H2株甲肝病毒经KMB17细胞培养的毒力及核苷酸序列

H2 株甲肝病毒经 KMB17 细胞培养的毒力及核苷酸序列 Ξ 黄小琴 　杨净思 　周德久 　白惠珠 　曹逸云 　董德祥ΞΞ (中国医学科学院 　中国协和医科大学 　医学生物 学研究所 ,昆明 650118) 【摘 　要】　目的 　监测 H2 株甲肝病毒经人胚肺二倍体细胞 KMB17 培养的毒力/ 减毒水平及核苷酸序列。 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 H2 株甲肝减毒活疫苗 H2M20K7( K7)用 KMB17 细胞增殖 ,分别在 35 ℃和 37 ℃连续传代后 ,抽查不同代次病毒的普通狨 猴接种反应和核苷酸片段序列。结果　H22KMB17 系统在 35 ℃培育 16 代次过程中 ,病毒的抗原滴度和感染性滴度稳 定 ,在 37 ℃的滴度明显低下 ,经 13 代次仍未达亲本水平。K18 (35 ℃,11 代)和 K15 (37 ℃,8 代)病毒经普通狨猴接种反 应证实为减毒性质。核苷酸两片段共 1897 个碱基的序列分析显示 ,K18 和 K15 与 K7 的同源性高达 9913 %～100 %。 结论　K7 疫苗病毒在 KMB17 细胞培养经 35 ℃和 37 ℃连续传代 ,无毒力回升和遗传稳定性改变。 【关键词】　甲肝病毒 　细胞培养 　毒力 　核苷酸序列 Virulence and Nucleotide Sequences of HAV ( H2 Strain ) Cultured in KMB17 Cell Huang Xiaoqin , Yang Jingsi , Zhou Dejiu et al ( Institute of Medical Biology , Chinese Academy of Medical Sci2 ences , Peking Union Medical College , Kunming 650118) 【Abstract】Objective 　To detect the virulence/ attenuation level and nucleotide sequences of HAV( H2 strain) cultured in human fetal lung diploid cell KMB17. Methods 　Live attenuated HA vaccine virus H2M20K7 ( K7) was proliferated in KMB17 cells and passaged at 35 and 37 ℃, then the immune responses of different passages in common marmosets were observed , and the nucleotide sequences of them were analyzed. Results 　The antigenic and infectious titers of HAV were stable during culture at 35 ℃for 16 passages. How2 ever , the titers decreased significantly at 37 ℃and were still lower than those of parent virus after 13 passages. K18 (35 ℃, 11 passages) and K15 (37 ℃, 8 passages) were proved to be attenuated by marmoset experiment . The nucleotide sequencing of 2 fragments consisting of 1897 bases showed that 99. 3 % - 100 % of K18 and K15 were homologous to K7. Conclusion 　No virulence reversion was observed in the K7 virus cultured in KMB17 cell at 35 and 37 ℃, and the hereditary stability of it has not changed. 【Key words】　Hepatitis A virus 　Cell culture 　Virulence 　Nucleotide sequence 　　甲肝减毒活疫苗与其他活疫苗一样 ,存在减毒/ 毒力水平和遗传稳定性问题。黄小琴等[1 ]曾对 H2 株甲肝减毒活疫苗病毒在普通狨猴体内进行传代研 究 ,证实该疫苗株在易感机体中传代 3 次仍保持减 毒特性。本文报道 H2 株疫苗病毒在体外系统 KMB17 细胞上传代的毒力监测结果。 材料与方法 11 病毒和细胞 H2M20K5[2 ]由浙江省医学科学院毛江森教授提 供 ,经本所用 KMB17 细胞于 35 ℃条件下传代 2 次 , 获得 H2M20K7 ( K7) 甲肝活疫苗病毒。KMB17[3 ]为 本所建立的人胚肺二倍体细胞株 ,已被接纳为生物 制品可用细胞基质 ,也是目前用于生产 H2 株甲肝 疫苗的细胞。