从分子标志物检测谈结肠直肠肿瘤的药物治疗

J Diagn Concepts Pract 2009, Vol.8, No.1 实体瘤的异质性在临床选择化疗中是一个长 期困扰医师的难题。即便是肿瘤病理分期和分化程 度相似的不同个体，对同一化疗 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 的临床反应和 预后仍存较大差异。根据不同个体的分子分型与遗 传背景差异制定 “分子处方”， 以指导临床选择高 效、低毒的化疗药物，实现药物选择、配伍、剂量均 恰到好处的“个体化治疗“，是临床医师多年来梦寐 以求的目标。 影响抗肿瘤药物疗效的因素很多， 包括药动 学、药物在体内的激活与灭活、不同个体间药物靶 点 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达的差异、不同个体对药物相关损伤的病理生 理学特征与药物遗传学差异等。 众多证据表明，某 些关键基因的表达水平及其产物功能改变可能影 响患者的化疗疗效。 20 世纪 90 年代以来，随着分 子生物学技术的发展，尤其是高通量分子检测技术 和新型分子标志物的涌现，使针对不同患者精确选 择化疗方案及确定剂量成为可能，并由此推动肿瘤 药物治疗从目前单一遵循大规模人群随机对照研 究数据的“循证医学”模式，逐渐过渡到结合不同个 体差异、从分子分型和药物遗传学角度开展个体化 治疗的“循因医学”模式。 疗效预测标志物与预后判断标志物 临床化疗领域目前使用较多的分子标志物大 致可分为疗效预测标志物（predictive marker）和预 后判断标志物（prognostic marker）2种。 前者是预测 某一个特定治疗药物疗效的标志物， 如 k-ras 基因 突变状态有助于预测表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor, EGFR）单克隆抗体（后简称 “单抗”）的临床疗效，而预后判断标志物则是有助 于判断患者预后的指标，如 18q 缺失可提示结肠直 肠肿瘤患者总体生存期较差。预后判断标志物有助 于指导何时开始治疗，而疗效预测标志物则为临床 选用何种药物及何种组合治疗提供信息。有些标志 物兼具上述 2 种标志物的作用， 如胸苷酸合成酶 (TS)，其既有助于判断 5-氟尿嘧啶（5-FU）疗效，又 可预测患者的预后 。 2008 年的 ASCO 会议上 ， Meropol 等归纳 总结 初级经济法重点总结下载党员个人总结TXt高中句型全总结.doc高中句型全总结.doc理论力学知识点总结pdf 了结肠直肠肿瘤药物治疗的相 关疗效预测标志物（见表 1）。 EGFR单抗与 k-ras基因突变 肿瘤的发生、发展是一个多基因、多步骤的复 杂过程，其间伴随着大量的突变事件。 对此类事件 生化反应本质的探究，可为开发更高效的靶向治疗 药物和疗效预测标志物奠定基础。 EGFR是抗肿瘤 靶向治疗中的重要药物靶点之一。 目前，我国已上 市的针对 EGFR的单抗为西妥昔单抗。该药物是一 种人鼠嵌合性 IgG 抗体， 可以高出内源性配体 5～ 10 倍的亲和力，竞争性地与肿瘤细胞表面的 EGFR 结合，阻断 EGFR 信号转导通路，使信号无法传递 ·专家论坛· 从分子标志物检测谈结肠直肠肿瘤的药物治疗 张 俊 1a,1b， 谢克平 2， 朱正纲 1a ， 林言箴 1a （1. 上海交通大学医学院附属瑞金医院 a外科,b放化疗科，上海 200025； 2. 