人类基因组的物理图谱与大规模DNA测序

遗传 HEREDITAS (Beijing) 20(6): 41一47 1998 -W 蕊巨 人类基因组的物理图谱与大规模DNA测序 于 军 （中国科学院遗传研究所人类基因组中心。北京 100101) Physical Mapping and Lakge-scale Sequencing of the Human Genome YU Jun (Human Genome Center, Institute of Genetics, Chinese Acadmy Sciences, Beijing 100101) 1历史的回顾 物理图谱的制作是与分子克隆技术分不开的。限制性内切酶的发现，导致了第一个物理图谱的完成 (SV40; Danna与 Nathans, 1971)。新克隆技术，尤其是 YAC ( Yeast Artificial Chromosome）和BAC (Bacterial Artificial Chromosome)的发明，使物理图谱的制作向前大大地迈进了一步。它们的克隆片段长度使 STS (Sequence Tagged Site; Olson等，1989）成为有力的物理图谱路标，而保证7图谓的联贯性。大肠杆菌、酵母 和C. elegans等物理图谱的完成则标志着制作技术的成熟，有了精确的物理图谱，测序就变得常规化了。 第一个生命基因组（(PhiX 174))顶序的测定是1977年在英国的Sanger试验室完成的，而Sanger的酶法测序以 其速度与准确性很快取代了Maxam和 Gilbert的化学法。大规模测序的开始是以荧光自动 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 仪的发明开始的 (Hunkapiller等，1991)。它不仅效率高而且测序的质量也比手工操作高得多。由于DNA多聚酶的不断修饰和荧 光底物的不断更新，在很长的一段时间里，荧光测序法会保持主导地位。毛细管电泳也有可能在不久的将来取代 现在的平板电泳。现在的难点之一，是由于受到毛细管的空间和电泳介质的限制使读序的长度不够，一般停留在 300 by到450 by左右，而平板电泳则高达600 by到900bp左右。 除了基本技术和仪器外，测序的策略也很重要。散弹测序法 （Shotgun Sequencing）是策略的代表作之一。 它主要依赖于计算机技术将单一读序自动组装起来，而减少人工操作。 人类基因组物理图谱的初期完成主要有两个标志：全基因组和各染色体物理图谱。全基因组物理图谱是由法 国Daniel Cohen领导的 CEPH ( Centre d'Etude du Polymorphisme Humain）和美国Eric Lander领导的 Whitehead基因组中心分别完成的。由于他们制作物理图谱是为遗传图谱打基础，分辨率较低，仅在 0. 5到 1 Mb左右。单个染色体物理图谱的分辨率则高得多，一般要求在 l OOKb左右．完成最早的单个染色体是 Y和21 号。质量最高的数X和7号染色体． 分辨率其实有两个重要的参数二有顺序路标（(Ordered Markers)的平均距离和总路标的平均距离。比如，美 国NIH的Eric Green小组制作的7号染色体物理图谱中，STS间的平均距离是79Kb．但是这些路标只有百分 之九一是有明确顺序的，所以其真正分辨率只有平均88Kb ( Bouffard等，1997)。再如，Eric Lande：领导的 MIT小组（Hudson等，1995)的图谱只有170Kb的分辨率，而有顺序路标的平均距离则只有1 Mbo DNA大规模顺序测定是在低精度遗传图谱与物理图谱宣告完成后，酵母和C. elegans测序工作显示不容质 疑的成功希望时开始的（Olson, 1995)。英国Sanger中心的John Sulston和美国圣路易斯华盛顿大学的Robert Waterston是这个领域的先驱。不容忽略的是这些物理图谱的关键作用，它们为测序提供了基本原料。没有这样 的基本原料，测序的速度就会受到限制。 遗 传 HEREDITAS (Beijing) 1998 20卷 2制作物理图谱的基本要素与原理 2.1物理图谱制作的基本要素 2.1.1路标 （Landmark) 路标是用来标位的工具。对于物理图谱来讲有 STS(Olson等，1989）和限制性内切 酶位点。