本实验采用 22～38PD (群体分裂次 数)的细胞。 21 HAV传代 仿本所生产 H2 株甲肝活疫苗操作细则进行传 代 : K7 病毒按 015～110MOI 与浓集的 KMB17 细胞 悬液于 37 ℃悬浮吸附 30min (本所专利 ,专利号 : ZL ·331·中国生物制品学杂志 2000 年第 13 卷第 3 期　Chin J Biologicals 2000 ,Vo1. 13. No. 3 ΞΞΞ 课题负责人。美国中华医学基金会 (CMB)资助课题 ,编号 932582。 © 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 94 1 0125713) ,补足培养液后接种至 680cm2 转瓶 ,置 35 ℃旋转培养 ,26d 收获感染细胞。感染细胞经反 复冻融超声 ,破碎率达 95 %以上时 ,用于继续传代。 同时设置 37 ℃感染细胞组和正常细胞对照组。 31 猴体试验 选用成年普通狨猴 (天津医科大学提供 ,该品系 狨猴是甲肝病毒易感动物模型[4 ] ) ,6 雄 2 雌 ,体重 250～350g。不同代次病毒液 1ml 经静脉接种普通 狨猴 2～4 只。接种后 1～6、8、10、12w 检测血清抗2 HAV 和肝脏酶活性 ,用细胞培养/ EIA 分离测定 7～ 30d 粪便 HAV。0、4、6、8、10w 作肝穿刺及 3～4m 尸 检 ,常规切片 , H —E 染色检查肝组织病理学 ,按 Krawczynski 分度指标[5 ]判定结果。 41 滴度测定 2 倍系列稀释不同代次的病毒液 ,用 EIA 法检 测其抗原滴度。病毒原液作 10 倍系列稀释 ,用 KMB17 细胞滴定其感染性滴度 , 每稀释度接种 25cm2 细胞 4 瓶 ,35 ℃培养 28d 后收毒 ,用 EIA 法检 测 HAV ,Reed2Muench 法计算感染性滴度。 51 核苷酸序列分析 此项工作在日本国立卫生研究院户冢敦子博士 实验室及指导下完成。按文献方法[6 ] 提取病毒 RNA ,通过 RT2PCR 获得 cDNA 片段 ,再经 PCR 扩增 后纯化 ,377 型全自动测序仪 (ABI) 进行序列测定 , Maxtrigene 软件分析序列。用于 PCR 的引物为 : ( + ) 30～49 :5’GTCCCTCTTGGAAGTCCATG 3’和 ( - ) 516 ～535 :5’GAGTAGGTCACCTACGTAAC 3’, ( + ) 300～ 323 :5’GCTGTAGGAGTCTAAATTGGGGAC 3’和 ( - ) 1233～1255 : 5’ATAGGAGTACCAAACAATTTAAC 3’, ( + ) 2427～2446 : 5’GGAGAATCCAGACATACATC 3’ 和 ( - ) 3273 ～ 3296 : 5 ’ GTACTTTAT2 TACTTCAAAAGGACC 3 ’, ( + ) 2907 ～ 2929 : 5 ’ GCAAATTACAATCATTCTGATGA 3’和 ( - ) 3358 ～ 3381 :5’CTTCACACACCTGAGAACTTTACC 3’。 结 　　果 11 抗原滴度和感染性滴度 疫苗病毒 K7 在 KMB17 细胞中传代 ,35 ℃连续 16次至 K23 ,37 ℃连续 13 次至 K20。疫苗病毒在 35 ℃KMB17 细胞中的抗原滴度始终稳定在 1024EU 左右 ,在 37 ℃的抗原滴度自 K8 的 8EU 逐渐递增为 K20 的 256EU ,均低于 35 ℃的结果 ,见图 1。K7 , K12、K15 和 K18 的感染性滴度与抗原滴度吻合 ,见 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 1。显示 35 ℃的病毒感染性滴度稳定且明显高于 37 ℃(815∶6177 logCCID50/ ml) ,与 H2 株长期适应于 35 ℃增殖有关。 图 1 　疫苗病毒在 37 ℃和 35 ℃ KMB17 细胞培养的抗原 滴度 Fig 1. Antigenic titers of vaccine viruses cultured in KMB17 cells at 37 ℃and 35 ℃ 表 1 　H2 株不同代次病毒的感染性滴度 Table 1. Infectious titers of different passages of H2 virus Temperature Incubation time Infetious titer Passage ( ℃) (d) (logCCID50/ ml) K7 35 28 8. 5 K12 35 28 8. 5 K15 37 28 6. 77 K18 35 28 8. 5 21 毒力/ 减毒水平 K7、K15 及 K18 病毒的猴体试验结果 ,8 只普通 狨猴对 3 个不同代次病毒的接种反应相似 ,抗 HAV GMT 128～181 ,肝脏酶活性偶见升高 ,粪便排毒以及 肝脏无实质性组织病理改变 ,见表 2。证实了疫苗 病毒在 KMB17 细胞长期传代过程中减毒性能稳定 , 是否进一步减毒值得探讨。 