蝴蝶兰的组织培养和遗传转化体系的研究进展

·6· 广西农业科学 2007年第38卷第1期 蝴蝶兰的组织培养和遗传转化体系的研究进展 满若君h ， 李杨瑞 ¨ ， 卜朝阳。 (1．广西大学农学院， 南宁 530004) 2．广西作物遗传改良生物技术重点实验宣， 南宁 530007I 3．广西农业科学院， 南宁 530007) 摘要：蝴蝶兰是观赏价值和经济价值很高的著名盆栽植物，用种子、茎尖、茎段、根尖、叶、花梗等外植体进行组 织培养均获得了成功。不同外植体、不同培养基和不同激素种类及配比、不同浓度的6-BA和NAA组合对蝴蝶兰原 球茎诱导率有显著影响。在兰花的转基因研究中，以基因枪法成功转化的报道最多。其次是农杆菌介导法，其它转 化方法还有PEG法、电激法，花粉管通道法等。但仍需进一步探索和完善蝴蝶兰遗传转化体系，为以后目的外源基 因的转入奠定基础，同时对于蝴蝶兰转基因技术的研究以及生物技术在兰花上的应用也具有重要的现实意义 关键词：蝴蝶兰；组织培养I遗传转化体系 中圈分类号 ：$682．31 文献标识码 ：A 文章编号；1002--8161(2007)01一OOO6一O5 Advances in tissue culture and genetic transformation system 0f Phalaen01)sis MAN Ruo—iun ，LI Yang—rui。’”，BU Zhao-yang (1．Agricultural CoHege，Guangxi University，Nanning 530004，China；2．Guangxi Crop Genetic Improvement and Biotechnology Lab。Nanning 5 30007，China；3．Gguangxi Academy of Agricultural Sciences，Nanning 530007．China) Abstract；Phalaenopsis is a famous potted plant with high ornamental and economic value，the tissue culture of Phalaenopsis have been succeeded from the explants including seed。stem apex，stem section’root tip，lea{and flower Deduncles，etc．In addition，the effects of different explants。medium，hormone type and combination，dif- ferent concentration combination of 6-BA and NAA on the inducing rate of protocorm and differentiation of callus of Phalaenopsis are significant．Among the reports on the successful genetic transformation'most of them Were about Darticle bombardment，followed by agrobacterium tumfefacients mediated procedure，and then other trans- formed methods included polyethylene glycol mediated transformation(PEG)，electroporation，pollentube pathway and SO on．But．it is still necessary to explore and perfect the genetic transformation system of Phalaenopsis to pro— vide the basis for the transformation of aiming alien gene in future，and it would have important practical signifi- cance to study the transgenic technology of Phalaenopsis and the application of biotechnology on Phalaenopsis· Key words：Phalaenopsis；tissue culture f genetic transformation system 蝴蝶兰(Pha1aenopsjs)又称蝶兰，为热带单茎性 气生兰，因其花形美丽别致、色彩艳丽、花期长，成为 当今国际、国内花卉市场上最受欢迎的花卉之一。