hplc培训教程

HPLC培训教程 我国药典收载高效液相色谱法项目和数量比较 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf ： 方法 项目 数量 1985年版 1990年版 1995年版 2000年版 HPLC法 鉴别 9 34 150 检查 12 40 160 含量测定 7 60 117 387 鉴于 HPLC应用在药品分析中越来越多，因此每一个药品分析人员应该掌握并应用 HPLC。 I．概论 一、液相色谱理论发展简况 色谱法的分离原理是：溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相 (stationary phase)发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在 固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。又称为色层法、层析法。 色谱法最早是由俄国植物学家茨维特（Tswett）在 1906 年研究用碳酸钙分离植物色素时发 现的，色谱法(Chromatography)因之得名。后来在此基础上发展出纸色谱法、薄层色谱法、 气相色谱法、液相色谱法。 液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相，称为经典 液相色谱法，此方法柱效低、时间长（常有几个小时）。高效液相色谱法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在经典液相色谱法的基础上，于 60 年代后期引入了气相 色谱理论而迅速发展起来的。它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有 高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱法(High Pressure Liquid Chromatography，HPLC)。又因分析速度快而称为高速液相色谱法(High Speed Liquid Chromatography，HSLP)。也称现代液相色谱。 二、HPLC的特点和优点 HPLC有以下特点： 高压—压力可达 150~300Kg/cm2。色谱柱每米降压为 75 Kg/cm2以上。 高速—流速为 0.1~10.0 ml/min。 高效—可达 5000塔板每米。在一根柱中同时分离成份可达 100种。 高灵敏度—紫外检测器灵敏度可达 0.01ng。同时消耗样品少。 HPLC与经典液相色谱相比有以下优点： 速度快—通常分析一个样品在 15~30 min，有些样品甚至在 5 min内即可完成。 分辨率高—可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果。 灵敏度高—紫外检测器可达 0.01ng，荧光和电化学检测器可达 0.1pg。 柱子可反复使用—用一根色谱柱可分离不同的化合物。 样品量少，容易回收—样品经过色谱柱后不被破坏，可以收集单一组分或做制备。 三、色谱法分类 按两相的物理状态可分为：气相色谱法(GC)和液相色谱法(LC)。气相色谱法适用于分离挥发 性化合物。GC根据固定相不同又可分为气固色谱法(GSC)和气液色谱法(GLC)，其中以 GLC 应用最广。液相色谱法适用于分离低挥发性或非挥发性、热稳定性差的物质。LC同样可分 为液固色谱法(LSC)和液液色谱法(LLC)。此外还有超临界流体色谱法(SFC)，它以超临界流 体（界于气体和液体之间的一种物相）为流动相（常用 CO2），因其扩散系数大，能很快达 到平衡，故分析时间短，特别适用于手性化合物的拆分。 按原理分为吸附色谱法(AC)、分配色谱法(DC)、离子交换色谱法(IEC)、排阻色谱法(EC，又 称分子筛、凝胶过滤(GFC)、凝胶渗透色谱法(GPC）和亲和色谱法。(此外还有电泳。) 按操作形式可分为纸色谱法(PC)、薄层色谱法(TLC)、柱色谱法。 四、色谱分离原理 高效液相色谱法按分离机制的不同分为液固吸附色谱法、液液分配色谱法（正相与反相）、 离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法。 1．液固色谱法 使用固体吸附剂，被分离组分在色谱柱上分离原理是根据固定相对组分吸 附力大小不同而分离。分离过程是一个吸附－解吸附的平衡过程。常用的吸附剂为硅胶或氧 化铝，粒度 5~10μm。适用于分离分子量 200~1000的组分，大多数用于非离子型化合物， 离子型化合物易产生拖尾。常用于分离同分异构体。 2．液液色谱法 使用将特定的液态物质涂于担体表面，或化学键合于担体表面而形成的固 定相，分离原理是根据被分离的组分在流动相和固定相中溶解度不同而分离。分离过程是一 个分配平衡过程。 涂布式固定相应具有良好的惰性；流动相必须预先用固定相饱和，以减少固定相从担体表面 流失；温度的变化和不同批号流动相的区别常引起柱子的变化；另外在流动相中存在的固定 相也使样品的分离和收集复杂化。由于涂布式固定相很难避免固定液流失，现在已很少采用。 现在多采用的是化学键合固定相，如 C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。 液液色谱法按固定相和流动相的极性不同可分为正相色谱法(NPC)和反相色谱法(RPC)。 正相色谱法 采用极性固定相(如聚乙二醇、氨基与腈基键合相)；流动相为相对非极性的疏 水性溶剂(烷烃类如正已烷、环已烷），常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节 组分的保留时间。常用于分离中等极性和极性较强的化合物(如酚类、胺类、羰基类及氨基 酸类等）。 