甲烷氯铵（ 0.1%，W/V ）的水 50 mL，并保持在冰冷水浴中。 在注射过程中，混合物按表 5-16所示要求进行混合。由表 5-16可知，药物与聚合体的比例分 别为 10%、20%、33%和50%。药物和聚合体在初期乙醇中的总量分别为 100 mg、200 mg、 500 mg，在制备纳米悬浮液期间的搅拌速度为 9500 rmp 到20500 rmp。这些变化可能影响粒 径的大小和药物从纳米粒中的释放。 然而，其载药量始终为初期总量的 90%以上，变化较小。 20 表 5-16 IBU 载药 Eudragit RS100 纳米悬浮液组成变化情况 批号 IBU/RS （W/W ，%） 初期 IBU+RS 量（ mg ) A1 10 100 A2 20 100 A3 33 100 A4 50 100 A5 10 200 A6 20 200 A7 33 200 A8 50 200 A9 10 500 B1 10 100 B2 20 100 B3 33 100 B4 50 100 B5 33 200 C1 10 100 C2 33 200 注：批号为 A、B、C，对应的搅拌速度分别为 20500 rpm, 13500 rpm and 9500 rpm 2. 纳米粒理化特性 [59,60] 表5-17所示，在制备纳米悬浮液之后或在纳米悬浮液储存 24小时之后，以搅拌速度为 20500 rmp( 批号为 A)和搅拌速度为 13500 rmp( 批号为 B) 的纳米悬浮液平均粒径在 35 nm和 125 nm之间。在储存期间，所有的纳米悬浮液均有沉淀形成，通过手摇动就很容易分散。 在 冰箱中放置 24月后， 未发现显著的变化。 在室温下，则粒径明显增加， 可能与制备中微生物 生长繁殖有关（微生物能改变空间分析结果）。在搅拌速度为 9500 rmp （批号分别为 C1和 C2）显示出非常高的平均粒径，在 4个月之后，聚集现象非常严重并不易分散，因此其粒径 大小和 ζ-电势无法测定。药物与共聚物量过高的纳米制剂（ 500 mg,批号为 A9），非常不稳 定，在上述两种条件下储存，粒径大小均显著增长。 对所有的纳米制剂而言均显示出正 ζ-电势，这与普通 RS纳米粒（＋ 35mV ）没有差异 , 而药物的粉末悬浮液则显示出负 ζ-电势（ -12m V ），这种负电荷非常重要，它能促进其在角 膜表面有效聚集。储存 24个月期间电泳行为无显著变化，储存期间稳定的 ζ-电势说明药物未 从纳米粒中明显漏出。 事实上， 溶液中游离药物能改变整个电泳的迁移率。 吐温 80是一种表 面活性剂，但它并不改变电泳率。纳米悬浮液的 pH值总接近于纯水（ 5.5-6.3），与眼内调 节基本一致。将部分纳米悬浮液的介质采用 PBS（pH7.4）代替水，聚集纳米粒的性质没有 变化。 21 表5-17 储存时间和条件对 IBU 载药 RS纳米悬浮液平均粒径和 ζ-电势的影响 平均粒径（ nm）± SD ζ-电势（ mv ）± SD 批号 初值 24 月之后（ 4±2℃）24 月之后（ r.ta .） 初值 24 月之后（ 4±2℃） 24 月之后（ r.ta.） A1 58.5 ±5.6 74.6 ±1.1 102.9 ±4.3 +10.8 ±1.1 +37.0 ±1.4 +53.3 ±1.2 A2 39.6 ±2.3 27.1 ±1.9 130.2 ±20.1 +32.6 ±1.4 +37.2 ±0.7 +52.0 ±0.3 A3 46.0 ±10.1 41.4 ±6.7 26.8 ±7.6 +31.0 ±1.4 +39.0 ±0.8 +51.8 ±1.2 A4 47.5 ±5.8 58.5 ±3.3b 93.2 ±22.1b +17.7 ±6.2 +29.9 ±11.4 —c A5 161±9.9 93.8 ±11.1 — +31.2 ±1.5 +45.3 ±1.4 — A6 65.3 ±4.9 59.3 ±9.0 — +29.6 ±2.8 +22.1 ±0.7 — A7 68.6 ±9.8 95.9 ±7.7 — +26.8 ±2.9 +41.8 ±1.3 — A8 39.1 ±5.6 100.8 ±8.7 — +29.6 ±1.9 +40.7 ±1.5 — A9 100.2 ±12.2 1282±23.2 b 1032±20.1 b +36.4 ±1.2 +44.3 ±1.3 b +46.4 ±2.8 b B1 18.7 ±3.3 65.0 ±10.2 268.8 ±34.3 +29.6 ±0.1 +25.7 ±0.7 +17.561.8b B2 28.4 ±3.3 115±11.1 1059±100.2b +36.8 ±1.3 +30.2 ±0.2 +46.4 ±1.5b B3 66.0 ±32.1 87.4 ±9.9 1862±34.4b +28.8 ±1.0 +29.1 ±5.5 — B4 102.6 ±8.9 99.6 ±16.6 — +32.9 ±2.5 +21.1 ±6.5 — B5 110.0 ±8.9 — — +33.5 ±2.1 +34.1 ±0.7b — C1 64.6 ±2.7 — — +21.6 ±1.2 — — C2 55.4 ±17.6 — — +28.6 ±1.2 — — a 室温 20±5℃； b 在6个月后测定值； c 没有测定 3. 体外药物释放 布洛芬（ IBU ）的体外释放研究采用透析法，以 HPLC 系统测定其含量， pH7.4磷酸缓冲 液作为介质。从图 5-16可知，随着 IBU/RS 的重量比增加而药物的释放率下降；对于 A4 制剂， 含IBU/RS 的重量比为 1﹕ 1，显示出最低的药物释放速率。由此表明，药物的浓度越低，药 物的均一性和分散性愈好，药物的溶解性和渗透力增加，这说明药物的溶解性是最重要的。 IBU 在共聚物中的分散导致药物逐渐溶解和释放， 在2-3小时时间内， 75%以上的药物已经释 放，完全释放需 24小时。在初期乙醇溶液中共聚物和药物的总量（ 100 mg或200 mg）并不 影响 IBU 的释放，因为相同药物 /共聚物的比例但有不同的药物总量的各制剂均显示出非常相 似的溶解模型，见图 5-17。通过比较不同搅拌速度置备的制剂，结果发现，不同搅拌速度 （20500和13500rmp，批号分别为 A和B）对释放速度有一定的影响， 在高速搅拌时， 其药物 释放将缓慢一些，见图 5-18。 22 图5-16 IBU 从RS纳米悬浮液中体外释放曲线 搅拌速度为 20500 rpm ，药物与共聚物总量为 100 mg 图5-17 初期药物和共聚物浓度对 IBU 从纳米悬浮液中体外释放影响 23 图5-18 两种搅拌速度纳米制剂对布洛芬从纳米悬浮液中释放率影响 4. 在兔眼内抑制缩瞳作用 家兔分别采用阿托品 (对照组 )，阿托品加 A4，阿托品加布洛芬赖氨酸盐 (IBL ，0.1%， W/V) ，或阿托品加空的 RS100纳米悬浮液治疗 （见图 5-19）。在第一次穿刺术之前 180、120、 90、和 30分钟以及之后 5、 15、75和90分钟给药 (左眼 )。在第一次穿刺术之前 180分钟和 5分 钟及第二次穿刺之前 5分钟测定瞳孔直径。两次穿刺术间隔时间为 2小时。在应用阿托品 85 分钟后， 它们均显示出明显的散瞳效应； 在第一次穿刺术 90分钟之前， 家兔两眼均给予 0.1% 的阿托品治疗， 但右眼仅作为对照用。结果表明， 在第一次穿刺术之后，阿托品产生的散瞳 作用并不能维持 120分钟，事实上，瞳孔大小比在 5分钟时更小，甚至比基础值还小。然而， 如果加用 A4纳米悬浮液，阿托品的散瞳作用将继续维持。加用布洛芬赖氨酸盐同样也获得 相同的结果，但 A4 纳米悬浮液所产生的瞳孔直径更大。图 5-20显示的是家兔应用布洛芬赖 氨酸盐和布洛芬 RS纳米粒之后，采用 HPLC 法测定布洛芬药物浓度。在家兔眼液中 IBU-RS 纳米粒组 IBU 的浓度显著高于 IBL 溶液组。 结果表明 IBU 纳米制剂使 IBU 在眼角膜保留的时间 更长。 