蝴 蝶兰为兰科多年生附生草本，分布在热带及亚热带 地区，主要分布在我国的台湾省，是观赏价值和经济 价值很高的著名盆栽植物[】 ]。蝴蝶兰一般在早春开 花，且枝叶繁茂，花朵硕大，颜色艳丽，形态独特，花 期长，结构精巧、奇特，故深受广大栽培者的喜爱，是 目前室内绿化、美化的新型观赏花卉，索有“兰中皇 后”的美誉。但由于蝴蝶兰属于单茎性气生兰，再生 能力弱，很难进行分株繁殖，常规条件下种子发育不 完全，极难萌发，增殖系数很低，因此研究并利用蝴 收稿日期；2006—07-06 基金项目；广西科学基金项目(桂科回0575005) 作者简介；满若君(1981一)，女，黑龙江省哈尔滨人，在读硕士研究生，研究方向为植物分子生物学。 *为通讯作者。 维普资讯 http://www.cqvip.com 满若君等t蝴蝶兰的姐枳培养和遗传转化体系的研 究进展 ·7 蝶兰快速繁殖技术对扩大蝴蝶兰的繁殖非常必 要 。 1 国内外研究现状 目前，国内外以蝴蝶兰种子、茎尖、茎段、根尖、 叶、花梗等外植体进行组织培养有大量报道[3“]，但 转基因的报道较少。近年来市场需求对蝴蝶兰花朵 的大小、形态，花瓣的颜色、质地和植株的形态都提 出了很高的要求，尤以高品质转基因蝴蝶兰成为焦 点 建立蝴蝶兰遗传转化系统旨在通过摸索蝴蝶兰 基因转化的影响因素，找出最佳转化条件，为以后转 入目的外源基因提供依据口]。 1．1 蝴蝶兰的组织培养 原球茎(Protocorm—likebody)是兰科植物组织 培养产生的特有现象，是兰花组织培养的重要形式 之一。自1960年Morel由惠兰属的象牙色惠兰、罗 式惠兰、显花惠兰、达式惠兰等的茎尖培养获得无病 毒兰花植株以来[5]，多年来经过大量的试验与研究， 得出影响原球茎诱导的原因有：(1)不同外植体间的 诱导差异 如以叶尖、根尖、花梗芽等不同外植体来 诱导原球茎，其诱导率有所不同f即使是同一叶片， 采自不同部位的诱导率也不同。(2)不同培养基和不 同激素种类及配比的影响，从MS和KC培养基上均 能诱导出原球茎 由MS培养基诱导出的原球茎生 长迅速，有利于增殖，而KC培养基则有利于芽的分 化 供试外植体在无激素空白培养基上均未诱导出 原球茎，在其他培养基上亦存在着诱导差异。最适于 叶片培养的搭配是 MS+6一BA3．0mg／L，适于根尖 和茎尖的激素浓度是 6一BA0．5mg／L。NAA对蝴蝶 兰原球茎的产生无促进作用 (3)不同浓度的6-BA 和NAA组合对蝴蝶兰原球茎诱导率的影响。原球 茎的诱导不仅取决于6一BA和NAA的绝对数量，而 且取决于二者的相对比例。在6-BA／NAA比值最大 的条件下，诱导率处于最低状态；在 6一BA／NAA比 值最小的条件下，诱导率也接近最低。当 6-BA／ NAA比值接近lO：l时诱导率较大[引。 1．1．1 原球茎的诱导、增殖和分化 适合培养基 ①原球茎增殖：因品种不同，最适 培养基也不同。如品种P07、P08在花宝培养基上的 增殖与分化都优于MS，但PHE品种在MS培养基上 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 现较好，而在花宝培养基上表现较差[7]。曾宋君等 的 研 究 发 现，以 G3+ 6一BA 2．0mg／I +NAA 0．5mg／L时为最佳[8]。用 MS+6一BA 5．0mg／L+ NAA 0．2mg／L+活性炭 1．0g／L既能提高增殖系 数，又可以直接生根成苗，简化了培养过程[9]。改良 Vw十zg／L活性炭+100g土豆汁，也获得了较好的 效果(每月z5个／瓶)。张秀清等发现，MS更适于增 殖，而KC则更利于分化m]。②生根与壮苗：MS、KC 与G3均有较好的效果。 影响原球茎增殖、分化与壮苗的因素 ①实验 材料：不同品种或同一品种的不同部位，在原球茎诱 导的过程中，如最适合的培养基不同，对原球茎增 殖、分化与壮苗的作用也不一样。②激素：对于激素 在原球茎增殖及生根壮苗过程中的作用，目前持有 不同的见解。