下载

1下载券

加入VIP
  • 专属下载特权
  • 现金文档折扣购买
  • VIP免费专区
  • 千万文档免费下载

上传资料

关闭

关闭

关闭

封号提示

内容

首页 H2株甲肝病毒经KMB17细胞培养的毒力及核苷酸序列

H2株甲肝病毒经KMB17细胞培养的毒力及核苷酸序列.pdf

H2株甲肝病毒经KMB17细胞培养的毒力及核苷酸序列

君临天下
2011-02-10 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《H2株甲肝病毒经KMB17细胞培养的毒力及核苷酸序列pdf》,可适用于自然科学领域

H株甲肝病毒经KMB细胞培养的毒力及核苷酸序列Ξ黄小琴 杨净思 周德久 白惠珠 曹逸云 董德祥ΞΞ(中国医学科学院 中国协和医科大学 医学生物学研究所,昆明)【摘 要】 目的 监测H株甲肝病毒经人胚肺二倍体细胞KMB培养的毒力减毒水平及核苷酸序列。方法H株甲肝减毒活疫苗HMK(K)用KMB细胞增殖,分别在℃和℃连续传代后,抽查不同代次病毒的普通狨猴接种反应和核苷酸片段序列。结果 HKMB系统在℃培育代次过程中,病毒的抗原滴度和感染性滴度稳定,在℃的滴度明显低下,经代次仍未达亲本水平。K(℃,代)和K(℃,代)病毒经普通狨猴接种反应证实为减毒性质。核苷酸两片段共个碱基的序列分析显示,K和K与K的同源性高达~。结论 K疫苗病毒在KMB细胞培养经℃和℃连续传代,无毒力回升和遗传稳定性改变。【关键词】 甲肝病毒 细胞培养 毒力 核苷酸序列VirulenceandNucleotideSequencesofHAV(HStrain)CulturedinKMBCellHuangXiaoqin,YangJingsi,ZhouDejiuetal(InstituteofMedicalBiology,ChineseAcademyofMedicalSciences,PekingUnionMedicalCollege,Kunming)【Abstract】Objective TodetectthevirulenceattenuationlevelandnucleotidesequencesofHAV(Hstrain)culturedinhumanfetallungdiploidcellKMBMethods LiveattenuatedHAvaccinevirusHMK(K)wasproliferatedinKMBcellsandpassagedatand℃,thentheimmuneresponsesofdifferentpassagesincommonmarmosetswereobserved,andthenucleotidesequencesofthemwereanalyzedResults TheantigenicandinfectioustitersofHAVwerestableduringcultureat℃forpassagesHowever,thetitersdecreasedsignificantlyat℃andwerestilllowerthanthoseofparentvirusafterpassagesK(℃,passages)andK(℃,passages)wereprovedtobeattenuatedbymarmosetexperimentThenucleotidesequencingoffragmentsconsistingofbasesshowedthatofKandKwerehomologoustoKConclusion NovirulencereversionwasobservedintheKvirusculturedinKMBcellatand℃,andthehereditarystabilityofithasnotchanged【Keywords】 HepatitisAvirus Cellculture Virulence Nucleotidesequence  甲肝减毒活疫苗与其他活疫苗一样,存在减毒毒力水平和遗传稳定性问题。黄小琴等曾对H株甲肝减毒活疫苗病毒在普通狨猴体内进行传代研究,证实该疫苗株在易感机体中传代次仍保持减毒特性。本文报道H株疫苗病毒在体外系统KMB细胞上传代的毒力监测结果。材料与方法病毒和细胞HMK由浙江省医学科学院毛江森教授提供,经本所用KMB细胞于℃条件下传代次,获得HMK(K)甲肝活疫苗病毒。