美国得克萨斯州立大学 M.D.Anderson肿瘤中心胃肠肿瘤科，休斯敦 77030） 关键词：结肠直肠肿瘤； 化学治疗； 靶向治疗 中图分类号：R735.3+4 文献标识码：A 文章编号：1671-2870（2009）01-0020-05 基金项目：国家自然科学基金（30801371）；上海市教委科研专项基金（06BZ039） 药物 标志物 氟尿嘧啶类药物 TS、 DPD、TP、 MSI、 MTHFR 表达状态及基因多态性 伊立替康 UGT 多态性、MSI、 转运蛋白多态性 奥沙利铂 ERCC1、 GST P1、 XPD 表达、转运蛋白多态性 针对 EGFR的单抗 基因扩增和多态性、 ras 突变、BRAF 突变、 配体表达、 PTEN 表达、 VEGF 水平 针对 VEGF 的单抗 VEGF 多态性、 ICAM 多态性和表达水平、 选择素 E 表达水平、 HIF1、 Glut-1、 VEGFR 表达 表 1 常用结肠直肠肿瘤治疗药物的潜在疗效预测标志物 TS：胸苷酸合成酶；DPD：二氢嘧啶脱氢酶；TP：胸苷磷酸化酶；MSI：微卫星不稳定；MTHFR：亚甲基四氢叶酸还原酶；UGT：尿苷二磷酸葡萄糖醛 酸转移酶；GST P1: 谷胱甘肽 S-转移酶 P1；VEGF：血管内皮生长因子；VEGFR：血管内皮生长因子受体；HIF1：缺氧诱导因子 1 20· · 诊断学理论与实践 2009 年第 8 卷第 1 期 至细胞核内，导致转录抑制，从而抑制肿瘤生长。此 外，西妥昔单抗还可通过抗体依赖的细胞毒效应发 挥抗肿瘤作用。 2008年，Karapetis等[1] 在《新英格兰医学杂志》 上提出， 在进展期结肠直肠癌患者中，EGFR 单抗 （西妥昔单抗） 仅对于无 k-ras 基因突变者有疗效。 van Cutsem 等对Ⅲ期 CRYSTAL 研究进行回顾分 析，检测了 540 例 EGFR 表达阳性的转移性结肠直 肠癌患者的 k-ras基因突变情况。发现对于 k-ras野 生型患者，FOLFIRI 方案加用西妥昔单抗的有效率 升高(59% 比 43%,P=0.0025)，中位无进展生存(PFS) 期延长(9.9 个月 比 8.7 个月 ,P=0.0167)；对于 k-ras 突变型患者的相应有效率分别为 36%和 40%(P= 0.46)， 中位 PFS 期分别为 7.6 个月和 8.1 个月 (P= 0.47)。 可见，k-ras野生型患者接受 FOLFIRI联合西 妥昔单抗治疗能获得良好疗效，疾病进展危险降低 32%，k-ras突变型患者则无法从西妥昔单抗治疗中 获益。 k-ras基因产物是一种 GTP结合蛋白，在细胞生 长和增殖信号转导通路中起重要的分子开关作用， 也是有丝分裂原激活的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）通路中的核心蛋白，而 MAPK 通路是能被 EGFR 信号激活的诸多信号转导通路 之一[2]。 就分子机制而言，EGFR信号转导通路中的 各接头蛋白（包括 k-ras 基因）突变，可导致 MAPK 通路等下游信号系统自主激活而不依赖 EGFR 信 号。 此外，k-ras基因突变并不是孤立事件， 还伴有 BRAF、PI3K 基因等其他分子突变， 这也解释了为 何临床上仍有些 k-ras 野生型患者经抗 EGFR 单抗 治疗无效的原因。 以药物的直接靶点作为疗效预测指标似乎顺 理成章。 美国食品药品管理局（FDA）曾规定，接受 曲妥珠单抗治疗的乳腺癌患者， 其 HER-2 表达必 须呈阳性，同时规定应用西妥昔单抗和帕尼单抗治 疗的结肠直肠癌患者肿瘤组织标本必须检测到 EGFR 表达。 在早期开展的多项临床研究中，也确 实将 EGFR 表达阳性作为患者入选治疗的必备标 准[3]。但在结肠直肠癌患者中，并未提示使用免疫组 化技术检测 EGFR 蛋白表达阳性与应用 EGFR 单 抗治疗有较好的疗效相关。 