一种观点认为在增殖生根与壮苗阶段， 不需加任何激素[ 。另一种观点认为在增殖培养中， 6-BA与NAA的共同作用既有利于原球茎的增殖、 幼苗的分化，又有利于生根，提高瓶苗质量[8 ]。⑧碳 源：白糖、片糖比蔗糖效果好且成本低。增殖分化阶 段需糖量较低，而长根阶段需糖量较高。香蕉汁、苹 果汁、胡萝 卜汁、椰子汁等均能明显促进试管苗的生 长和根系的形成[8 ”]。④其它因子：活性炭可减少 污染，抑制Ca离子的吸收和防止褐变，从而有利于 根系的形成。多效唑(MET)对蝴蝶兰的壮苗和生根 也有明显促进作用。另外，pH值也是重要的影响因 素，需根据不同的培养基、不同的培养材料摸索适宜 的pH值。 1．1．Z 丛生芽的诱导 不经过愈伤组织直接诱导丛生芽，是蝴蝶兰的 又一快繁途径[1 。其中丛生芽的增殖及壮苗的培育 是两个关键环节 提高6 BA的浓度，丛生芽的增殖 率明显上升。椰子汁也可提高丛生芽的增殖率，适当 的光照及添加土豆汁等有机物则有利于根系的形成 和壮苗。 1．1．3 种子萌发及影响因素 兰花种子的萌发有两种方法，即共生萌发与非 共生萌发(无菌播种)。共生萌发是把真菌和兰花种 子接种在培养基上促使兰花种子萌发，这种方法对 一 些不易萌发的地生兰非常有效[1 无菌播种适于 大多数热带气生兰的种子萌发。由于蝴蝶兰具有种 子细小、数量大、容易获得等优点，通过无菌播种，可 获得较大数量的实生苗，但获得的植株与母株的基 因型不同，一般不宜进行再增殖繁殖。影响蝴蝶兰无 菌萌发的因素主要有：①基因型：不同杂交组合的亲 本基因型、亲和力不同，对种子的发芽率和生长发育 状况有很大影响[1引 ②激素：GA3、6一BA在0．5、1．0、 维普资讯 http://www.cqvip.com ·8· 广西农业科学 2007年第38卷第1期 2·0mg／L时都可诱导早期萌发，IAA 0．5mg／I 可 诱导早期萌发，并可显著促进其后的生长发育 用 NAA、2，4一D诱导不能产生实生苗n 。③添加剂：香 蕉汁对蝴蝶兰种子发芽、原球体形成及叶片的生长 具有促进作用[】引。MS培养基中蔗糖的含量为20g／ L时萌发最快，叶片和根的发育也较好 "]。④取材 时间和接种密度：在果实近成熟而尚未开裂时采摘， 有利于消毒和其后的萌发，接种时要考虑发芽的群 体效应，以达到最佳的发芽效果。⑥培养条件：温度 以22～28℃为宜。 1．2 蝴蝶兰转基因技术 1．2．1 基因枪法 基因枪法又称微弹轰击法，利用被放电或机械 加速的金属颗粒对细胞击孑L。先将外源 DNA溶液 与钨、金等金属微粒共同保温，使 DNA吸附于金属 颗粒表面，然后放电加速金属颗粒，使之直接射人受 体植物细胞，外源遗传物质随金属颗粒进入细胞内 部[】引。基因枪法作为植物遗传 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 中一个比较成熟 的技术已在许多植物上得到成功应用。 在兰花的转基因研究中，以基因枪法成功转化 的报道最多。Chia等用基因枪法将荧光素酶(Lu— ciferase)基 因转入到万带兰中，仅获得了嵌合植 株[1 。Kuehnle等人曾从微弹轰击的原球茎中获得 了 稳 定 转 化 的 石 斛 兰，轰 击 粒 子 是 由 质 粒 pGA182GG／cpPRV4包被，其中质粒包含可在植物 中表达的NPTII基因和papaya环斑病毒(PRV)外 壳蛋白(CP)基因，对来 自4个杂交种的280个原球 茎进行了轰击，经卡那霉素筛选 ，在2个杂交种中共 有13株植株表现抗生素抗性，都含有NPTII基因， 仅有1株检测到PRV CP基因[2 ，由此说明基因枪 法转化石斛兰的可行性。随后，Chia等也进行了基 因枪轰击石斛兰类原球茎的试验，从转化的石斛兰 组织中获得了再生植株[2¨，Southern杂交检测若干 转基因植株证明，目的基因已整合到石斛兰的基因 组中。Hsieh等用基因枪法将Firefly基因成功转入 到蝴蝶兰中，并获得了转基因植株L1 。Yu等对基因 枪转化的石斛兰类原球茎用 50mg／I 潮霉素筛选 4 到6个月后获得了抗性株系。GUS和Southern杂交 检测均证明了外源基因的整合与表达，为兰花转基 因建立了一个良好的转化系统[2 。 1．2．2 农杆菌介导法 农杆菌是一种革兰氏阴性土壤杆菌，能侵染植 物细胞，所含 Ti或 Ri质粒是植物天然的转化载 体，主 要 包 括 根 癌 农 杆 菌 (Agrobacteri tumefaciens，含 Ti质 粒 )和 发 根 农 杆 菌 (Agrobacterium rhizogene，含Ri质粒)。