其原因可能是给予普通的制剂后， 药物很快从角膜表面漏出， 从而减少药物在眼内实 际量；而纳米粒是逐渐释放 IBU ，使 IBU 能更好渗透到眼前房。 图5-19 IBU 不同制剂抑制穿刺术诱导缩瞳作用，均值 ±S.D.(n±6) 24 图5-20 两次穿刺术后 IBU 在兔眼液中浓度（均值 ±SD，n±5） 5.5.2 布洛芬脂质纳米囊（ LNC ） [61] 1. 纳米囊的制备 [62] 采用热处理油 /水系统相转化方法。布洛芬 20，100，200 mg分别溶于油状甘油三酯 993， 913和813 ml中，超声 15 分钟。油相与聚单硬脂酸已二酯 875 mg，大豆卵磷脂 45 mg，氯化 钠45 mg和蒸溜水 3.012 g 进行制备混合， 在磁力搅拌下加热至 85℃，确定相转化温度通过后， 然后再将温度下降到 55℃，使之完全通过相转化区。这种循环进行两次，加入 2℃的蒸馏水 5ml，即得。 2. 纳米囊的特性 布洛芬纳米囊的粒径为 45-60 nm。从表 5-18中可看出， LNC 纳米囊的平均粒径主要受油 相内布洛芬量的影响。对所有批号而言， LNC 均具有非常低的多分散系数（ 0.03-0.06），并 显示单峰粒径分布， 因而适合作为注射剂的运载系统。 在制备过程中， 布洛芬在外围水相溶 解度低，因而具有非常高的包封率（ 94%-98%）。 表 5-18 空白及 IBU 载药纳米囊粒径、多分散性和包封率 PD (nm) P ZP (mV) EE(%) 空白 LNC 57.0 ± 0.4 0.065 ± 0.008 - 2.77 ± 0.36 – IBU LNC (2 mg · ml - 1) 56.5 ± 0.4 0.054 ± 0.008 0.91 ± 0.21 97.7 ± 1.3 IBU LNC (10 mg ·ml - 1) 52.8 ± 2.1 0.068 ± 0.014 0.46 ± 0.12 94.2 ± 3.6 IBU LNC (20 mg · ml - 1) 47.0 ± 0.3 0.094 ± 0.029 0.97 ± 0.32 96.4 ± 2.5 PD, 平均粒径 ; P, 多分散性 ; ZP, 电势 ; EE 包封率 3. 体外释放动力学 图5-21显示 LNC 在 37℃， pH为 7.4磷酸缓冲系统中释放动力学过程，在此释放模型中， 所有样品显示初期的快速释放以及随后的稳定释放。 药物的释放随着浓度的降低而速度略为 加快。 T1/2分别为： 2 mg· mL - 1 ,0.84 h; 10 mg ·mL - 1,1.78 h; 20 mg · mL- 1,2.29 h。 25 图5-21 在磷酸缓冲液中 IBU 载药纳米囊体外释放曲线 (pH 7.4; 37 ℃ ) 4. 药代动力学 [63,64] 从图 5-22可知， 在口服应用布洛芬溶液剂和布洛芬 LNC 制剂 30分钟后， 血浆浓度均达到 最大值。在 6小时后，两种制剂中 96%的布洛芬被清除。然而，在 LNC 组布洛芬在血浆中浓 度存在延迟效应，即在 1小时和 2小时 LNC 组布洛芬血浆浓度显著高于布洛芬溶液组。 LNC 组的 AUC 值为溶液组的 1. 16倍，布洛芬溶液剂组的半衰期为 79.8分钟， 而 LNC 组的半衰期明 显增加为 94.8分钟。然而在两组之间的平均滞留时间 （MRT ）并无差异。 对于静脉注射而言， 布洛芬 LNC 的血浆水平稍高于布洛芬溶液剂。在 1小时的时间内，溶液剂较 LNC 剂有较高的 血药浓度；而在 1小时之后 LNC 的血浆浓度则高于溶液剂 ,见图 5-23。布洛芬 LNC 组的 AUC 的 值较溶液剂组高出 18%；对MRT 和生物半衰期而言， LNC 则较溶液剂则延长大约 27%。药代 动力学参数见表 5-19。 