反相色谱法 一般用非极性固定相（如 C18、C8）；流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙 腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。适用于分离非极性和 极性较弱的化合物。RPC 在现代液相色谱中应用最为广泛，据统计，它占整个 HPLC 应用 的 80%左右。 随着柱填料的快速发展，反相色谱法的应用范围逐渐扩大，现已应用于某些无机样品或易解 离样品的分析。为控制样品在分析过程的解离，常用缓冲液控制流动相的 pH值。但需要注 意的是，C18和 C8使用的 pH值通常为 2.5~7.5（2~8），太高的 pH值会使硅胶溶解，太低 的 pH值会使键合的烷基脱落。有报告新商品柱可在 pH 1.5~10范围操作。 正相色谱法与反相色谱法比较表 正相色谱法 反相色谱法 固定相极性 高～中 中～低 流动相极性 低～中 中～高 组分洗脱次序 极性小先洗出 极性大先洗出 从上表可看出，当极性为中等时正相色谱法与反相色谱法没有明显的界线（如氨基键合固定 相）。 3．离子交换色谱法 固定相是离子交换树脂，常用苯乙烯与二乙烯交联形成的聚合物骨架， 在表面未端芳环上接上羧基、磺酸基（称阳离子交换树脂）或季氨基（阴离子交换树脂）。 被分离组分在色谱柱上分离原理是树脂上可电离离子与流动相中具有相同电荷的离子及被 测组分的离子进行可逆交换，根据各离子与离子交换基团具有不同的电荷吸引力而分离。 缓冲液常用作离子交换色谱的流动相。被分离组分在离子交换柱中的保留时间除跟组分离子 与树脂上的离子交换基团作用强弱有关外，它还受流动相的 pH 值和离子强度影响。pH 值 可改变化合物的解离程度，进而影响其与固定相的作用。流动相的盐浓度大，则离子强度高， 不利于样品的解离，导致样品较快流出。 离子交换色谱法主要用于分析有机酸、氨基酸、多肽及核酸。 4．离子对色谱法 又称偶离子色谱法，是液液色谱法的分支。它是根据被测组分离子与离 子对试剂离子形成中性的离子对化合物后，在非极性固定相中溶解度增大，从而使其分离效 果改善。主要用于分析离子强度大的酸碱物质。 分析碱性物质常用的离子对试剂为烷基磺酸盐，如戊烷磺酸钠、辛烷磺酸钠等。另外高氯酸、 三氟乙酸也可与多种碱性样品形成很强的离子对。 分析酸性物质常用四丁基季铵盐，如四丁基溴化铵、四丁基铵磷酸盐。 离子对色谱法常用 ODS柱（即 C18），流动相为甲醇-水或乙腈-水，水中加入 3~10 mmol/L 的离子对试剂，在一定的 pH值范围内进行分离。被测组分保时间与离子对性质、浓度、流 动相组成及其 pH值、离子强度有关。 5．排阻色谱法 固定相是有一定孔径的多孔性填料，流动相是可以溶解样品的溶剂。小分 子量的化合物可以进入孔中，滞留时间长；大分子量的化合物不能进入孔中，直接随流动相 流出。它利用分子筛对分子量大小不同的各组分排阻能力的差异而完成分离。常用于分离高 分子化合物，如组织提取物、多肽、蛋白质、核酸等。 被分离组分在柱中的洗脱原理 II．基本概念和理论 一、基本概念和术语 1．色谱图和峰参数 色谱图(chromatogram)——样品流经色谱柱和检测器，所得到的信号-时间曲线，又称色谱流 出曲线(elution profile)。 基线(base line)——经流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测出一段时间的流出曲 线。一般应平行于时间轴。 噪音(noise)——基线信号的波动。通常因电源接触不良或瞬时过载、检测器不稳定、流动相 含有气泡或色谱柱被污染所致。 漂移(drift)——基线随时间的缓缓变化。主要由于操作条件如电压、温度、流动相及流量的 不稳定所引起，柱内的污染物或固定相不断被洗脱下来也会产生漂移。 色谱峰(peak)——组分流经检测器时响应的连续信号产生的曲线。流出曲线上的突起部分。 正常色谱峰近似于对称形正态分布曲线（高斯 Gauss曲线）。不对称色谱峰有两种：前延峰 (leading peak)和拖尾峰(tailing peak)。前者少见。 拖尾因子(tailing factor，T)——T＝，用以衡量色谱峰的对称性。也称为对称因子(symmetry factor)或不对称因子(asymmetry factor)。《中国药典》规定 T应为 0.95~1.05。T＜0.95为前延 峰，T＞1.05为拖尾峰。 峰底—基线上峰的起点至终点的距离。 峰高(peak height，h)—峰的最高点至峰底的距离。 峰宽（peak width，W)—峰两侧拐点处所作两条切线与基线的两个交点间的距离。W＝4σ 半峰宽（peak width at half-height，Wh/2)—峰高一半处的峰宽。Wh/2＝2.355σ 标准偏差（standard deviation，σ)—正态分布曲线 x＝±1时（拐点）的峰宽之半。正常峰 的拐点在峰高的 0.607倍处。标准偏差的大小说明组分在流出色谱柱过程中的分散程度。σ 小，分散程度小、极点浓度高、峰形瘦、柱效高；反之，σ大，峰形胖、柱效低。 峰面积(peak area，A)—峰与峰底所包围的面积。A＝×σ×h＝2.507σh＝1.064 Wh/2h 2．定性参数（保留值） 死时间(dead time，t0)——不保留组分的保留时间。即流动相（溶剂）通过色谱柱的时间。 在反相 HPLC中可用苯磺酸钠来测定死时间。 死体积(dead volume，V0)——由进样器进样口到检测器流动池未被固定相所占据的空间。它 包括 4部分：进样器至色谱柱管路体积、柱内固定相颗粒间隙（被流动相占据，Vm）、柱出 口管路体积、检测器流动池体积。其中只有 Vm参与色谱平衡过程，其它 3部分只起峰扩展 作用。