对于遗传图谱来讲有RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), microsatellites，和SNP (Sin gle Nucleotide Polymorphisms). 2.1.2单位（Unit) 单位的概念比较复杂一些，限制性内切酶的酶切片段是限制性内切酶物理图谱的基本单位， STS则由它相对整个基因组的专一性而自成单位。基因组的每一个碱基是物理图谱的终极单位。 2.1.3顺序（Order) 由于物理图谱与遗传图谱都是一维空间的，顺序的测定就成了制作图谱的终极目的。顺序 是路标间的相对位置。这个相对位置具有绝对的专一性。 2.1.4可复制的DNA片段（Clonable Fragments） 目前，可复制的的DNA片段有辐射杂交株（Radiation Hybrid), YAC (Yeast Artificial Chromosome), BAC (Bacterial Artificial Chromosome), P1，Cosmid, Fosmid以 及其它细菌复制系统。 2.2物理图谱制作的基本原理 一个完整的物理图谱应该有路标的顺序，距离标尺和可复制的克隆。比如，在 RH图谱中，STS是路标， RH细胞可以复制，但距离是个未知数。它只能作为低分辨物理图谱。其主要用途是保持STS在长距离上的顺 序和其与遗传图谱的关系。因为它的分辨能力与遗传图谱的分辨率相近。限制性内切酶制图似乎是理想的候选， 在一般条件下其分辨率可在200到500 by左右。 2.2.1物理图谱的本质是路标和克隆的顺序 物理图谱与克隆DNA指纹的差异在于物理图谱中的路标具有一 定的顺序。图 1揭示了图谱与DNA指纹的这种关系。 1. DNA指纹 （没有顺序） 2．可能的排序 3．重叠定顺序 共有6种可能，可写作： 图 1物理图谱的本质是克隆和DNA片段的顺序排列 以一个DNA克隆的指纹产生4个片段为例（(1)，一个克隆的信息无法确定任何片段的顺序(2)，而三个 重叠的克隆就可以确定两个片段的顺序（3)．可用简单的方式表达出来，这里的短竖线表示两边片段顺序未知． 2.2.2低分辨率物理图谱是高分辨率物理图谱的基石 物理图请的制作是纵向整合。STS确定了YAC克隆的 顺序，YAC又将STS连接在一起。然而YAC不能用来直接测序，还要进一步分解成限制性内切酶图谱。BAC 的普遍应用已基本取代了YAC. RH细胞株也可以用来作类似的STS容量图谱． 42 共有4!种 10刀 (kb) 5.0 2.0 0.8 6期 于 军：人类基因组的物理图谱与大规模 DNA测序 2.2.3物理图谱的连续性 单一克隆或重叠克隆都不是图谱。重叠克隆的延续可以制成图谱 克隆末端的数量 决定了可排 DNA片段的数量 （见图2)。连续性是由文库的容量和覆盖率所决定的并与制库的技术和 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 息息 相关。 物理图谱的连续性是大规模测序的基本保障。也是资金消耗预算的基本出发点。在没有达到连续性要求时， 价格是无法预测的。因为合拢这些间隙的耗资很难预测。物理图谱的间隙有时可以用末端延伸 （Walking）来合 拢，有时并不容易。例如，当缺失的间隙很大，尤其是遇到无法克隆的片段时，延伸的可能性就更小了。此类间 隙一般在500 Kb到 l Mb左右才有可能遇到一个。目前在Genbank中超过500 Kb的DNA片段只有几个。 图2 物理图谱中DNA片段的顺序是由克隆末端的数量决定的 克隆A决定了片段 1和8的位置；克隆B决定了片段2和9的位置。依此类推 理论上讲、每一个片段的排序需要至少有一个末端，克隆的覆盖率是一个重的因素。 2.3制作物理图谱的纵向整合 制作物理图谱的精髓是它的纵向整合。人类基因组共有46条染色体：22对常染色体，外加X, Y两个性染 色体 这些染色体就成了基因图谱的必然单位。又因为DNA的基本结构单位是碱基，那磨单个碱基就成了物理 图谱的最小单位。所谓的纵向整合，是指从染色体到碱基的依赖关系。每个有顺序的碱基都相对地在染色体上占 一个位置。也就是说，物理图谱的最终形式是碱基在染色体上的相对顺序。 那磨，怎样把染色体分解成可测定顺序的形式呢？分子克隆是目前的唯一手段。染色体片段可以克隆， DNA片段也可以克隆。下面列举的是不同水平的克隆方法。