目前多数学者认为，当 初 FDA 将 EGFR 检测阳性结果用于指导 EGFR 单 抗治疗的规定属误导[4]。 对于预测 EGFR 单抗治疗疗效，k-ras 基因突 变分析较单一免疫组化检测更为合理 [5]，原因如 下：①与蛋白质在标本处理过程中受固定剂、脱水 剂、 包埋试剂和储存条件等诸多因素影响不同， DNA 在石蜡包埋组织中的结构相对保持稳定 。 ②基因突变检测只有野生型和突变型 2 种结果，清 晰明了，而免疫组化染色强度和染色比例的评判结 果则受较多人为因素的影响。③鉴于约 40％的结肠 直肠肿瘤患者可发生 k-ras 基因突变， 且为结肠直 肠肿瘤发生、发展过程中出现较早期的事件，故在 原发灶和转移灶中均可检测到 k-ras 基因突变，标 本选择余地较大。Santini等[6]检测了 99例结肠直肠 肿瘤原发灶和转移灶中的 k-ras 突变情况， 发现仅 有 4例（4％）表达不一致。 ④绝大多数的 k-ras基因 突变位点仅限于 12、13、61 这 3 个密码子， 用 PCR 技术即可检出， 无需进行繁杂的多个外显子测序， 从技术操作上也较为简便。 对于考虑接受 EGFR 单抗治疗的患者，应先检 测 k-ras 基因突变，以排除 k-ras 突变的患者，避免 盲目施予 EGFR单克隆抗体治疗。多个Ⅲ期临床研 究的分层分析结果显示，EGFR单抗治疗仅对于 k-ras 野生型患者有效 [7]。 欧洲药品管理局（EMA）也规 定，帕尼单抗应仅用于 k-ras野生型的患者。这也是 迄今为止，第一个对实体瘤治疗药物选用时要求基 于基因检测结果的规定。 除 k-ras 突变， 另一个与 EGFR 单抗治疗相关 的因素是皮疹。出现痤疮样皮疹的患者总体预后较 好。 在 BOND-1 研究中，应用西妥昔单抗作为结肠 直肠肿瘤二线治疗，出现 3～4 度皮疹者的中位生存 期是其他患者的 3倍（9.1个月 比 3.0个月）[8]，但其 确切机制尚未明确。 氟尿嘧啶类药物与其疗效的影响因素 5-氟尿嘧啶（5-FU）是胃肠道肿瘤患者化疗采 用的主要药物， 其在体内胸苷磷酸化酶（thymidine phosphorylase，TP）催化下，次第转化为脱氧氟尿苷 （FUDR）和氟尿嘧啶脱氧核苷酸（FdUMP），后者与 TS、5,10-亚甲基四氢叶酸形成三联复合物， 抑制 TS 活性，阻碍胸苷酸二钠（dTMP）合成，干扰 DNA复制。 二氢嘧啶脱氢酶 （dihydropyrimidine dehydrogenase， DPD）是5-FU 分解代谢的起始酶和限速酶，其活性 在肝脏和外周血单个核细胞中最高。 约 80%的 5-FU 在肝脏和其他组织中被 DPD 还原为无活性的二氢 氟尿嘧啶（FUH2），继而形成 α-氟-β-丙氨酸（FBAL） 经肾脏排泄。 从理论上讲，5-FU化疗的敏感性应与 21· · J Diagn Concepts Pract 2009, Vol.8, No.1 上述的 TP、TS和 DPD 活性相关。 一、TP 尽管 TP是 5-FU转化为活性成分的关键酶，且 研究发现多个 TP 呈高度表达的肿瘤细胞株对 5-FU的敏感度较高，但 Metzger 等[9]检测了 38 例结 肠直肠肿瘤标本的 TP mRNA 表达水平，发现 5-FU 对 TP mRNA高表达肿瘤患者的疗效并不理想。 造 成上述差异的原因可能包括：mRNA 高表达并未直 接转化为蛋白质水平的高表达、细胞株的结果难以 反映人体内的代谢、5-FU 激活通路并非仅限于 TP 酶。 更为重要的是，TP酶在结构上与血小板衍生内 皮细胞生长因子 （platelet-derived endothelial cell growth factor，PD-ECGF）属同一物质，而后者为促 进血管生成的重要细胞因子， 故 TP 高表达作为提 示肿瘤恶性程度指标的意义， 可能大于其作为 5-FU 疗效预测因子的意义。 