为防止峰扩展，这 3部分体积应尽量减小。V0＝F×t0（F为流速） 保留时间(retention time，tR)——从进样开始到某个组分在柱后出现浓度极大值的时间。 保留体积(retention volume，VR)——从进样开始到某组分在柱后出现浓度极大值时流出溶剂 的体积。又称洗脱体积。VR＝F×tR 调整保留时间(adjusted retention结构 time，t'R)——扣除死时间后的保留时间。也称折合保 留时间(reduced retention time)。在实验条件（温度、固定相等）一定时，t'R只决定于组分的 性质，因此，t'R（或 tR）可用于定性。t'R＝tR－t0 调整保留体积(adjusted retention volume，V'R)——扣除死体积后的保留体积。V'R＝VR－V0 或 V'R＝F×t'R 3．柱效参数 理论塔板数(theoretical plate number，N)——用于定量表示色谱柱的分离效率（简称柱效）。 N 取决于固定相的种类、性质（粒度、粒径分布等）、填充状况、柱长、流动相的种类和流 速及测定柱效所用物质的性质。如果峰形对称并符合正态分布，N 可近似表示为：N＝()2 ＝16()2＝5.54()2 N为常量时，W随 tR成正比例变化。在一张多组分色谱图上，如果各组分含量相当，则后 洗脱的峰比前面的峰要逐渐加宽，峰高则逐渐降低。 用半峰宽计算理论塔数比用峰宽计算更为方便和常用，因为半峰宽更易准确测定，尤其是对 稍有拖尾的峰。 N 与柱长成正比，柱越长，N 越大。用 N 表示柱效时应注明柱长，如果未注明，则表示柱 长为 1米时的理论塔板数。（一般 HPLC柱的 N在 1000以上。） 若用调整保留时间(t'R)计算理论塔板数，所得值称为有效理论塔板数(N有效或 Neff)。 理论塔板高度(theoretical plate height，H)——每单位柱长的方差。H＝。实际应用时往往用 柱长 L和理论塔板数计算：H＝，H有效＝。 4．相平衡参数 分配系数(distribution coefficient，K)——在一定温度下，化合物在两相间达到分配平衡时， 在固定相与流动相中的浓度之比。K＝。 分配系数与组分、流动相和固定相的热力学性质有关，也与温度、压力有关。在不同的色谱 分离机制中，K 有不同的概念：吸附色谱法为吸附系数，离子交换色谱法为选择性系数(或 称交换系数)，凝胶色谱法为渗透参数。但一般情况可用分配系数来表示。 在条件(流动相、固定相、温度和压力等)一定，样品浓度很低时(Cs、Cm 很小)时，K 只取 决于组分的性质，而与浓度无关。这只是理想状态下的色谱条件，在这种条件下，得到的色 谱峰为正常峰；在许多情况下，随着浓度的增大，K减小，这时色谱峰为拖尾峰；而有时随 着溶质浓度增大，K也增大，这时色谱峰为前延峰。因此，只有尽可能减少进样量，使组分 在柱内浓度降低，K恒定时，才能获得正常峰。 在同一色谱条件下，样品中 K 值大的组分在固定相中滞留时间长，后流出色谱柱；K 值小 的组分则滞留时间短，先流出色谱柱。混合物中各组分的分配系数相差越大，越容易分离， 因此混合物中各组分的分配系数不同是色谱分离的前提。 在 HPLC中，固定相确定后，K主要受流动相的性质影响。实践中主要靠调整流动相的组成 配比及 pH值，以获得组分间的分配系数差异及适宜的保留时间，达到分离的目的。 容量因子(capacity factor，k)——化合物在两相间达到分配平衡时，在固定相与流动相中的 量之比。k＝。因此容量因子也称质量分配系数。 分配系数、容量因子与保留时间之间有如下关系：k＝＝＝K＝，t'R＝k t0。上式说明容量因 子的物理意义：表示一个组分在固定相中停留的时间（t'R）是不保留组分保留时间（t0）的 几倍。k＝0时，化合物全部存在于流动相中，在固定相中不保留，t'R＝0；k越大，说明固 定相对此组分的容量越大，出柱慢，保留时间越长。 容量因子与分配系数的不同点是：K取决于组分、流动相、固定相的性质及温度，而与体积 Vs、Vm无关；k除了与性质及温度有关外，还与 Vs、Vm有关。由于 t'R、t0 较 Vs、Vm 易于测定，所以容量因子比分配系数应用更广泛。 选择性因子(selectivity factor，α)——相邻两组分的分配系数或容量因子之比。α＝＝（设 k2＞k1）。因 k＝t'R/t0，则α＝，所以α又称为相对保留时间（《美国药典》）。 要使两组分得到分离，必须使α≠1。α与化合物在固定相和流动相中的分配性质、柱温有 关，与柱尺寸、流速、填充情况无关。从本质上来说，α的大小表示两组分在两相间的平衡 分配热力学性质的差异，即分子间相互作用力的差异。 5．分离参数 分离度(resolution，R)——相邻两峰的保留时间之差与平均峰宽的比值。也叫分辨率，表示 相邻两峰的分离程度。R＝。当 W1＝W2 时，R＝。当 R＝1 时，称为 4σ分离，两峰基本 分离，裸露峰面积为 95.4%，内侧峰基重叠约 2%。R＝1.5时，称为 6σ分离，裸露峰面积 为 99.7%。R≥1.5称为完全分离。 《中国药典》规定 R应大于 1.5。 基本分离方程——分离度与三个色谱基本参数有如下关系: R＝×× 其中称为柱效项，为柱选择性项，为柱容量项。柱效项与色谱过程动力学特性有关，后两项 与色谱过程热力学因素有关。 从基本分离方程可看出，提高分离度有三种途径：①增加塔板数。方法之一是增加柱长，但 这样会延长保留时间、增加柱压。更好的方法是降低塔板高度，提高柱效。②增加选择性。 当α＝1时，R＝0，无论柱效有多高，组分也不可能分离。一般可以采取以下措施来改变选 择性：a. 改变流动相的组成及 pH 值；b. 改变柱温；c. 改变固定相。③改变容量因子。这 常常是提高分离度的最容易方法，可以通过调节流动相的组成来实现。