2.3.1放射杂交株（Radiation Hybrid, RH） 这一 技术是在体细胞杂交株 （Goss与 Harris, 1975）的基础上发展起来的。其基本原理是利用X一光照射人细胞株使染 色体断裂，再转移到中国仓鼠体细胞株中（(Cox等，1990)。这些经过筛选和扩增的细胞株可以用来定位STS和用 统计学方法计算它们的间距。 2.3.2酵母人T -染色体（Yeast Artificial Chromosome, YAC) YAC是Olson实验室发展出来分子克隆技术 (Burke等，1987)。它是利用酵母染色体的结构和酵母复制系统来复制DNA大分子。它可以用来克隆200到 2000 Kb的DNA片段。 2.3.3细菌人T染色体（Bacterial Artificial Chromosome, BAC） 细菌人工染色体是利用F质粒的单拷贝控制系 统来 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 的。它可以运载100到300Kb基因组DNA (Shzuya等，1992), 2.3.4 Cosmid与Fosmid Cosmid用途很广，基于其组装的效率，可用来制备文库和再克隆大的DNA片 段，尽管不如Lambda和 Fosmid稳定，但拷贝数量很高，易于DNA制备 Fosmid用途不广，因为它是单拷 贝载体，较Cosmid稳定，主要用于难克隆的DNA. 2.3.5 Lambda噬菌体和质粒 它们只能用于克隆20 Kb以下的小片段。Lambda的特点是它对所克隆片段的 大小不敏感。而质粒则很敏感，小片段会有选择地先克隆进去。 43 44 遗 传 HEREDITAS (Beijing) 1998 20卷 3制作物理图谱的基本方法 3.1 STS一容积制图 （STS-content Mapping) STS的概念是由Maynard V. Olson等根据物理图谱的制作需要提出来的（Olson等，1989)。这一概念的提 出使低分辨率物理图谱的制作产生了新的飞跃，之所以称为飞跃是因为这一概念是基于当时刚刚发明的PCR技 术。老旧的杂交方法用于人类基因组有很多不便。比如，重复序列、多基因家族、假基因等都给杂交法带来困 难 错误率与数据量都走向极限。相反，PCR可用以区别单个碱基的差异，需时短，见效快。 STS一容积制图的原理很简单，与筑路的打桩划线一样，YAC在这里是作为线，STS则作为桩。每一个桩都 是一个唯一的路标。不同的是，这里的路不是从一个端点开始的，是多点生长。另外，DNA的线性特点决定了 这条路只是一维空间的。STS一容积制图的主要步骤如下： (1) YAC克隆的排列与YAC DNA组合（Pooling） 一般是采用％孔板，三维组合。 (2)制作STS STS有许多来源，EST。已知遗传标记，随机测序，YAC末端测序等。 (3) STS确定 一般采用PCR方法。 (4) A图 通常使用的软件是由Phil Green小组的C. L. Magness等人编写的SEGMAP（参见http: / / www.genome.washington.edu / UWGC /tools/ segmap.htm) . SEGMAP根据 STS的分析数据，将 YACcontig组装在一起，又根据YAC的长度估计STS间的距离． 1997年、Eric Green小组的第七号染色体物理图谱和David Schlesinger小组的X染色体物理图谱分别以低 于100Kb的分辨率完成（Bouffard等，1997; Nagaraja等，1997)。笔者与同事曾著文为此欢呼并评估物理图谱制 作的现状 （Yuand Wong, 1997)。这两个小组都是以制备YAC文库为出发点，在Olson的指导下，不断完善 STS图谱制作的理论和试验技术，锲而不舍而取得成功的． 3.2限制性内切酶制图 3.2.1限制性内切酶制图的基本步骤及范例 限制性内切酶制图是最经典的物理图谱制作方法之一。一个克隆 可以被酶切成不同长度的片段，也就是所谓的指纹（Fingerprint)。但是指纹并不是图谱，因为它没有顺序。限 制性内切酶制图主要有以下几个步骤： 制备克隆DNA;克隆的DNA指纹分析主要是酶切、电泳分离、杂交标记或图象处理；克隆的排列和DNA 片段的排序一般由计算机处理；填空隙，包括分离新克隆及PCR验证等。三个有代表性的方法是￡coli,酵母和 C. elegans的物理图谱。 