KMB为本所建立的人胚肺二倍体细胞株,已被接纳为生物制品可用细胞基质,也是目前用于生产H株甲肝疫苗的细胞。本实验采用~PD(群体分裂次数)的细胞。HAV传代仿本所生产H株甲肝活疫苗操作细则进行传代:K病毒按~MOI与浓集的KMB细胞悬液于℃悬浮吸附min(本所专利,专利号:ZL··中国生物制品学杂志年第卷第期 ChinJBiologicals,VoNoΞΞΞ课题负责人。美国中华医学基金会(CMB)资助课题,编号。©ChinaAcademicJournalElectronicPublishingHouseAllrightsreservedhttp:wwwcnkinet),补足培养液后接种至cm转瓶,置℃旋转培养,d收获感染细胞。感染细胞经反复冻融超声,破碎率达以上时,用于继续传代。同时设置℃感染细胞组和正常细胞对照组。猴体试验选用成年普通狨猴(天津医科大学提供,该品系狨猴是甲肝病毒易感动物模型),雄雌,体重~g。不同代次病毒液ml经静脉接种普通狨猴~只。接种后~、、、w检测血清抗HAV和肝脏酶活性,用细胞培养EIA分离测定~d粪便HAV。、、、、w作肝穿刺及~m尸检,常规切片,HE染色检查肝组织病理学,按Krawczynski分度指标判定结果。滴度测定倍系列稀释不同代次的病毒液,用EIA法检测其抗原滴度。病毒原液作倍系列稀释,用KMB细胞滴定其感染性滴度,每稀释度接种cm细胞瓶,℃培养d后收毒,用EIA法检测HAV,ReedMuench法计算感染性滴度。核苷酸序列分析此项工作在日本国立卫生研究院户冢敦子博士实验室及指导下完成。按文献方法提取病毒RNA,通过RTPCR获得cDNA片段,再经PCR扩增后纯化,型全自动测序仪(ABI)进行序列测定,Maxtrigene软件分析序列。用于PCR的引物为:()~:’GTCCCTCTTGGAAGTCCATG’和()~:’GAGTAGGTCACCTACGTAAC’,()~:’GCTGTAGGAGTCTAAATTGGGGAC’和()~:’ATAGGAGTACCAAACAATTTAAC’,()~:’GGAGAATCCAGACATACATC’和()~:’GTACTTTATTACTTCAAAAGGACC’,()~:’GCAAATTACAATCATTCTGATGA’和()~:’CTTCACACACCTGAGAACTTTACC’。结  果抗原滴度和感染性滴度疫苗病毒K在KMB细胞中传代,℃连续次至K,℃连续次至K。疫苗病毒在℃KMB细胞中的抗原滴度始终稳定在EU左右,在℃的抗原滴度自K的EU逐渐递增为K的EU,均低于℃的结果,见图。K,K、K和K的感染性滴度与抗原滴度吻合,见表。显示℃的病毒感染性滴度稳定且明显高于℃(∶logCCIDml),与H株长期适应于℃增殖有关。图 疫苗病毒在℃和℃KMB细胞培养的抗原滴度FigAntigenictitersofvaccinevirusesculturedinKMBcellsat℃and℃表 H株不同代次病毒的感染性滴度TableInfectioustitersofdifferentpassagesofHvirusTemperatureIncubationtimeInfetioustiterPassage(℃)(d)(logCCIDml)KKKK毒力减毒水平K、K及K病毒的猴体试验结果,只普通狨猴对个不同代次病毒的接种反应相似,抗HAVGMT~,肝脏酶活性偶见升高,粪便排毒以及肝脏无实质性组织病理改变,见表。证实了疫苗病毒在KMB细胞长期传代过程中减毒性能稳定,是否进一步减毒值得探讨。表 普通狨猴对不同代次病毒的接种反应TableResponsesofdifferentpassagesofviruseincommonmaromset AntiHAVconversion     Elevation    FecalLiverPassageAnimalTime(w)GMT(w)ALTASTICDsheddinghistopathologyK  ND(±)K()K()··中国生物制品学杂志年第卷第期 ChinJBiologicals,VoNo©ChinaAcademicJournalElectronicPublishingHouseAllrightsreservedhttp:wwwcnkinet  核苷酸片段的序列对K、K、K的两个片段共个碱基的分析,后二者与其亲本间的同源性高达~,共检出个核苷酸差异,其中个发生在’非编码区,其余个在编码区,其中位核苷酸引起编码氨基酸由丙氨酸替换为丝氨酸,见表。