k2 趋于 0 时，R 也 趋于 0；k2增大，R也增大。但 k2不能太大，否则不但分离时间延长，而且峰形变宽，会 影响分离度和检测灵敏度。一般 k2在 1~10范围内，最好为 2~5，窄径柱可更小些。 二、塔板理论 1．塔板理论的基本假设 塔板理论是Martin和 Synger首先提出的色谱热力学平衡理论。它把色谱柱看作分馏塔，把 组分在色谱柱内的分离过程看成在分馏塔中的分馏过程，即组分在塔板间隔内的分配平衡过 程。塔板理论的基本假设为： 1） 色谱柱内存在许多塔板，组分在塔板间隔（即塔板高度）内完全服从分配定律，并很快 达到分配平衡。 2） 样品加在第 0号塔板上，样品沿色谱柱轴方向的扩散可以忽略。 3） 流动相在色谱柱内间歇式流动，每次进入一个塔板体积。 4） 在所有塔板上分配系数相等，与组分的量无关。 虽然以上假设与实际色谱过程不符，如色谱过程是一个动态过程，很难达到分配平衡；组分 沿色谱柱轴方向的扩散是不可避免的。但是塔板理论导出了色谱流出曲线方程，成功地解释 了流出曲线的形状、浓度极大点的位置，能够评价色谱柱柱效。 2．色谱流出曲线方程及定量参数（峰高 h和峰面积 A） 根据塔板理论，流出曲线可用下述正态分布方程来描述：C＝e或 C＝e 由色谱流出曲线方程可知：当 t＝tR时，浓度 C有极大值，Cmax＝。Cmax就是色谱峰的峰 高。因此上式说明：①当实验条件一定时（即σ一定），峰高 h与组分的量 C0（进样量）成 正比，所以正常峰的峰高可用于定量分析。②当进样量一定时，σ越小（柱效越高），峰高 越高，因此提高柱效能提高 HPLC分析的灵敏度。 由流出曲线方程对 V(0~∞)求积分，即得出色谱峰面积 A＝×σ×Cmax＝C0。可见 A相当 于组分进样量 C0，因此是常用的定量参数。把 Cmax＝h和Wh/2＝2.355σ代入上式，即得 A＝1.064×Wh/2×h，此为正常峰的峰面积计算公式。 三、速率理论（又称随机模型理论） 1．液相色谱速率方程 1956年荷兰学者 Van Deemter等人吸收了塔板理论的概念，并把影响塔板高度的动力学因素 结合起来，提出了色谱过程的动力学理论——速率理论。它把色谱过程看作一个动态非平衡 过程，研究过程中的动力学因素对峰展宽（即柱效）的影响。 后来 Giddings和 Snyder等人在 Van Deemter方程（H＝A＋B/u＋Cu，后称气相色谱速率方 程）的基础上，根据液体与气体的性质差异，提出了液相色谱速率方程（即 Giddings方程）： H＝2λdp＋＋\s\up5(2p＋\s\up5(2p＋\s\up5(2f 2．影响柱效的因素 1）涡流扩散（eddy diffusion）。由于色谱柱内填充剂的几何结构不同，分子在色谱柱中的流 速不同而引起的峰展宽。涡流扩散项 A＝2λdp，dp为填料直径，λ为填充不规则因子，填 充越不均匀λ越大。HPLC常用填料粒度一般为 3~10μm，最好 3~5μm，粒度分布 RSD≤ 5%。但粒度太小难于填充均匀（λ大），且会使柱压过高。大而均匀（球形或近球形）的颗 粒容易填充规则均匀，λ越小。总的说来，应采用细而均匀的载体，这样有助于提高柱效。 毛细管无填料，A＝0。 2）分子扩散（molecular diffusion）。又称纵向扩散。由于进样后溶质分子在柱内存在浓度梯 度，导致轴向扩散而引起的峰展宽。分子扩散项 B/u＝2γDm/u。u 为流动相线速度，分子 在柱内的滞留时间越长（u小），展宽越严重。在低流速时，它对峰形的影响较大。Dm为分 子在流动相中的扩散系数，由于液相的 Dm很小，通常仅为气相的 10-4~10-5，因此在 HPLC 中，只要流速不太低的话，这一项可以忽略不计。γ是考虑到填料的存在使溶质分子不能自 由地轴向扩散，而引入的柱参数，用以对 Dm进行校正。γ一般在 0.6~0.7左右，毛细管柱 的γ＝1。 3）传质阻抗（mass transfer resistance）。由于溶质分子在流动相、静态流动相和固定相中的 传质过程而导致的峰展宽。溶质分子在流动相和固定相中的扩散、分配、转移的过程并不是 瞬间达到平衡，实际传质速度是有限的，这一时间上的滞后使色谱柱总是在非平衡状态下工 作，从而产生峰展宽。液相色谱的传质阻抗项 Cu又分为三项。 ①流动相传质阻抗 Hm＝Cmd2pu/Dm，Cm为常数。这是由于在一个流路中流路中心和边缘 的流速不等所致。靠近填充颗粒的流动相流速较慢，而中心较快，处于中心的分子还未来得 及与固定相达到分配平衡就随流动相前移，因而产生峰展宽。 ②静态流动相传质阻抗 Hsm＝Csmd2pu/Dm，Csm为常数。这是由于溶质分子进入处于固定 相孔穴内的静止流动相中，晚回到流路中而引起峰展宽。Hsm 对峰展宽的影响在整个传质 过程中起着主要作用。固定相的颗粒越小，微孔孔径越大，传质阻力就越小，传质速率越高。 所以改进固定相结构，减小静态流动相传质阻力，是提高液相色谱柱效的关键。 Hm和 Hsm都与固定相的粒径平方 d2p 成正比，与扩散系数 Dm成反比。因此应采用低粒 度固定相和低粘度流动相。高柱温可以增大 Dm，但用有机溶剂作流动相时，易产生气泡， 因此一般采用室温。 ③固定相传质阻抗 Hs＝Csd2fu/Ds（液液分配色谱），Cs为常数，df为固定液的液膜厚度， Ds为分子在固定液中的扩散系数。在分配色谱中 Hs与 df的平方成正比，在吸附色谱中 Hs 与吸附和解吸速度成反比。因此只有在厚涂层固定液、深孔离子交换树脂或解吸速度慢的吸 附色谱中，Hs才有明显影响。采用单分子层的化学键合固定相时 Hs可以忽略。 从速率方程式可以看出，要获得高效能的色谱分析，一般可采用以下措施：①进样时间要短。 ②填料粒度要小。③改善传质过程。过高的吸附作用力可导致严重的峰展宽和拖尾，甚至不 可逆吸附。④适当的流速。以 H 对 u作图，则有一最佳线速度 uopt，在此线速度时，H最 小。