E. coli的物理图谱 (4.6 Mb; Kohara等，1987)是由日本科学家完成的，它们的基本方法是用不完全酶切法 和放射性标记杂交。和一般的不完全酶切法一样，他们用标记的载体作为探针来识别不同的DNA片段。此法在 技术上不是很好掌握，也很难规模化。 酵母（Saccharomyces; 12 Mb）的物理图谱是由Maynard Olson实验室制作的（Olson等，1986)。主要的 策略是用随机取样和限制性内切酶完全酶切指纹法，用克隆间的重叠来排出克隆和酶切片段的顺序。图谱所用的 克隆是以噬菌体为主。这个项目的成功在于物理化学、数学、分子生物学、计算机等学科及其技术的有机结合。 比如，Olson实验室所用的缓冲液是高盐缓冲液而不是一般的TBE或TAE, 克隆和 DNA片段的组装都是用自己设计的软件。由于软件的复杂性，这个方法的推广有一定的难度。这个 方法的特点是技术简单，不用标记。因为实验的重复性非常好，完全酶解法可以规模化。这个项目的成功为酵母 的完整测序铺下了基石，使酵母成为第一个完成全测序的真核生物。 C. elegans(50 Mb)的物理图谱也是一个很好的例子 （Coulson等，1986)。它的制作虽然也是用完全酶切，但 也用了末端标记。这个项目主要是用Cosmid，由于其多拷贝的特点，克隆的稳定性较差，物理图谱完成是有600 余个Contigs．后来，Y AC克隆被用来将这些Contigs连接起来。这个制作方法较简单，只收集一部分DNA片段 的数据，用公有的片段识别重叠。Sanger中心还完成用来组装图谱的软件，FPC (The Sanger Center, UK). C. 6期 于 军：人类基因组的物理图谱与大规模DNA测序 45 elegans物理图谱的制作成功是其成为第二个被完整测序的真核生物。 3.2.2多酶完全切法 （Multiple-complete-digest, MCD） 多酶完全切法是在单酶法的基础上发展出来的 (Wong和1997)。它的特点是准确，自动化分析，可规模化。这个方法主要依赖于琼脂电泳分离的可重复性， 图象分析的自动化和图谱组装的自动化。这种方法既可以用来制作完整基因组的图谱，也可以用来制作单个 YAC或BAC克隆的物理图谱。其基本步骤如下二 (1)组建Cosmid文库；(2)随机取样，制作DNA指纹，一般要有10-v 15 x的筱盖率；(33)识别载体片段； (4）图谱组装。 3.3其它制图方法 除了限制性内切酶法外，杂交法也经常用到。例如，利用重复序列作探针的杂交法（Stalling等，1990)。其优 点是简便，但误差较高，仅使用于样品数量较少的情况。不完全酶解法也有一定的用途，但实验不容易掌握，尤 其是在DNA片段较多时。 近年来，由于物理技术的介人，许多新颖的物理制图方法涌现出来。如David Schwartz (New York Univers卜 ty)鼓吹的光学制图（Optical Mapping)，染色体显微切割 ( Microdissection）等。这些技术都会找到应用的角 度，它们的缺点是得不到相应的克隆，而克隆是分子生物学的基本原料。 4 DNA顺序的测定 4.1 DNA顺序的测定的基本策略：分而治之 DNA顺序的测定基本上是采用分而治之的法。目前，可用来测序的DNA有BAC. Cosmid, Fosmid.噬 菌体和质粒。细菌和小基因组 （小于 IOMb)也可直接用散弹法测序。随着技术的不断改进，科学家会向新的长 度挑战的。大规模测序的两个前沿基本上都采用散弹法。无论是逐个克隆测序还是全基因组测序，其主要的限制 是组装。如果重复顺序和人为间隙不来捣乱的话，人类基因组也许可用散弹法直接测序。然而，多染色体基因组 的测序仍然采用逐个克隆各个击破、单分子基因组的测序则可用全基因组散弹法。 4.2 DNA顺序的测定的质量和准确性 DNA测序的准确性是基于DNA多态性的特点而定的。因为基因多态性是在千分之一左右，一般公认测序 错误要在万分之一以下，一超过前者十倍犷DNA测序的质量是由初级数据所决定的。 4.3 DNA )III序的组装－ DNA顺序的组装是一项技术性很强的工作。目前应用最广的软件是 Phil Green实验室发展的一套完整的系 统Phred-Phra沪毛onsed (Ewing蔑1.998; Ewing与Green, 1998; Gordon等，1998)。