表5-19 口服或静注 IBU 溶液和 IBU LNC 后药代动力学参数 IBU 口服 IBU LNC 口服 IBU 静注 IBU LNC 静注 AUC ( μ gml- 1 min - 1) 10,329±834 11,971±713* 11,785±1591 13,893±1239* MRT (min) 159.5± 26.6 157.2± 22.8 102.7±6.2 130.7 ± 17.7* t1/2 (min) 79.8±17.9 94.8±13.6 72.8±5.8 94.8 ± 13.0* * P < 0.05 与非纳米囊制剂比较 5. 药理作用 采用辐射热刺激大鼠尾镇痛实验进行布洛芬制剂药理作用比较。 口服给药 30分钟后， 布 洛芬 LNC 的抗疼痛效果低于布洛芬溶液， 但作用仍较未用药组高； 在2小时和 4小时之后， 布 洛芬 LNC 组的止痛效应仍然维持相对增加的水平， 而布洛芬溶液的止痛效应明显下降， 与未 用药组类似，见图 5-24。对静脉注射而言，在给药 30分钟之后，布洛芬 LNC 与布洛芬溶液的 止痛作用相似；在 2和4小时之后，两者的作用均明显下降，但布洛芬 LNC 的下降速度较慢； 在2小时之后仍具有较强的作用，而布洛芬溶液与未用药组相同，见图 5-25。 26 图5-22 口服 IBU 溶液和 IBU LNC 制剂后时间 -浓度曲线（ * P < 0.05 与 IBU 溶液组比较） 图5-23 静注 IBU 溶液和 IBU LNC 制剂后时间 -浓度曲线（ * P < 0.05 与 IBU 溶液组比较） 图 5-24 口服 IBU 溶液和 IBU LNC 制剂后止痛作用（ * P < 0.05 与正常组比较） 27 图5-25 静注 IBU 溶液和 IBU LNC 制剂后止痛作用（ * P < 0.05 与正常组比较） 5.5.3 布洛芬羟乙基纤维素接枝聚丙烯酸 (IBU-HEC-g-PAA) 纳米粒 [65] 1. 接枝共聚物载药 ( 布洛芬 ) 纳米粒的制备 先将质量比为 1：25的布洛芬与接枝共聚物 HEC-g—PAA溶解在 2 g ／dL氢氧化钠溶液中， 配成一定浓度的布洛芬／ HEC-g-PAA混合溶液，过滤后使用。在匀速搅拌下，将一定浓度的 盐酸溶液逐滴滴人已过滤的布洛芬／ HEC-g-PAA混合溶液中，继续搅拌 24小时后，得接枝共 聚物载药布洛芬 (IBU —HEC-g—PAA)纳米颗粒水溶液。 2. 纳米颗粒的表征 一般来说，温度对聚合物纳米颗粒的直径有不同的影响。用激光光散射仪 （LLS）对制备 的HEC-g-PAA纳米颗粒在不同温度下的直径进行表征。从图 5-26 以看出，随着温度的升高， 自组装形成的 HEC-g—PAA纳米颗粒直径减小， 该现象可解释为： 随着体系温度的升高， 颗粒 表面的亲水链段与溶剂水分子之间的氢键作用受到破坏， 亲水性链段逐步变得疏水， 发生收 缩，从而使纳米颗粒粒径减小。结果表明， HEC—g-PAA纳米颗粒有一定的热敏性。 从激光光散射仪对纳米颗粒粒径的表征结果看， 随着聚合物浓度增大， 通过自组装形成 的纳米颗粒粒径也随之增大， 结果见图 5-27 。此现象可解释为自组装形成纳米颗粒过程是一 个动态力学平衡过程， 聚合物浓度增大， 进入单个胶束纳米颗粒的高分子链也增多， 胶束纳 米颗粒聚集数增大，从而使得纳米颗粒粒径增大。 用透射电子显微镜 (TEM)对纳米颗粒的形态进行观察，由自组装得到的纳米颗粒基本呈 花朵状，由疏水链形成致密的内核和亲水链形成疏松的外壳结构。同时由 LLS测得到的纳米 颗粒大小分布可看出，纳米颗粒粒径分布较窄，颗粒大小较均匀。 在制备 30天后， 纳米颗粒 的粒径（ Rh）及分布系数 (PD.I) 基本不变。 Rh与PD.I 分别由刚制备的 167.2 nm 和0．0436到 30天后的 168.5 nm 和0.0462 ，基本没有改变，证实了该纳米颗粒具有很好的稳定性。 28 图5-26 温度对纳米颗粒流体力学直径的影响 图 5-27 聚合物浓度对纳米颗粒流体力学直径的影响 3. 药物释放研究 布洛芬生物半衰期较短 (1.8 ～2.0 h) ，需频繁用药，且布洛芬长期口服可导致胃肠溃疡 及出血， 因此将布洛芬制备成缓释制剂具有重要的实际意义。 