蛋白浓度测定（BCA法）

普利莱基因技术有限公司 www.applygen.com 电话：010-82335909, 82805916 Email: sale@applygen.com P1511：蛋白质定量试剂盒 (BCA法) 使用说明 描述：Bicinchoninic acid (BCA )法是近来广为应用的蛋白定量 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 。其原理与Lowery法蛋白定量相似，即 在碱性环境下蛋白质与Cu2+络合并将Cu2+还原成Cu1+。BCA与Cu1+结合形成稳定的紫蓝色复合物，在562 nM处有高的光吸收值并与蛋白质浓度成正比，据此可测定蛋白质浓度。与Lowery法相比，BCA蛋白测定 方法灵敏度高，操作简单，试剂及其形成的颜色复合物稳定性俱佳，并且受干扰物质影响小。与Bradford 法相比，BCA法的显著优点是不受去垢剂的影响。 组成与储存：(1) BCA Reagent 100 ml，室温保存；(2) Cu Reagent 2.5 ml，室温保存；(3) BSA standard 4 mg/ml 1 ml，-20ºC冻存。1年内有效。可进行 500次微板(microplate)测定或 50次 2ml比色杯测定。 所需设备：光密度测定仪（比色计或酶标仪、微板比色仪），工作波长 565 nm或在 520-600 nm之间。 工作溶液(Working Reagent, WR)配制：将 50体积试剂 BCA Reagent与 1体积 Cu Reagent混合后即为 标准工作试剂，呈嫩绿色。此WR工作溶液在室温稳定，1周内使用不明显影响测定精度。 标准蛋白溶液配制：用双蒸水、0.9%生理盐水、PBS、或用待蛋白样品之缓冲液进行倍比稀释: 100 µl 4000 µg/ml BSA + 100 µl稀释溶液(H2O/PBS/0.9%NaCl) = 200 µl (BSA=2000 µg/ml)，取 100 µl连续倍比稀释 7次，得到 BSA标准溶液 2000、1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625 µg/ml。 蛋白测定 蛋白质浓度线性检测范围为 10-2000 µg/ml。标准测定用 1 cm光程玻璃或塑料比色皿，反应终体积 2 ml， 用比色计测定。微板测定用 96孔板，反应终体积 200 µl，用酶标仪、微板比色仪测定。 1. 标准测定：将 0.1 ml标准品或待测样本与 2 ml WR工作溶液混合。微板测定：将 25 µl标准品或待测 样本与 200 µl WR工作溶液混合。 2. 用下述条件之一反应：60ºC 15-30 min；或 37ºC 30 min (常用)；或在 25ºC室温 2小时至过夜。 3. 将反应管温度冷却至室温。测定562 nm光密度(OD)值，绘制标准曲线并计算蛋白浓度。 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 1 标准测定和微板测定 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 的加样量和比例 微板(microplate)测定方案 标准比色杯测定方案 孔数 蛋白浓度 (µg/ml) 标准或待测蛋白体 积 (µl) WR工作试剂(µl) 标准或待测蛋 白体积 (ml) WR工作试剂 (ml) 1 0 25 200 0.1 2 2 15.625 25 200 0.1 2 3 31.25 25 200 0.1 2 4 62.5 25 200 0.1 2 5 125 25 200 0.1 2 6 250 25 200 0.1 2 7 500 25 200 0.1 2 8 1000 25 200 0.1 2 9 2000 25 200 0.1 2 10 待测样品 25 200 0.1 2 注意事项 1. 蛋白质与WR工作溶液反应形成的颜色复合物，在 60ºC 15-30 min或 25ºC室温反应过夜时稳定性佳。 在 37ºC 30 min或 25ºC室温反应 2小时，严格来讲形成的颜色复合物尚未达到终点，通常每 10 min OD562值升高约 2.3%。然而，在这一时间内通常可以测定约 30管，测定精度不受明显影响。 2. BCA法蛋白质浓度检测范围为 10-2000 µg/ml。检测 0.5~10 µg/ml微量蛋白时应采用浓缩试剂，并需 Applygen Technologies Inc. Beijing, China DocRev 51117 Page 1 of 2 普利莱基因技术有限公司 www.applygen.com 电话：010-82335909, 82805916 Email: sale@applygen.com 要在 60ºC反应。或者采用 Bradford法蛋白质定量试剂盒(# P1510)。 3. BCA法在样品含有脂类物质时将明显提高光吸收值。蛋白样品中 EDTA或葡萄糖浓度大于 10 mM不 能使用 BCA方法。此时可以采用 Lowery法，或 Bradford法蛋白质定量试剂盒(# P1510)。 4. 蛋白质样品经液体样品蛋白抽提试剂(#P1255)沉淀后，可去除任何能干扰 BCA法测定的物质。 5. 每次测定应该制备单独的标准曲线。 Table 2. Incompatible Substances / Amount Compatible (From top to bottom) Buffer Systems Sodium phosphate 25 mM Bicine, pH 8.4 20 mM Sucrose 40% Bis-Tris, pH 6.5 33 mM Sodium ortho-Vanadate in PBS, pH 7.2, 1 mM Calcium chloride in TBS, pH 7.2 10 mM Urea 3 M CHES, pH 9.0 100 mM Chelating agents Cobalt chloride in TBS, pH 7.2 0.8 M EDTA 10 mM Ferric chloride in TBS, pH 7.2 10 mM EGTA,any level, not compatible HEPES 100 mM Sodium citrate 200 mM MOPS, pH 7.2 100 mM Detergents Nickel chloride in TBS 10 mM Brij-35 5% PBS; no interference Brij-52 1% NaCl (0.15 M), pH 7.2, no interference CHAPS 5% PIPES, pH 6.8 100 mM CHAPSO 5% Sodium acetate, pH 4.8 200 mM Deoxycholic acid 5% Sodium citrate, pH 4.8 or pH 6.4 200 mM Nonidet P-40 (Igepal CA-630) 5% Tricine, pH 8.0 25 mM SDS 5% Triethanolamine, pH 7.8 25 mM Span 20 1% Tris 250 mM Triton X-100 5% TBS buffer, no interference Triton X-114 1% 1 x SDS-PAGE loading buffer, no interference Tween-20 5% Zinc chloride (10 mM) in TBS, pH 7.2, 10 mM Tween-60 5% Buffer Additives Tween-80 5% Ammonium sulfate 1.5 mM Zwittergents 1% Aprotinin 10 mg/L Reducing & Thiol Containing Agents Glucose 10 mM Dithioerythritol (DTE) 1 mM Glycerol 10% Dithiothreitol (DTT) 1 mM Guanidine•HCl 4 M 2-Mercaptoethanol 1 mM HCl 100 mM Tributyl Phosphine 0.01% Imidazole 50 mM Solvents Leupeptin 10 mg/L Acetone 10% PMSF 1 mM Acetonitrile 10% Sodium azide 0.20% DMF 10% Sodium bicarbonate 100 mM DMSO 10% Sodium chloride 1 M Ethanol 10% Sodium hydroxide 100 mM Methanol 10% 参考文献：Smith, P.K. et al, Anal. Biochem., 150, 76-85 (1985). Applygen Technologies Inc. Beijing, China DocRev 51117 Page 2 of 2