其基本步骤如下： (1)找道(Lane Tracking） 一找到电泳道并VIII泳道的空间；(2）信号分离（(Lane Profiling） 分离碱基的 四种不同信号；(3)信号分析 （Trace Processing） 估计信号的强弱和基线，纠正信号的交叉；(4)碱基识别 (Base-calling)：按顺序破译碱基；(5）错误率的估计（Error Probabilities） 根据信号峰的I司距，识别与未识别 碱基比率，·及信号峰分辨率等来估计错误。 Phrap(组装器）和Consed（校对器）的基本功能是：根据Phred的结果从头组装散弹法产生的不同的短顺序； 显示组装结果和质量；整合人工校对结兔 TIGR ( The Institute of Genome Research）在组装他们细菌基因组的顺序时，主要是用PE-ABI(Perkin Elmer-Applied Biosystems）的组装软件，AUTOASSEMBLER和他们自己的组装软件TIGR ASSEMBLER和 TIGR EDITOR, 4.4测序数据的管理 （Data Management）和处理（Data Processing) 大规模测序所产生的数据量之大是难以形容的。一般说来，一个测序中心至少有三分之一的人力来管理和处 理这些数据。由于人力和财力的集中，各个中心倾向于设计自己的软件系统，而且在易于使用上下了很多功夫。 遗 传HEREDITAS (Beijing) 1998 20卷 5 DNA测序的规模化与工业化 5.1 DNA测序规模化的技术前提 DNA侧序无疑已经进人规模化阶段，从样品的制备到侧序电泳都进人半自动化状态．毛细管电泳仪也有希 望在近期进人市场．目前测序的成本有降低到十至二十美分的可能．这一成本的降低使很多较大的基因组也可以 排到测序的时间表中。 目前，广范应用的两个测序策略是全基因组散弹法和逐克隆测定法。虽然有人提出用散弹法测序人类基因组 (Weber与 Myers, 1997)，但由于人类基因组中高比率的重复序列的存在 （尤其是 LINE, 2到7Kb长），克隆文 库有无可避免的间隙和基因的多态性等基本原因，散弹的组装几乎是不可能的（Green, 1997)。其中、主要是受 读序长度所限，无法跨过LINE。然而，小基因组 （(1到5 Mb)的散弹测序还是非常成功的． 逐克隆测定法的限制是物理图谱的制作。这方面技术的发展和自动化程度都有待于进一步的发展．实际上， 随着物理和遗传图谱的不断完善，EST, cDNA, BAC末端顺序等的不断积累，散弹法也会吸引人们去冒险。 5.2 DNA测序规模化的现状 人类基因组测序进人冲刺阶段。目前，世界上大规模测序中心已有十几个之多。测序量都逐年在成倍增长． 生物产业界也在不断地推动这个前沿。 模式生物的测序如火如茶。C. elega二的测序即将完成。小鼠基因组的测序正在酝酿之中。河豚鱼、斑马鱼 也有可能排到日程上．如果价格降低，技术不断改进，灵长类、哺乳类动物也可开始测序。 微生物的测序如洪闸打开。目前，有近百种微生物或致病菌已经或将要被完全测序．几乎所有的DNA侧序 中心都承担一定比例的小基因组测序工作，很多制药公司也有相当的投人。病原菌顺序的测定会为新抗菌素的发 现和设计提供非常有利的条件。 商品植物和家养动物基因组的工作已经初步展开．人类已积累了一万年以上丰富的驯化野生动植物的经验， 人类的生活无时无刻不依赖于自然界和家养的动植物．优良动植物品种的培养和筛选有赖于遗传学提供科学、快 速的方法和技术．水稻的遗传工程已在中国展开，玉米、小麦、大豆、棉花等粮食经济作物的研究也应展开。动 物类，如猪、牛、羊、鸡等是食物蛋白的主要来源，也应予以不断改良。传统的杂交方法，新的转基因方法都应 予以重视。DNA测序的工业化也将促使新项目的展开。价格的低廉，市场的开拓，可使一些以前无法想象的项 目成为现实。目前的测序单上除了人以外还有小鼠、大鼠、黑猩猩、斑马鱼、河豚鱼，将来还会加上猪、羊、 牛、马、狗、猫等等。植物也会有一个更长的清单。 其实，对于高等动物来讲，除了有选择的新物种外，基因组的全测序必要性并不大。组建相应的高度的物理 和遗传图谱就足够了。测序的能力应放在全长 cDNA和基因调控区上，尤其是近亲繁殖系的实验动物．功夫应 下在找出定量性状和有关基因。 5.3 DNA测序规模化的趋势和技术关健 DNA测序规模化的基本趋势之一是技术的并进。