考虑药物应主要在人体小肠部 位释放，因此选择在人体体温 (37 ℃ ) 下，模拟肠、胃液的 pH条件进行释放，结果见图 5-28 ， 29。 29 图5-28 IBU 在pH 7.4 的缓冲溶液中的释放曲线 图5-29 IBU 在pH 1.5 的缓冲溶液中的释放曲线 从图 5-28 ，29的释放曲线看，未经缓释制备的布洛芬在不同的 pH缓冲溶液中，经过 1O 至12小时后已释放完毕； 而负载布洛芬的纳米颗粒在相同的条件下进行释放， 经过 48小时后， 累积释放百分率分别达 93.8%和74.4%。另还可见： 布洛芬的体外释放曲线分为速释和平衡缓 释两个阶段。初期速释阶段，布洛芬药物累积释放百分率约为 47 %～6O %，维持时间大约为 6～8小时。在平衡缓释阶段，布洛芬药物释放量约占总量的 28 %～35% ，维持时间约为 38～ 40小时。 总体上看， 布洛芬纳米颗粒的释放快慢与释放介质的酸碱度有密切关系， 在较低 pH 环境中 ( 如pH 1.5) 释放速度较慢，而在弱碱性环境中 ( 如pH 7.4) 释放较快．这种情况可解释 为：以HEC—g—PAA为载体材料制备的载药布洛芬纳米颗粒， 在pH值增大时， HEC— g—PAA 的 接枝链段聚丙烯酸主要以阴离子羧基形式存在，电荷间的排斥作用使载药纳米颗粒结构疏 松，易于溶胀，从而更易释放出药物小分子；反之， pH值减小， HEC—g— PAA 的接枝链段聚 丙烯酸不易发生电离， 纳米颗粒亲水壳层电荷排斥作用减小， 故此条件下载药纳米颗粒结构 趋于紧密，不易于溶胀释放出药物小分子。 5.6 萘普生纳米制剂 [66,67] 5.6.1 萘普生 (naproxen)- 聚乙二醇一聚谷氨酸苄酯共聚物 (PEG-PBLG)的制备 30 谷氨酸在浓硫酸催化下先进行 γ - 苄酯化、 再与三光气作用制备谷氨酸酯羧酸酐， 最后在 α- 甲氧基、 ω - 氨基 - 聚乙二醇 (MeO—PEG-NH2) 引发下聚合生成 PEG-PBLG嵌段共聚物。 PEG-PBLG的亲水嵌段和疏水嵌段大小必须有适当比例， 才能生成热力学稳定的核 - 壳型结构。 若亲水嵌段太大，疏水嵌段太小， PEG-PBLG就会变成水溶性分子， 胶束难以生成； 若疏水嵌 段太大，亲水嵌段太小，则形成芯核直径很大，外壳很薄的结构，体系极不稳定，会导致沉 淀产生。实验表明，当 PEG嵌段的相对分子质量固定为 5×103 时， PEG-PBLG相对分子质量大 到19×103时，胶束开始伴有少量沉淀，随着相对分子质量继续增大，沉淀物就越来越多， 所以制备胶束的 PEG-PBLG的相对分子质量应该在 20×103 以下为宜。 5.6.2 萘普生／ PEG-PBLG载药胶束的制备 称取定重和定配比的 PEG-PBLG与萘普生溶解于 N，N一二甲基甲酰胺 (DMF)中，然后转移 至透析袋内，置蒸馏水中透析，在 2、5、8和12小时分别替换新鲜蒸馏水， 24小时后将透析 袋内胶束溶液离心， 除去未包埋药物，上清液经 0.45 μm滤膜过滤， 4℃ 保存胶束溶液，或冷 冻干燥后得胶束干品 。PEG-PBLG是两亲型嵌段共聚物，而萘普生在水中几乎不溶。透析法 是共聚物和药物分子溶解、 分散和缔合， 水分子和溶剂分子在透析膜两边的相互渗透， 共聚 物分子自发两亲平衡的过程，最后药物被包埋在核内，生成核一壳型结构的载药纳米胶束， 这是载药胶束具有热力学稳定性的原因。 有学者认为药物两亲共聚物胶束是一种自组装系统 (self-assembling system) 。巨噬细胞对纳米球摄取量的减少与其表面 PEG层的厚度有关。 直径 100 nm的纳米球表面 PEG层的厚度为 10nm 时，纳米球在体内就不易被识别。该胶束外层 PEG的厚度已达 20 nm，所以能减少血液中巨噬细胞对纳米球的摄取，延长胶束在血液中的半 衰期，有利于制成长循环纳米胶束。 