农杆菌在 附着到植物伤口组织后，通过两者之间的相互作用， 农杆菌可以形成纤维素小纤丝将其“固定”在植物细 胞壁上，同时诱导受伤的植物组织释放乙酰丁香酮 (AS)和羟基乙酰丁香酮 (HOAS)等，诱导质粒上 Vir区基因表达；Vir区基因被活化后，一些特异的 参与形成 T—DNA中间体的蛋白质得以合成，这些 蛋白质切割质粒上 T—DNA形成单链的T一链蛋白质 复合体，并协助单链的T—DNA穿过细菌细胞膜、细 菌细胞壁、植物细胞壁、植物细胞膜和核，再进一步 整合入植物基因组，从而完成植物的转化。将目的基 因插入农杆菌Ti或Ri质粒的T-DNA区，然后再通 过宿主感染受体植物就可将外源基因转入植物细 胞[ 。。 过去一直认为农杆菌介导的基因转化仅适用于 双子叶植物，农杆菌不感染单子叶植物的原因归咎 于其缺乏毒性基因——Vir基因表达的诱导物。然 而，随着载体系统和转化方法的不断改进和完善，农 杆菌介导转化水稻、玉米、小麦、石刁柏、香蕉等单子 叶植物也取得了成功 Nan等报道在单子叶植物石 斛兰属中，也存在由石斛兰的类原球茎产生的毒性 基因诱导物——松柏醇，它是 T—DNA加工和转化 途径中被激活时所必需的，从而表明了运用农杆菌 进行兰花基因转化的可行性[2 。Hsieh等将蝴蝶兰 类原球茎与农杆菌一起培养，结果表明，不同品种和 不同培养时间的类原球茎，Gus基因的表达效率不 同，在培养 lOd的“Pha1．Asian Eleganeer”原球茎中 表达效率达100 ，将表现Gus基因活性的组织接到 含有卡那霉素100mg／I 的培养基上筛选30d，获得 了转化体，检测Gus基因后表明，转化体仍具有强烈 的Gus活性，但外源基因是否整人蝴蝶兰基因组还 有待于进一步研究[ 。Blarmino等采用经悬浮培养 的细胞团与农杆菌共培养得到了蝴蝶兰再生植株， 试验表明，细胞团用附加20MAS的农杆菌侵染10h 能显著提高转化率 ，然后经共培养，潮霉素筛选 4到 6周，细胞团增殖 4周后诱导出绿色愈伤组织，再由 愈伤组织培养4周产生类原球茎，最后得到再生植 株；通过GUS检测、PCR分析和Southern杂交证明 外源基因已经成功转入，采用这种转化系统在农杆 菌感染 7个月后得到了100多株具有潮霉索抗性的 蝴蝶兰植株 。 维普资讯 http://www.cqvip.com 满若君等：蝴蝶兰的组织培养和遗传转化体系的研兜进展 ·9· 1．2．3 其它转化方法 PEG法 为外源基因导入植物原生质体最常 用的方法。它是在二价阳离子及 PEG的作用下，促 进 DNA向原生质膜沉淀，或参与细胞的内溶作用， 使DNA进入细胞。Steinhart等应用PEG介导外源 Gus基因转入到用万带兰花组织制备的原生质体 中，在带Gus基因的质粒被吸收 22h后，检测出它的 瞬时表达口 。 电激法 主要利用细胞膜在高压电脉冲条件下 会出现短暂可逆性开孔，从而为外源物质进入提供 通道，此时外源DNA、RNA、蛋白质、病毒颗粒等生 物大分子都可进入。Griesbach等使用此法，以虾脊 兰 为受体材料，导入 Gus基因并获得转基因植 株 。 花粉管通道法 利用植物开花授粉后形成的花 粉管通道，使外源 DNA 进入胚囊，转化尚不具备正 常细胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞。Hsieh等将携 带有 报告 软件系统测试报告下载sgs报告如何下载关于路面塌陷情况报告535n,sgs报告怎么下载竣工报告下载 基因的载体通过花粉管通道对蝴蝶兰进行 了成功转化口 。 2 问题与展望 虽然蝴蝶兰组织培养及快繁技术已日趋成熟， 但还存在一些问题。首先不同接种方法和培养条件、 不同培养基选择均会影响其再生力，并伴有嵌合体 产生，无法提高受体组织的再生，从而影响再生系统 的建立。其次，兰花转基因大多采用杂种胚、原球茎 或类原球茎为起始试材，由于未经过中间的愈伤组 织发生过程，往往使大多数对选择药剂有抗性的再 生材料成为嵌合体。采用多代选择的策略有可能减 少嵌合体的产生。但如何进行有效的检测以获得稳 定遗传的转基因植株仍是急需解决的问题。 有关蝴蝶兰遗传体系建立方面的报道很少，且 多采用微粒子轰炸法。