表 2 　普通狨猴对不同代次病毒的接种反应 Table 2. Responses of different passages of viruse in common maromset 　Anti2HAV conversion 　 　　　　Elevation 　　　　 Fecal Liver Passage Animal Time (w) GMT(12w) ALT AST ICD shedding histopathology K7 4 2 181 　1/ 44 3 　ND 3 3 0/ 44 4/ 4 1/ 4 ( ±) K15 2 2 128 1/ 20 1/ 20 0/ 20 2/ 2 2/ 2 ( - ) K18 2 1 —2 128 1/ 26 1/ 26 0/ 26 2/ 2 2/ 2 ( - ) ·431· 中国生物制品学杂志 2000 年第 13 卷第 3 期　Chin J Biologicals 2000 ,Vo1. 13. No. 3 © 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 　　31 核苷酸片段的序列 对 K7、K15、K18 的两个片段共 1897 个碱基的分 析 ,后二者与其亲本间的同源性高达 9913 %～ 100 % ,共检出 10 个核苷酸差异 ,其中 8 个发生在 5’非编码区 ,其余 2 个在编码区 ,其中 858 位核苷酸引起编码氨基酸由丙氨酸替换为丝氨酸 ,见表 3。 表 3 　K15、K18 和亲代病毒间的核苷酸比较 Table 3. Nucleotide sequences of K15 , K18 and their parent virus 　　　Homology　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Sites of nucleotide difference 　　　　　　　　　　 54 - 1232 2447 - 3164 59 151 184 193 233 348 369 591 858 3065 K7 C T T A G C G A G A K15 9918 100 — T T A G C G G T A K18 9913 9919 — A A T A A A G T G 讨 　　论 病毒疫苗的质量取决于生产环节的各种因素 , 包括细胞培养的可靠性和病毒在细胞培养过程中的 毒力稳定性。本研究结果 证明 住所证明下载场所使用证明下载诊断证明下载住所证明下载爱问住所证明下载爱问 H22KMB17 是一个稳 定的疫苗生产系统。经系统传 16 代次 (35 ℃) ,疫苗 病毒的抗原滴度和感染性滴度不变 ,其减毒性质稳 定 , 无回升迹象。本研究结果与 Provost 等[7 ] 用 CR326 株在 FRHK6 和 MRC5 连续传代后再接种狨猴 和黑猩猩的结果类似。 K15 和 K18 两个核苷酸片段的序列与其亲本 K7[8 ]的同源性达 9913 %～100 % ,证明疫苗病毒在细 胞培养增殖中的遗传稳定性良好。与 K15 病毒相 比 ,K18 具有更多的突变部位 ,其中多数位于 5’端非 编码区。Cohen 等[9 ]认为 5’端较小范围 (151～207) 的核苷酸变动与组织培养适应性有关 ,P2～P3 区的 突变与减毒有关。Funkhouser 等[10 ]的研究表明与细 胞培养适应性相关的核苷酸突变有 2/ 3 位于 5’端非 编码区。作者检出 K18 独特的 7 个突变核苷酸中 ,6 个位于 5’端非编码区 ,认为与细胞培养适应性有 关。结合猴体试验结果 ,某些突变是否提示进一步 减毒可能值得思考和研究。 黄雪卿等[11 ]曾报道用 KMB17 细胞在 36 ℃试制 的 K16 疫苗具有与常规疫苗可比的安全性和免疫原 性。本实验室也进行过该批疫苗的人体接种观察 , 取得相同结果。本文 K15 的猴体试验和测序结果提 示 ,疫苗病毒在 37 ℃增殖 ,有保持减毒和遗传稳定 性的可能。甲肝减毒活疫苗是一个新制品 ,有很多 问题有待研究探索。为了在较长时期内控制甲肝暴 发流行 ,尚需大量优质疫苗。因此 ,值得进一步研究 并改进与疫苗质量和产量有关的生产条件。 参 考 文 献 1 　黄小琴 ,练幼辉 ,王庆玲 ,等. 甲型肝炎减毒活疫苗 H2 株在狨猴体 内传代的试验. 中华预防医学杂志 ,1997 ,31 (5) :2602262. 2 　毛江森 ,曹逸云 ,谢汝英 ,等. 甲型肝炎减毒活疫苗的研究—1. 不 同毒力毒株的猴体试验 1 中国科学 B 辑 ,1987 ,6 :6252630. 3 　郭仁 ,曹逸云 ,戴振洲 ,等. 人二倍体细胞株 KMB17 的特性. 中国 医学科学院学报 ,1981 ,3 (4) :2262230. 4 　练幼辉 ,曹逸云 ,黄小琴 ,等. 甲型肝炎病毒动物模型研究. 现代预 防医学 ,1997 ,24 (3) :3032305. 5 　Krawczynski KK,Bradley KW ,Murphy BY,et al . 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No. 3 © 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net