5.6.3 萘普生胶束的的表征 PEG-PBLG嵌段共聚物的相对分子质量决定胶束能否生成、 粒径大小的重要因素。 该制剂 采用 α一甲氧基、 ω一氨基一聚乙二醇作为聚合反应的引发剂，由于 PEG的相对分子质量选 用5000，所以共聚物相对分子质量的大小取决于 PBLG嵌段的长短， 而PBLG嵌段的长短又受单 体/ 引发剂的物质的量比 (n A／nI )影响。由表 5-20 可以看到，当 nA／nI增大时， PBLG嵌段的聚 合度 DPPBLG随之增大。 nA／nI 比值越大，即引发剂的相对用量越少，生成的活性中心越少，链 增长反应得到 PBLG嵌段较长的共聚物。 PEG-PBLG共聚物载药胶束溶液为无色半透明溶液，用动态光散射 (dynamic light scatter ，DLS)法测得的各种胶束粒径在 35～245 nm范围，分布较窄。共聚物中的疏水嵌段 越长， 其形成胶束的粒径就越大，见表 5-21 。制备溶剂对胶束粒径也有很大影响， 采用相为 7.8 ×103 的共聚物制备胶束，在其它制备条件相同时，由纯 DMF制备的胶束粒径较大 (106nm ) ，而由纯四氢呋喃 (THF) 制备的胶束粒径很小 (78 nm)，但选用 DMF／THF混合比例为 55／ 45时制备的胶束粒径最大 (215 nm)。共聚物／溶剂比越大，制得的胶束粒径就越大。表 5-21 表明，载药胶束 M79的粒径为 35.7 nm，空载胶束 M77的粒径为 33.2 nm，可见，对同一共 聚物和相同制备条件的胶束来说， 载药胶束的粒径比空载胶束的粒径略有增加， 粒度分布范 围也稍为变宽。 PEG-PBLG胶束增溶能力随疏水嵌段的长度增加而增强。因为随着疏水嵌段链长增加，胶 束的内核直径也增加，包埋药物的容量也随之增加。在 pH=1.1的酸性溶液中，以上 3种胶束 对萘普生增溶量分别是萘普生原药在水中溶解度的 23、41和37.5 倍，PEG-PBLG胶束增溶能力 随透析介质的 pH值降低而增强。 由于萘普生分子内含有一个羧基， pH值降低不利于羧基的电 离，引起在酸性水中的溶解度下降， 但却更有利于以未离解分子的形式被 PBLG疏水链所包埋， 形成药含量更大的内核。 31 表5-20 单体 / 引发剂质量比、 PBLG聚合度和共聚物相对分子质量 nA/ nI DPPBLG M r.n 12.5/1 24 10.2 ×103 25/1 31 11.8 ×103 50/1 47 15.2 ×103 75/1 69 20.1 ×103 100/1 78 22.1 ×103 150/1 85 23.6 ×103 nA/ n I ：单体 / 引发剂的质量比； DP：聚合度； Mr.n ：共聚物相对分子质量 表5-21 共聚物／萘普生载药胶束的粒径和载药量 胶束 Mr.n 载药量（ %） 直径（ nm ) M30 9.9 ×103 11 128 M40 9.9 ×103 23.8 126 M77 7.8 ×103 0 33.2 M79 7.8 ×103 13.7 35.7 M89 15.2 ×103 16.6 245 5.6.4 载药胶束的体外释药速率 释药介质 pH值越大，释药速率越大。在酸性条件下，包埋在胶束芯核内的萘普生呈未解 离状态，释放速率较慢； 在碱性条件下， 萘普生的羧基发生电离形成离子态，在水中溶解度 增大，内核表皮的萘普生首先离子化释放，芯核内部的药物也不断离子化向芯核表面迁移， 释放速率要比酸性和中性条件加快。 碱性越强，离子化速度越快， 释放越快。载药胶束粒径 越大， 释药速率越小， M79胶束粒径最小， 释药速率最快； M30胶束粒径中等， 释药速率适中、 M89胶束粒径最大，释药速率最慢。 参考文献 1 刘 红 ,李国珍 ,葛泉丽 . 非甾体抗炎药的作用机制及进展 . 实用医技杂志 , 2003,10(4)： 401~402 2 魏 巍 . 非甾体抗炎药的发展 . 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