一般在液相色谱中，uopt很小（大约 0.03~0.1mm/s），在这样的线速度下分析样品需要 很长时间，一般来说都选在 1mm/s的条件下操作。⑤较小的检测器死体积。 3．柱外效应 速率理论研究的是柱内峰展宽因素，实际在柱外还存在引起峰展宽的因素，即柱外效应（色 谱峰在柱外死空间里的扩展效应）。色谱峰展宽的总方差等于各方差之和，即： σ2＝σ2柱内＋σ2柱外＋σ2其它柱外效应主要由低劣的进样技术、从进样点到检测池之 间除柱子本身以外的所有死体积所引起。为了减少柱外效应，首先应尽可能减少柱外死体积， 如使用“零死体积接头”连接各部件，管道对接宜呈流线形，检测器的内腔体积应尽可能小。 研究表明柱外死体积之和应＜VR/。其次，希望将样品直接进在柱头的中心部位，但是由于 进样阀与柱间有接头，柱外效应总是存在的。此外，要求进样体积≤VR/2。 柱外效应的直观标志是容量因子 k小的组分（如 k＜2）峰形拖尾和峰宽增加得更为明显；k 大的组分影响不显著。由于 HPLC的特殊条件，当柱子本身效率越高（N越大），柱尺寸越 小时，柱外效应越显得突出。而在经典 LC中则影响相对较小。 III．HPLC系统 HPLC系统一般由输液泵、进样器、色谱柱、检测器、数据记录及处理装置等组成。其中输 液泵、色谱柱、检测器是关键部件。有的仪器还有梯度洗脱装置、在线脱气机、自动进样器、 预柱或保护柱、柱温控制器等，现代 HPLC 仪还有微机控制系统，进行自动化仪器控制和 数据处理。制备型 HPLC仪还备有自动馏分收集装置。 最早的液相色谱仪由粗糙的高压泵、低效的柱、固定波长的检测器、绘图仪，绘出的峰是通 过手工测量计算峰面积。后来的高压泵精度很高并可编程进行梯度洗脱，柱填料从单一品种 发展至几百种类型，检测器从单波长至可变波长检测器、可得三维色谱图的二极管阵列检测 器、可确证物质结构的质谱检测器。数据处理不再用绘图仪，逐渐取而代之的是最简单的积 分仪、计算机、工作站及网络处理系统。 目前常见的 HPLC仪生产厂家国外有Waters公司、Agilent公司（原 HP公司）、岛津公司等， 国内有大连依利特公司、上海分析仪器厂、北京分析仪器厂等。 一、输液泵 1．泵的构造和性能 输液泵是 HPLC 系统中最重要的部件之一。泵的性能好坏直接影响到整个系统的质量和分 析结果的可靠性。输液泵应具备如下性能：①流量稳定，其 RSD应＜0.5%，这对定性定量 的准确性至关重要；②流量范围宽，分析型应在 0.1~10 ml/min范围内连续可调，制备型应 能达到 100 ml/min；③输出压力高，一般应能达到 150~300kg/cm2；④液缸容积小；⑤密封 性能好，耐腐蚀。 泵的种类很多，按输液性质可分为恒压泵和恒流泵。恒流泵按结构又可分为螺旋注射泵、柱 塞往复泵和隔膜往复泵。恒压泵受柱阻影响，流量不稳定；螺旋泵缸体太大，这两种泵已被 淘汰。目前应用最多的是柱塞往复泵。 柱塞往复泵的液缸容积小，可至 0.1ml，因此易于清洗和更换流动相，特别适合于再循环和 梯度洗脱；改变电机转速能方便地调节流量，流量不受柱阻影响；泵压可达 400 kg/cm2。其主要缺点是输出的脉冲性较大，现多采用双泵系统来克服。双泵按连接方式可分 为并联式和串联式，一般说来并联泵的流量重现性较好（RSD 为 0.1%左右，串联泵为 0.2~0.3%），但出故障的机会较多（因多一单向阀），价格也较贵。 各品牌输液泵的基本参数： 项目 Waters 515型 HP 1100型 LC-10ATvp型 Elite P200 II型 检定要求 流速范围 0.001~10 0.001~10 0.001~9.999 0.01~4.99 调节精度 0.001 0.001 0.001 0.01 流量精密度 RSD0.1% 0.15%（<0.3%） 0.3% 0.5% 1.5% 流量准确度 ±2.0% ±5.0% ±2.0% 最高压力 4000 Psi 40 MPa 39.2MPa 40.0MPa 密封圈寿命 流动相的脉冲 2．泵的使用和维护注意事项 为了延长泵的使用寿命和维持其输液的稳定性，必须按照下列注意事项进行操作： ①防止任何固体微粒进入泵体，因为尘埃或其它任何杂质微粒都会磨损柱塞、密封环、缸体 和单向阀，因此应预先除去流动相中的任何固体微粒。流动相最好在玻璃容器内蒸馏，而常 用的方法是滤过，可采用 Millipore 滤膜（0.2µm 或 0.45µm）等滤器。泵的入 口都应连接砂滤棒（或片）。输液泵的滤器应经常清洗或更换。 ②流动相不应含有任何腐蚀性物质，含有缓冲液的流动相不应保留在泵内，尤其是在停泵过 夜或更长时间的情况下。如果将含缓冲液的流动相留在泵内，由于蒸发或泄漏，甚至只是由 于溶液的静置，就可能析出盐的微细晶体，这些晶体将和上述固体微粒一样损坏密封环和柱 塞等。因此，必须泵入纯水将泵充分清洗后，再换成适合于色谱柱保存和有利于泵维护的溶 剂（对于反相键合硅胶固定相，可以是甲醇或甲醇-水）。 ③泵工作时要留心防止溶剂瓶内的流动相被用完，否则空泵运转也会磨损柱塞、缸体或密封 环，最终产生漏液。 ④输液泵的工作压力决不要超过规定的最高压力，否则会使高压密封环变形，产生漏液。 ⑤流动相应该先脱气，以免在泵内产生气泡，影响流量的稳定性，如果有大量气泡，泵就无 法正常工作。 如果输液泵产生故障，须查明原因，采取相应措施排除故障： ①没有流动相流出，又无压力指示。原因可能是泵内有大量气体，这时可打开泄压阀，使泵 在较大流量（如 5ml/min）下运转，将气泡排尽，也可用一个 50ml 针筒在泵出口处帮助抽 出气体。另一个可能原因是密封环磨损，需更换。 ②压力和流量不稳。原因可能是气泡，需要排除；或者是单向阀内有异物，可卸下单向阀， 浸入丙酮内超声清洗。有时可能是砂滤棒内有气泡，或被盐的微细晶粒或滋生的微生物部分 堵塞，这时，可卸下砂滤棒浸入流动相内超声除气泡，或将砂滤棒浸入稀酸（如 4mol/L硝 酸）内迅速除去微生物，或将盐溶解，再立即清洗。 ③压力过高的原因是管路被堵塞，需要清除和清洗。压力降低的原因则可能是管路有泄漏。 检查堵塞或泄漏时应逐段进行。 3．梯度洗脱 HPLC有等强度(isocratic)和梯度(gradient)洗脱两种方式。等度洗脱是在同一分析周期内流动 相组成保持恒定，适合于组分数目较少，性质差别不大的样品。梯度洗脱是在一个分析周期 内程序控制流动相的组成，如溶剂的极性、离子强度和 pH值等，用于分析组分数目多、性 质差异较大的复杂样品。采用梯度洗脱可以缩短分析时间，提高分离度，改善峰形，提高检 测灵敏度，但是常常引起基线漂移和降低重现性。 梯度洗脱有两种实现方式：低压梯度（外梯度）和高压梯度（内梯度）。 两种溶剂组成的梯度洗脱可按任意程度混合，即有多种洗脱曲线：线性梯度、凹形梯度、凸 形梯度和阶梯形梯度。线性梯度最常用，尤其适合于在反相柱上进行梯度洗脱。 在进行梯度洗脱时，由于多种溶剂混合，而且组成不断变化，因此带来一些特殊问题，必须 充分重视： ①要注意溶剂的互溶性，不相混溶的溶剂不能用作梯度洗脱的流动相。有些溶剂在一定比例 内混溶，超出范围后就不互溶，使用时更要引起注意。当有机溶剂和缓冲液混合时，还可能 析出盐的晶体，尤其使用磷酸盐时需特别小心。 ②梯度洗脱所用的溶剂纯度要求更高，以保证良好的重现性。进行样品分析前必须进行空白 梯度洗脱，以辨认溶剂杂质峰，因为弱溶剂中的杂质富集在色谱柱头后会被强溶剂洗脱下来。 用于梯度洗脱的溶剂需彻底脱气，以防止混合时产生气泡。 ③混合溶剂的粘度常随组成而变化，因而在梯度洗脱时常出现压力的变化。例如甲醇和水粘 度都较小，当二者以相近比例混合时粘度增大很多，此时的柱压大约是甲醇或水为流动相时 的两倍。因此要注意防止梯度洗脱过程中压力超过输液泵或色谱柱能承受的最大压力。 ④每次梯度洗脱之后必须对色谱柱进行再生处理，使其恢复到初始状态。需让 10~30倍柱容 积的初始流动相流经色谱柱，使固定相与初始流动相达到完全平衡。 二、进样器 早期使用隔膜和停流进样器，装在色谱柱入口处。现在大都使用六通进样阀或自动进样器。 进样装置要求：密封性好，死体积小，重复性好，保证中心进样，进样时对色谱系统的压力、 流量影响小。HPLC进样方式可分为：隔膜进样、停流进样、阀进样、自动进样。 1．隔膜进样。用微量注射器将样品注入专门设计的与色谱柱相连的进样头内，可把样品直 接送到柱头填充床的中心，死体积几乎等于零，可以获得最佳的柱效，且价格便宜，操作方 便。但不能在高压下使用（如 10MPa以上）；此外隔膜容易吸附样品产生记忆效应，使进样 重复性只能达到 1~2%；加之能耐各种溶剂的橡皮不易找到，常规分析使用受到限制。 2．停流进样。可避免在高压下进样。但在 HPLC中由于隔膜的污染，停泵或重新启动时往 往会出现“鬼峰”；另一缺点是保留时间不准。在以峰的始末信号控制馏分收集的制备色谱 中，效果较好。 3．阀进样。一般 HPLC分析常用六通进样阀（以美国 Rheodyne公司的 7725和 7725i型最 常见），其关键部件由圆形密封垫（转子）和固定底座（定子）组成。由于阀接头和连接管 死体积的存在，柱效率低于隔膜进样（约下降 5~10%左右），但耐高压（35~40MPa），进样 量准确，重复性好（0.5%），操作方便。 六通阀的进样方式有部分装液法和完全装液法两种。①用部分装液法进样时，进样量应不大 于定量环体积的 50%（最多 75％），并要求每次进样体积准确、相同。此法进样的准确度和 重复性决定于注射器取样的熟练程度，而且易产生由进样引起的峰展宽。②用完全装液法进 样时，进样量应不小于定量环体积的 5~10倍（最少 3倍），这样才能完全置换定量环内的流 动相，消除管壁效应，确保进样的准确度及重复性。 六通阀使用和维护注意事项：①样品溶液进样前必须用 0.45µm滤膜过滤，以减少微 粒对进样阀的磨损。②转动阀芯时不能太慢，更不能停留在中间位置，否则流动相受阻，使 泵内压力剧增，甚至超过泵的最大压力；再转到进样位时，过高的压力将使柱头损坏。③为 防止缓冲盐和样品残留在进样阀中，每次分析结束后应冲洗进样阀。通常可用水冲洗，或先 用能溶解样品的溶剂冲洗，再用水冲洗。 4．自动进样。用于大量样品的常规分析。 三、色谱柱 色谱是一种分离分析手段，分离是核心，因此担负分离作用的色谱柱是色谱系统的心脏。对 色谱柱的要求是柱效高、选择性好，分析速度快等。市售的用于 HPLC 的各种微粒填料如 多孔硅胶以及以硅胶为基质的键合相、氧化铝、有机聚合物微球（包括离子交换树脂）、多 孔碳等，其粒度一般为 3,5,7,10μm等，柱效理论值可达 5~16万/米。对于一般的分析只需 5000塔板数的柱效；对于同系物分析，只要 500即可；对于较难分离物质对则可采用高达 2 万的柱子，因此一般 10~30cm左右的柱长就能满足复杂混合物分析的需要。 柱效受柱内外因素影响，为使色谱柱达到最佳效率，除柱外死体积要小外，还要有合理的柱 结构（尽可能减少填充床以外的死体积）及装填技术。即使最好的装填技术，在柱中心部位 和沿管壁部位的填充情况总是不一样的，靠近管壁的部位比较疏松，易产生沟流，流速较快， 影响冲洗剂的流形，使谱带加宽，这就是管壁效应。这种管壁区大约是从管壁向内算起 30 倍粒径的厚度。在一般的液相色谱系统中，柱外效应对柱效的影响远远大于管壁效应。 1．柱的构造 色谱柱由柱管、压帽、卡套（密封环）、筛板（滤片）、接头、螺丝等组成。柱管多用不锈钢 制成，压力不高于 70 kg/cm2时，也可采用厚壁玻璃或石英管，管内壁要求有很高的光洁度。 为提高柱效，减小管壁效应，不锈钢柱内壁多经过抛光。也有人在不锈钢柱内壁涂敷氟塑料 以提高内壁的光洁度，其效果与抛光相同。还有使用熔融硅或玻璃衬里的，用于细管柱。