与 5-FU不同，卡培他滨作为其前体药物，在体 内经胞苷脱氨酶代谢成脱氧氟尿苷（5′-DFUR），最 后经 TP代谢为 5-FU[10]。 由于骨髓中胞苷脱氨酶和 TP 表达量低，使卡培他滨在肠黏膜、血液和骨髓中 代谢成 5-FU的量较少， 从而减轻了肠道和血液中 的毒性。 多数肿瘤细胞内 TP 酶的含量高于血浆和 正常组织，这种肿瘤内激活的药理机制使卡培他滨 在肿瘤组织内更多地代谢为 5-FU， 肿瘤组织内 5-FU 浓度为血浆和正常组织的数倍至数十倍。 因 此，TP 表达在预测卡培他滨疗效方面的意义，在一 定程度上大于其在 5-FU疗效预测中的意义。 二、TS TS 是 5-FU 发挥细胞毒作用的主要靶点，5-FU 代谢产物 FdUMP 与 TS 结合形成复合物 ， 干扰 dUMP 与 TS 结合，由此抑制胸腺嘧啶合成，导致细 胞凋亡。研究发现，在转移性结肠直肠肿瘤中 TS活 性越高，肿瘤对 5-FU 的化疗敏感性越低，而且预后 也越差。 目前，已有研究者应用亚甲基四氢叶酸钙 （leucovorin, LV）作为 5-FU 的生化调节剂，促进三 联复合物形成，增强对 TS抑制来提高 5-FU疗效。 调控 TS 表达的编码基因 TYMS 增强子区 （TYMS enhancer region，TSER） 的基因转录起始点 上游，可发生 28 bp 的核苷酸串联重复序列数量变 异，最常见者为二联（TSER2）及三联（TSER3）重复。 体外研究发现，具 TSER3等位基因者，TS 表达显著 升高。 Marsh 等 [11] 报告 软件系统测试报告下载sgs报告如何下载关于路面塌陷情况报告535n,sgs报告怎么下载竣工报告下载 ，具有 TSER3/TSER3 纯合 型的结肠直肠肿瘤患者， 对 5-FU 的敏感度低于 TSER2/TSER3 杂合型及 TSER2/TSER2 纯合型者。 值得关注的是， 原发灶 TS 表达水平并不能准确预 测转移性结肠直肠肿瘤患者对 5-FU 治疗的敏感 性。 其原因可能是原发灶的 TS 高表达不意味着转 移灶中 TS亦呈高表达状态。为评估 TS作为预后判 断标志物和 5-FU 疗效预测标志物的价值，Johnston 等 [12]曾在 Duke B 及 Duke C 期结肠直肠肿瘤患者 中开展过一项组间分析，结果提示，TS 作为评估Ⅲ 期结肠直肠肿瘤患者总体生存期的预后判断标志 物具有一定价值， 但不能作为 5-FU 辅助治疗的疗 效预测标志物。 三、DPD DPD 是 5-FU分解过程中的关键酶， 其活性直 接决定了 5-FU 进入合成代谢和产生核苷酸类似物 的量。 药代学研究显示，DPD 活性降低可导致 5-FU 体内清除受阻，半减期显著延长，分解减弱而合成 增加，细胞毒性也相应增强。已有研究证实，DPD 活 性直接决定了 5-FU的抗肿瘤效应。 故 DPD 酶抑制 剂应运而生，该领域的代表药物为替吉奥（S1）。 S1 秉承了优福定（tegafur 加 uracil）的复方药物模式， 由 5-FU的前体药物替加氟、 化学修饰剂吉莫斯特 （CDHD）及奥替拉西 3种成分组成。其中，CDHD 能 够抑制肝脏 DPD 的活性，阻止 5-FU 降解，使 5-FU 在血浆和组织中的浓度得以维持更长时间。 奥替 拉西能抑制肠道黏膜细胞内乳清酸磷酸核糖转移 酶（OPRT），阻断 5-FU磷酸化，减少胃肠道副作用[13]。 尽管添加 DPD 抑制剂可保持体内较高浓度的 5-FU 不被降解，但难以保持其在肿瘤区域内高浓度。 