目前仅见柴明良等人分别以 gus和gfP为报告基因，用农杆菌介导法获得了稳定 转化的蝴蝶兰[zs,z6]。因此仍需进一步探索和完善蝴 蝶兰遗传转化体系，以最终获得转基因蝴蝶兰组培 苗。目前研究工作的重点应包括：不同菌株对转化的 影响，相同菌株的不同浓度对转化的影响，相同浓度 的不同侵染时间对转化的影响，不同的预培养、共培 养对转化的影响以及蝴蝶兰不同部位的遗传转化差 别等。通过探索蝴蝶兰基因转化的影响因素，找出最 佳转化条件，建立高效的蝴蝶兰遗传转化系统，可以 为以后导入目的外源基因奠定基础，同时对于蝴蝶 兰转基因技术的研究以及生物技术在兰花上的应用 具有重要的理论和现实意义。 参考文献： I-1] 李建华．台湾蝴蝶兰产业发展初探与启示[J]．台湾农 业探索 ，2001(1)：15～18． [2] 李建华．台湾蝴蝶兰产业优势与现状分析[J]．海峡科 技与产业．2002．(4)：20． [3] Park S Y，Murthy H N，Pack K Y．Rapid propagation of Phalaenopsis from floral stalk——derived leaves[j"]． In Vitro Cellular ＆ Developmental Biology-Plant· 2002，(38)：168-172． [4] 刘福林，李淑萍．蝴蝶兰花梗的组织培养和植株再生 口]．商丘师范学院学报．2001，17(6)：98～99． [5] 张秀清，王志武，刘玉敬，王春英．蝴蝶兰实生苗不同器 官的离体培养[J]．植物学通报 ，1996．13(1)：50~53． [6] 王平，关海红．赵兴华，囝立萍．蝴蝶兰组织培养培养基 组成的初步研究口]．沈阳农业大学学报，2004，35(1)： 10～ 12． [7] 李晶，韩彗梅，姜晶．蝴蝶兰的组织培养[J]．中国林副 特产，1999，(2)：231． [8] 曾宋君，彭晓明，张京丽．蝴蝶兰的组织培养和快速繁 殖[J]．武汉植物学研究．2000，18(4)：344～346． [9] 张晓申，王慧瑜，杨录军．蝴蝶兰组织培养的研究[J]． 河北林果研究，ZOO5．2O(1)：48~-．49． [1o] 张秀清，王志成，王春英，刘玉敬．蝴蝶兰实生苗原球 茎诱导研究[J]-莱阳农学院学报，1995，12(1)：44～ 46． [11] Chen J T，Chang W C．Effects of tissue culture con— ditions and explant characteristics on direct somatic embryogenesis in Ocidium “Gower Ramsey”[J]． Plant Cell，Tissue and Organ Culture，2002，(69)：41— 44． [12] Park M J，Park S J，Kim D H．Effect of medium composition on phalaenopsis is micropropagation US— ing lateral buds from flower stalks[J]．Journal of the Japanese Society for Horticultural Science，1 998，68 (2)：269-274． [13] 彭立新，王妹．孟广云．蝴蝶兰组织培养繁殖的研究 [J]．天津农业科学．1999，5(2)：27～29． [14] 扬应华 ，吴小美．兰花种子萌发研究[J]．热带作物科 技，1994，(3)：32～34． [15] 魏翠华．蝴蝶兰无菌播种培养实验[J]．福建农业科 技，2000，(2)：16～17． [16] Bhattacharhee S，Khan H A，Reddy P V．Effect of growth regulating substance on in vitro seed germ{- nation of phalaenopsis hybrid[J]．Indian Agrleultur— 维普资讯 http://www.cqvip.com ‘ 1O- 广西农业科学 2007年I‘38掌|‘l期 更正：《广西农业科学》20o6年第6期 日次和第648页中，“满若军’’改为“满若君”；第723页图l中有误，改为 下图。特此更正1 120 图I 隧道式中拱棚框架图 绳子固定 竹条 维普资讯 http://www.cqvip.com