色 谱 柱 两 端 的 柱 接 头 内 装 有 筛 板 ， 是 烧 结 不 锈 钢 或 钛 合 金 ， 孔 径 0.2~20µm(5~10µm)，取决于填料粒度，目的是防止填料漏出。 色谱柱按用途可分为分析型和制备型两类，尺寸规格也不同：①常规分析柱（常量柱），内 径 2~5mm（常用 4.6mm，国内有 4mm和 5mm），柱长 10~30cm；②窄径柱（narrow bore， 又称细管径柱、半微柱 semi-microcolumn），内径 1~2mm，柱长 10~20cm；③毛细管柱（又 称微柱 microcolumn），内径 0.2~0.5mm；④半制备柱，内径＞5mm；⑤ 实验室 17025实验室iso17025实验室认可实验室检查项目微生物实验室标识重点实验室计划 制备柱，内径 20~40mm，柱长 10~30cm；⑥生产制备柱内径可达几十厘米。柱内径一般是根据柱长、填 料粒径和折合流速来确定，目的是为了避免管壁效应。 2．柱的发展方向 因强调分析速度而发展出短柱，柱长 3~10cm，填料粒径 2~3µm。为提高分析灵敏度， 与质谱(MS)联接，而发展出窄径柱、毛细管柱和内径小于 0.2mm的微径柱（microbore）。细 管径柱的优点是：①节省流动相；②灵敏度增加；③样品量少；④能使用长柱达到高分离度； ⑤容易控制柱温；⑥易于实现 LC-MS联用。 但由于柱体积越来越小，柱外效应的影响就更加显著，需要更小池体积的检测器（甚至采用 柱上检测），更小死体积的柱接头和连接部件。配套使用的设备应具备如下性能：输液泵能 精密输出 1~100µl/min的低流量，进样阀能准确、重复地进样微小体积的样品。且因 上样量小，要求高灵敏度的检测器，电化学检测器和质谱仪在这方面具有突出优点。 3．柱的填充和性能评价 色谱柱的性能除了与固定相性能有关外，还与填充技术有关。在正常条件下，填料粒度＞ 20µm时，干法填充制备柱较为合适；颗粒＜20µm时，湿法填充较为理想。填 充方法一般有 4种：①高压匀浆法，多用于分析柱和小规模制备柱的填充；②径向加压法， Waters专利；③轴向加压法，主要用于装填大直径柱；④干法。柱填充的技术性很强，大多 数实验室使用已填充好的商品柱。 必须指出，高效液相色谱柱的获得，装填技术是重要环节，但根本问题还在于填料本身性能 的优劣，以及配套的色谱仪系统的的结构是否合理。 无论是自己装填的还是购买的色谱柱，使用前都要对其性能进行考察，使用期间或放置一段 时间后也要重新检查。柱性能指标包括在一定实验条件下（样品、流动相、流速、温度）下 的柱压、理论塔板高度和塔板数、对称因子、容量因子和选择性因子的重复性，或分离度。 一般说来容量因子和选择性因子的重复性在±5%或±10%以内。进行柱效比较时，还要注 意柱外效应是否有变化。 一份合格的色谱柱评价报告应给出柱的基本参数，如柱长、内径、填料的种类、粒度、色谱 柱的柱效、不对称度和柱压降等。 4．柱的使用和维护注意事项 色谱柱的正确使用和维护十分重要，稍有不慎就会降低柱效、缩短使用寿命甚至损坏。在色 谱操作过程中，需要注意下列问题，以维护色谱柱。 ① 避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。温度的突然变化或者使色谱柱从高处掉下 都会影响柱内的填充状况；柱压的突然升高或降低也会冲动柱内填料，因此在调节流速时应 该缓慢进行，在阀进样时阀的转动不能过缓（如前所述）。 ② 应逐渐改变溶剂的组成，特别是反相色谱中，不应直接从有机溶剂改变为全部是水，反 之亦然。 ③ 一般说来色谱柱不能反冲，只有生产者指明该柱可以反冲时，才可以反冲除去留在柱头 的杂质。否则反冲会迅速降低柱效。 ④ 选择使用适宜的流动相（尤其是 pH），以避免固定相被破坏。有时可以在进样器前面连 接一预柱，分析柱是键合硅胶时，预柱为硅胶，可使流动相在进入分析柱之前预先被硅胶“饱 和”，避免分析柱中的硅胶基质被溶解。 ⑤ 避免将基质复杂的样品尤其是生物样品直接注入柱内，需要对样品进行预处理或者在进 样器和色谱柱之间连接一保护柱。保护柱一般是填有相似固定相的短柱。保护柱可以而且应 该经常更换。 ⑥ 经常用强溶剂冲洗色谱柱，清除保留在柱内的杂质。在进行清洗时，对流路系统中流动 相的置换应以相混溶的溶剂逐渐过渡，每种流动相的体积应是柱体积的 20倍左右，即常规 分析需要 50~75ml。 下面列举一些色谱柱的清洗溶剂及顺序，作为参考：硅胶柱以正已烷（或庚烷）、二氯甲烷 和甲醇依次冲洗，然后再以相反顺序依次冲洗，所有溶剂都必须严格脱水。甲醇能洗去残留 的强极性杂质，已烷使硅胶表面重新活化。反相柱以水、甲醇、乙腈、一氯甲烷（或氯仿） 依次冲洗，再以相反顺序依次冲洗。如果下一步分析用的流动相不含缓冲液，那么可以省略 最后用水冲洗这一步。一氯甲烷能洗去残留的非极性杂质，在甲醇（乙腈）冲洗时重复注射 100~200µl 四氢呋喃数次有助于除去强疏水性杂质。四氢呋喃与乙腈或甲醇的混合溶 液能除去类脂。有时也注射二甲亚砜数次。此外，用乙腈、丙酮和三氟醋酸（0.1%）梯度 洗脱能除去蛋白质污染。 阳离子交换柱可用稀酸缓冲液冲洗，阴离子交换柱可用稀碱缓冲液冲洗，除去交换性能强的 盐，然后用水、甲醇、二氯甲烷（除去吸附在固定相表面的有机物）、甲醇、水依次冲洗。 ⑦ 保存色谱柱时应将柱内充满乙腈或甲醇，柱接头要拧紧，防止溶剂挥发干燥。绝对禁止 将缓冲溶液留在柱内静置过夜或更长时间。 ⑧ 色谱柱使用过程中，如果压力升高，一种可能是烧结滤片被堵塞，这时应更换滤片或将 其取出进行清洗；另一种可能是大分子进入柱内，使柱头被污染；如果柱效降低或色谱峰变 形，则可能柱头出现塌陷，死体积增大。 在后两种情况发生时，小心拧开柱接头，用洁净小钢将柱头填料取出 1~2mm高度（注意把 被污染填料取净）再把柱内填料整平。然后用适当溶剂湿润的固定相（与柱内相同）填满色 谱柱，压平，再拧紧柱接头。