此 外，其还可因全身 DPD 抑制而导致不良反应增多， 同时由于东西方人种和不同个体药物代谢酶差异 等造成治疗窗狭窄等诸多问题发生。故其确切疗效 尚有待进一步证实。 鉴于迄今为止，所有临床试验 均未按照 5-FU 相关酶类的蛋白表达或基因多态性 进行随机分组，这可能也是导致氟尿嘧啶类药物在 不同研究中结果不一致甚至相左的原因。 四、微卫星不稳定性（microsatellite instability, MSI） MSI与结肠癌辅助化疗的疗效也相关。 最新结 果显示， 存在 MSI 的结肠癌患者比不存在 MSI 者 更有生存优势[风险比(HR)：0.67]，但此类人群接受 5-FU 辅助化疗后并未显示明显的生存优势（HR： 1.23)。 回顾性研究结果提示，存在 MSI 的结肠癌患 者可能预后相对较好,但同时对 5-FU 耐药，错配修 复蛋白缺失 （deficiency of mismatch repair protein, dMMR）状态与 MSI相关。 Sargent等[14]检测了 341例 22· · 诊断学理论与实践 2009 年第 8 卷第 1 期 行以 5-FU 为基础的术后辅助化疗 [包括 NCCTG 研究（135 例）、GIVIO 研究（183 例）和 ECOG 研究 (23 例)等]的Ⅱ和Ⅲ期结肠癌患者，发现 47 例存在 dMMR（其中 20 例未接受术后辅助化疗，27 例接受 术后辅助化疗）。 对于 dMMR 患者，术后辅助化疗 有提示明显的生存益处，总体生存期（HR：0.69,P= 0.047）及无进展生存期 （HR： 0.59,P＝0.004）均提 高。 然而，对于存在 dMMR 的患者，接受以 5-FU为 基础的辅助化疗者与未接受者相比， 并未显示出有 生存优势，总体生存期（HR 1.26,P=0.68）及无进展生 存期（HR 1.41，P＝0.53）均无提高。鉴于此，可根据结 肠直肠肿瘤患者的 dMMR 状态来选择个体化的术 后辅助化疗方案。 对于Ⅱ期结肠直肠肿瘤患者而 言 ，dMMR 可能是良好的预后预测因子和预测 5-FU 疗效的因子，以 5-FU 为基础的术后辅助化疗 药物对存在 dMMR 的患者无效,故有必要对这部分 患者先行 MMR 状态筛选，以免不必要的治疗。 伊立替康与 UGT1A1基因多态性 伊立替康问世于 20 世纪 90 年代后期，属喜树 碱半人工合成物 ， 其进入体内可经羧酸酯酶 (carboxylesterases)转化为 SN-38，后者为拓扑异构酶 Ⅰ抑制剂， 可抑制 DNA 单链断裂后修复， 干扰 DNA复制和转录，导致肿瘤细胞死亡。 数项Ⅲ期随 机临床研究表明，与最佳支持治疗或 5-FU 联合 LV 相比， 该药物作为一线或 5-FU 治疗失败后的二线 治疗， 均可显著延长晚期结肠直肠癌患者的生存 期，且无论是与 5-FU 加 LV 静脉推注（IFL 方案）， 还是与静脉持续滴注方案（FOLFIRI 方案）联合应 用，均显示出较好临床疗效及生存优势，其剂量限 制性毒性主要为迟发性腹泻和中性粒细胞减少。 尿苷二磷酸葡醛酸转移酶家族 (uridine diphos- phate glucuronosyl transferases,UGTs)是伊立替康的 重要解毒酶。特别是肝内的 UGT1A1可将伊立替康 主要活性产物 SN-38 灭活为葡萄糖醛酸产物 (SN- 38G)，然后经胆汁排泄入肠。 在肠道细菌的 β-葡萄 糖醛酸酶作用下 SN-38G又转换为 SN-38，引发肠黏 膜损伤及迟发性腹泻。 肠道内的 UGT1A1可再度催 化 SN-38为 SN-38G解毒。 