除了测序技术外，PCR技术，DNA顺序分析，DNA制 备，文库组建，数据分析等都平行地发展．自动化也相应地紧跟在后．很明显，机器要运转，样品要不断供应， 数据要及时处理。根据半导体工业和计算机工业的经验，微型化自然地成为未来的技术。目前，生物硅片．微量 液体反应器等都在飞速发展之中，在不久的将来都会变成现实。基因组研究正在成为实足的技术密集型工业。 DNA测序规模化的第一关键是数据的分析和处理。随着技术的不断改进，数据的积累将不成问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 ，尤其是 原始数据。例如，目前的测序能力完全可以开始全基因组散弹测序，但没有人敢预言能够将其组装起来，很多数 据处理技术还没有达到应有水平．很多问题要与生物学家协作解决．上百万的EST的数据就已使很多分子生物 学家忙得不亦乐乎了。要把这些 EST按组织来源，按细胞的富集量，可能的功能等分门别类使其易于应用，有 很多工作要做。 DNA测序规模化的另外一个特点是工作的完整性或彻底性。全基因组测序，全 EST测序，全长cDNA侧 46 6期 于 W：人类基因组的物理图谱与大规模DNA测序 47 序，全基因组扫描等等。新技术，新系统的设计都要从这里着眼。要从完整性着眼。 不难想象，在未来的二十一世纪里，从事基因组研究的科学家们需要的第一硬件就是计算机，一端连在数据 库，一端连在工业化管理和运作的“理想实验室”，脖子上挂着电话和同行设计实验，讨论结果，口述文章。实验 室里不是摆满仪器和试剂，而是一套完整的健身器。虽然要作的工作还很多，比如基因功能的研究，基因产物一 一酶和蛋白水平的研究等，这个日子的到来不会是很久远的。就现在的进展来看，因为基因组研究的高度工业化 水平，很难相信这些工作在十年或二十年后还会在一般的实验室里完成。可以相信，随着工艺的不断更新，新技术 的不断出现，DNA测序的规模化和工业化是不可避免的。 参 考 文 献 1 Bouffard G G, Idol J R, Braden V V et al. A physical map of human chromosome 7：an integrated YAC contig map with average STS spacing of 79kb. Genome Res.. 1997, 7：673一692 2 Burke D T, Carle G F, Olson M V. Cloning of large exogenous DNA into yeast by means of artificial chromosome vectors. Science, 1987, 244: 1348-- 1351 3 Coulson A, Sulston J. Brenner S, Karn J. Toward a physical map of the genome of the nematode Caenorhabditis elegans. Proc, Natl. Acad. Sci. USA, 1986, 83：7821一7825 4 Danna K, Nathans D. Specific cleavage of simian virus 40 DNA by restriction endonuclease of Hemophilus influenzae. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1971, 68：2913一2917 5 Ewing B, Ladeana H, Wendl M C, Green P. Base一calling of automated sequencer traces using Phred. 1. Accuracy assessment. Genome Res., 1988, 8：175一185 6 Ewing B, Green P. Base一calling of automated sequencer traces using Phred. 11, Error probabilities. Genome Res.，1998，8：186～194 7 Gordon D. Abajian C, Green P. Consed: a graphical tool for sequence finishing. Genome Res.