这样处理后柱效能得到改善，但是很难恢复到新柱的水平。 柱子失效通常是柱端部分，在分析柱前装一根与分析柱相同固定相的短柱（5~30mm），可 以起到保护、延长柱寿命的作用。采用保护柱会损失一定的柱效，这是值得的。 通常色谱柱寿命在正确使用时可达 2 年以上。以硅胶为基质的填料，只能在 pH2~9 范围内 使用。柱子使用一段时间后，可能有一些吸附作用强的物质保留于柱顶，特别是一些有色物 质更易看清被吸着在柱顶的填料上。新的色谱柱在使用一段时间后柱顶填料可能塌陷，使柱 效下降，这时也可补加填料使柱效恢复。 每次工作完后，最好用洗脱能力强的洗脱液冲洗，例如 ODS柱宜用甲醇冲洗至基线平衡。 当采用盐缓冲溶液作流动相时，使用完后应用无盐流动相冲洗。含卤族元素（氟、氯、溴） 的化合物可能会腐蚀不锈钢管道，不宜长期与之接触。装在 HPLC仪上柱子如不经常使用， 应每隔 4~5天开机冲洗 15分钟。 四、检测器 检测器是HPLC仪的三大关键部件之一。其作用是把洗脱液中组分的量转变为电信号。HPLC 的检测器要求灵敏度高、噪音低（即对温度、流量等外界变化不敏感）、线性范围宽、重复 性好和适用范围广。 1．分类 1）按原理可分为光学检测器（如紫外、荧光、示差折光、蒸发光散射）、热学检测器（如吸 附热）、电化学检测器（如极谱、库仑、安培）、电学检测器（电导、介电常数、压电石英频 率）、放射性检测器（闪烁计数、电子捕获、氦离子化）以及氢火焰离子化检测器。 2）按测量性质可分为通用型和专属型（又称选择性）。通用型检测器测量的是一般物质均具 有的性质，它对溶剂和溶质组分均有反应，如示差折光、蒸发光散射检测器。通用型的灵敏 度一般比专属型的低。专属型检测器只能检测某些组分的某一性质，如紫外、荧光检测器， 它们只对有紫外吸收或荧光发射的组分有响应。 3）按检测方式分为浓度型和质量型。浓度型检测器的响应与流动相中组分的浓度有关，质 量型检测器的响应与单位时间内通过检测器的组分的量有关。 4）检测器还可分为破坏样品和不破坏样品的两种。 2．性能指标 1）噪音和漂移：在仪器稳定之后，记录基线 1小时，基线带宽为噪音，基线在 1小时内的 变化为漂移。它们反映检测器电子元件的稳定性，及其受温度和电源变化的影响，如果有流 动相从色谱柱流入检测器，那么它们还反映流速（泵的脉动）和溶剂（纯度、含有气泡、固 定相流失）的影响。噪音和漂移都会影响测定的准确度，应尽量减小。 2）灵敏度(sensitivity)：表示一定量的样品物质通过检测器时所给出的信号大小。对浓度型 检测器，它表示单位浓度的样品所产生的电信号的大小，单位为 mV?ml/g。对质量型检测器， 它表示在单位时间内通过检测器的单位质量的样品所产生的电信号的大小，单位为 mV?s/g。 3）检测限(detection limit) 检测器灵敏度的高低，并不等于它检测最小样品量或最低样品浓度能力的高低，因为在定义 灵敏度时，没有考虑噪声的大小，而检测限与噪声的大小是直接有关的。 检测限指恰好产生可辨别的信号（通常用 2倍或 3倍噪音表示）时进入检测器的某组分的量 （对浓度型检测器指在流动相中的浓度——注意与分析方法检测限的区别，单位 g/ml 或 mg/ml；对质量型检测器指的是单位时间内进入检测器的量，单位 g/s或 mg/s）。又称为敏感 度(detectability)。D＝2N/S，式中 N 为噪声，S为灵敏度。通常是把一个已知量的标准溶液 注入到检测器中来测定其检测限的大小。 检测限是检测器的一个主要性能指标，其数值越小，检测器性能越好。值得注意的是，分析 方法的检测限除了与检测器的噪声和灵敏度有关外，还与色谱条件、色谱柱和泵的稳定性及 各种柱外因素引起的峰展宽有关。 4）线性范围(linear range)：指检测器的响应信号与组分量成直线关系的范围，即在固定灵敏 度下，最大与最小进样量（浓度型检测器为组分在流动相中的浓度）之比。也可用响应信号 的最大与最小的范围表示，例如Waters 996 PDA检测器的线性范围是-0.1~2.0A。 定量分析的准确与否，关键在于检测器所产生的信号是否与被测样品的量始终呈一定的函数 关系。输出信号与样品量最好呈线性关系，这样进行定量测定时既准确又方便。但实际上没 有一台检测器能在任何范围内呈线性响应。通常 A＝BCx，B为响应因子，当 x=1时，为线 性响应。对大多数检测器来说，x只在一定范围内才接近于 1，实际上通常只要 x=0.98~1.02 就认为它是呈线性的。 线性范围一般可通过实验确定。我们希望检测器的线性范围尽可能大些，能同时测定主成分 和痕量成分。此外还要求池体积小，受温度和流速的影响小，能适合梯度洗脱检测等。 几种检测器的主要性能： UV 荧光 安培 质谱 蒸发光散射 信号 吸光度 荧光强度 电流 离子流强度 散射光强 噪音 10-5 10-3 10-9 线性范围 105 104 105 宽 选择性 是 是 是 否 否 流速影响 无 无 有 无 温度影响 小 小 大 小 检测限(g/ml) 10-10 10-13 10-13 ＜10-9g/s 10-9 池体积(ul) 2~10 ~7 ＜1 —— —— 梯度洗脱 适宜 适宜 不宜 适宜 适宜 细管径柱 难 难 适宜 适宜 适宜 样品破坏 无 无 无 有 无 5）池体积：除制备色谱外，大多数 HPLC检测器的池体积都小于 10µl。在使用细管 径柱时，池体积应减少到 1~2µl甚至更低，不然检测系统带来的峰扩张问题就会很严 重。而且这时池体、检测器与色谱柱的连接、接头等都要精心设计，否则会严重影响柱效和 灵敏度。 3．紫外检测器(ultraviolet detector) UV 检测器是 HPLC 中应用最广泛的检测器，当检测波长范围包括可见光时，又称为紫外- 可见检测器。它灵敏度高，噪音低，线性范围宽，对流速和温度均不敏感，可于制备色谱。 由于灵敏高，因