因此 UGT1A1 的遗传多 态性及酶活性与伊立替康的疗效及不良反应均密切 相关[15,16] 目前研究较多的是 UGT1A1 启动子区的 TA 重复序列变异(UGT1A1*28)，即 UGT1A1 启动子区 域包括 6 个或 7 个 TA 重复序列。 具有 7 个 TA 重 复序列的个体 (TA)7/(TA)7，发生腹泻等不良反应较 具有 6 个 TA 重复序列者(TA)6/(TA)6或杂合子(TA)7/ (TA)6者更多。 Innocenti 等[17]予 66 例实体瘤及淋巴 瘤患者伊立替康 350 mg/m2 单药化疗， 每 3 周 1 次， 在 6 例出现Ⅳ度白细胞下降的患者中，3 例为 UGT1A1 (TA)7/(TA)7纯合型，另 3 例为(TA)7/(TA)6杂 合型。 而 3 例发生Ⅳ度迟发性腹泻的患者中，1 例 为 (TA)7/(TA)7，2 例为 (TA)7/(TA)6，而 (TA)6/(TA)6 纯合 型无 1 例出现Ⅳ度不良反应。 该研究还发现，与 (TA)7连锁的－3 156 G→A置换及总胆红素水平高低 也可预测伊立替康不良反应。 因而指出， 对存在 UGT1A1*28 变异或－3 156 G→A 突变，或治疗前总 胆红素水平偏高的患者，伊立替康应予减量。 Ando 等检测了 118 例接受以伊立替康为基础的化疗的 结直肠患者 UGT1A1 基因多态性， 其中 26 例出现 Ⅲ～Ⅳ度腹泻或血液学毒性。多因素分析结果显示， UGT1A1*28 无论是 (TA)7/(TA)7 纯合型还是 (TA)7/ (TA)6杂合型， 均是发生重度伊立替康相关毒性的 危险因子[（P < 0.001）、（OR：7.23）、（95%CI： 2.52～ 22.3）]。 FDA 已批准在伊立替康说明书中增加 UGT1A1 检测内容，对 UGT1A1 基因异常者，应予 药物减量。 此外，其他与伊立替康相关的 UGT基因多态性 位点还包括启动子区-3 279 T→G(UGT1A1*60)、第 1 外显子区 211 G→A(UGT1A1*6)、UGT1A7(UGT1A7* 2/*2及 UGT1A7*3/*3)和 UGT1A9 (UGT1A9*1b)等。 展 望 在结肠直肠肿瘤的另一个靶向治疗药物——— 血管内皮生长因子（VEGF）的中和性抗体贝伐单抗 （bevacizumab, BV）领域，迄今未发现明确的疗效 预测标志物。 Dowlati 等 [18]在针对非小细胞肺癌的 E4599 研究中发现，基线血清 VEGF 水平可能与接 受 BV 治疗患者总生存期相关。 亦有学者报道，在 接受 BV 和低剂量环磷酰胺治疗的卵巢癌患者中， IL-8 及其受体的遗传多态性可能与患者的临床反 应和无进展生存期相关。 对结肠直肠肿瘤而言，目前常用化疗和靶向治 疗药物的疗效预测标志物已在指导临床用药方面 显示了作用，如 EGFR 单抗治疗疗效与多个分子标 志物相关，对于抗肿瘤血管生成治疗的疗效预测标 志物的开发有助于临床更合理地使用抗血管生成 23· · J Diagn Concepts Pract 2009, Vol.8, No.1 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 欲订阅 2009 年《诊断学理论与实践》杂志者，可向当地邮局或直接向本刊编辑部订阅。 本刊邮发代号：4-687。 本刊欢迎来稿，欢迎订阅，欢迎批评指正。 药物。 当然，分子标志物在治疗方案制定中的确切 指导意义，尚有待于大样本的前瞻性随机对照研究 证实。 [参考文献] [1] Karapetis CS, Khambata-Ford S, Jonker DJ, et al. 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