‘1998． 8: 195～ 202 8 Green P. Against a whole-genome shotgun. Genome Res., 1997, 7: 410一417 9 Hudson T J, Stein L D. Gerety D S et al. Science, 1995，258：60一66 10 Hunkapiller T, Kaiser R J, Koop B F, Hood L. Science, 1991，254: 59一67 11 Kohara Y, Akiyama K, Isono K. The physical map of the whole E. coli chromosome: application of a new strategy for rapid analysis and sorting of a large genomic library. Cell, 1987, 50: 495一508 12 Maxam A M, Gilbert W. A new method of sequencing DNA. Proc, Natl. Acad. Sci. USA, 1977, 74: 560一 564 13 Olson M V, Dutchik J E, Graham M Y, Broduer G M et al. 1986. Random一clone strategy for restric- tion mapping in yeast, Proc. Nail. Acad. Sci. USA, 1986, 83：7825～7830 14 Olson M V, Hood L, Cantor C, Bostein D. A common language for physical mapping of the human genome. Science, 1989, 245：1434 15 Sanger F, Coulson A R. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. J. Mol. Biol., 1975, 94: 444一448 16 Sager F, Nicklen S, Coulson A R. DNA sequencing with chain一terminating inhibitors. Proc. Nail. Acad. Sci. USA, 1977, 74: 5463～5467 17 SatIling R L, Torney D C, Hildebr C E et al. Physical mapping of human chromosomes by repetitive sequence fingerprinting. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87：6218一6222 18 Shizuya H, Nirren B, Kim U J et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 98: 8794一8797 19 Weber J L, Myers E W. Human whole-genome shotgun sequencing. Genome Res., 1997, 7: 401一409 20 Yu J, Wong G KS. The Mapper's torch song. Genome Res二1997, 7: 666一668 1998-06-26收稿、1998-10-19修回． 1999年《国外农学一一任杂粮作物》征订启事 《国外农学一叫一杂 粮作物》为农业部主管、辽宁省农业科学院和沈阳农业大学主办的国家级农业科技刊物，主要 报道国内外玉米、高粱、马铃薯、甘薯、杂谷等作物在生理、生化、遗传、育种、耕作、栽培、植保、土肥、生物 技术等方面的研究 论文 政研论文下载论文大学下载论文大学下载关于长拳的论文浙大论文封面下载 与综述等，读者对象为农业科技人员、农业院校师生和农业领导干部。 《国外农学一一杂粮作物》为双月刊，每期56页，单价2.50元，全年 15元。可直接向本编辑部订阅，不另收邮 费。地址：沈阳市东陵路84号辽宁省农科院情报所《国外农学一一杂粮作物》编辑部，邮政编码：110161