表 K、K和亲代病毒间的核苷酸比较TableNucleotidesequencesofK,Kandtheirparentvirus   Homology                    Sitesofnucleotidedifference          KCTTAGCGAGAKTTAGCGGTAKAATAAAGTG讨  论病毒疫苗的质量取决于生产环节的各种因素,包括细胞培养的可靠性和病毒在细胞培养过程中的毒力稳定性。本研究结果证明HKMB是一个稳定的疫苗生产系统。经系统传代次(℃),疫苗病毒的抗原滴度和感染性滴度不变,其减毒性质稳定,无回升迹象。本研究结果与Provost等用CR株在FRHK和MRC连续传代后再接种狨猴和黑猩猩的结果类似。K和K两个核苷酸片段的序列与其亲本K的同源性达~,证明疫苗病毒在细胞培养增殖中的遗传稳定性良好。与K病毒相比,K具有更多的突变部位,其中多数位于’端非编码区。Cohen等认为’端较小范围(~)的核苷酸变动与组织培养适应性有关,P~P区的突变与减毒有关。Funkhouser等的研究表明与细胞培养适应性相关的核苷酸突变有位于’端非编码区。作者检出K独特的个突变核苷酸中,个位于’端非编码区,认为与细胞培养适应性有关。结合猴体试验结果,某些突变是否提示进一步减毒可能值得思考和研究。黄雪卿等曾报道用KMB细胞在℃试制的K疫苗具有与常规疫苗可比的安全性和免疫原性。本实验室也进行过该批疫苗的人体接种观察,取得相同结果。本文K的猴体试验和测序结果提示,疫苗病毒在℃增殖,有保持减毒和遗传稳定性的可能。甲肝减毒活疫苗是一个新制品,有很多问题有待研究探索。为了在较长时期内控制甲肝暴发流行,尚需大量优质疫苗。因此,值得进一步研究并改进与疫苗质量和产量有关的生产条件。参考文献 黄小琴,练幼辉,王庆玲,等甲型肝炎减毒活疫苗H株在狨猴体内传代的试验中华预防医学杂志,,(): 毛江森,曹逸云,谢汝英,等甲型肝炎减毒活疫苗的研究不同毒力毒株的猴体试验中国科学B辑,,: 郭仁,曹逸云,戴振洲,等人二倍体细胞株KMB的特性中国医学科学院学报,,(): 练幼辉,曹逸云,黄小琴,等甲型肝炎病毒动物模型研究现代预防医学,,(): KrawczynskiKK,BradleyKW,MurphyBY,etalPathogeneticaspectsofhepatitisAvirusinfecgtioninenterallyinoculatedmarmosetsAmJClinPathol,: 萨姆布鲁克,等分子克隆实验指南,科学出版社,, ProvostPJ,BishopRP,GeretyRJ,etalNewfindinginlive,attenuatedhepatitisAvaccinedevelopmentJMedVirol,,: 周德久,曹逸云,黄小琴,等H株甲肝减活疫毒K的核苷酸全序列分析云南大学学报,,(): CohenJI,RosenblumB,FeinstoneSM,etalAttenuationandcellcultureadaptationofhepatitisAvirus(HAV):ageneticanalysiswithHAVcDNAJVirol,,(): FunkhouserAW,PurcellRH,D’hondtE,etalAttenuatedhepatitisAvirus:geneticdeterminantsofadaptationtogrowthinMRCcellsJVirol,,(): 黄雪卿,张华远,邢玉兰,等HAVH株不同代次减毒活疫苗的史疫应答和接种反应中国公共卫生学报,,():(收稿,修回)··中国生物制品学杂志年第卷第期 ChinJBiologicals,VoNo©ChinaAcademicJournalElectronicPublishingHouseAllrightsreservedhttp:wwwcnkinet

用户评价(0)

关闭

新课改视野下建构高中语文教学实验成果报告(32KB)

抱歉,积分不足下载失败,请稍后再试!

提示

试读已结束,如需要继续阅读或者下载,敬请购买!

文档小程序码

使用微信“扫一扫”扫码寻找文档

1

打开微信

2

扫描小程序码

3

发布寻找信息

4

等待寻找结果

我知道了
评分:

/3

H2株甲肝病毒经KMB17细胞培养的毒力及核苷酸序列

VIP

在线
客服

免费
邮箱

爱问共享资料服务号

扫描关注领取更多福利