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2010-NSFC-钙敏感受体在大鼠缺氧性肺动脉收缩和血管重构中的作用和分子机制.pdf

2010-NSFC-钙敏感受体在大鼠缺氧性肺动脉收缩和血管重构…

xthan
2011-02-08 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《2010-NSFC-钙敏感受体在大鼠缺氧性肺动脉收缩和血管重构中的作用和分子机制pdf》,可适用于人文社科领域

申请代码受理部门收件日期受理编号检查保护国家自然科学基金申请书(版)资助类别:亚类说明:附注说明:项目名称:申请人:电话:依托单位:通讯地址:邮政编码:单位电话:电子邮箱:申报日期:年月日国家自然科学基金委员会您现在不能检查保护文档或打印文档请根据以下三个步骤操作:)如果您是Word,wordXP,word或以上版本用户请把Word宏的安全性设为:"中"方法:Word菜单>工具>宏>安全性>安全级,设置为"中"(如果您是Word用户继续执行以下步骤)(如果您是Office用户点击word左上角"安全警告"处"选项"中的"启用此内容"))关闭本文档重新打开本文档)点击"启用宏"按钮即可开始填写本文档或打印了国家自然科学基金申请书版第页版本基本信息ykKroHP申请人信息姓名徐长庆性别男出生年月年月民族汉族学位学士职称教授每年工作时间(月)电话电子邮箱xucqcom传真国别或地区中国个人通讯地址哈尔滨市南岗区保健路号工作单位哈尔滨医科大学基础医学院病理生理教研室主要研究领域心肌缺血再灌注损伤的发生机制和保护依托单位信息名称哈尔滨医科大学联系人郭松电子邮箱guosongemshrbmueducn电话-网站地址http:合作研究单位信息单位名称在此录入修改在此录入修改项目基本信息项目名称钙敏感受体在大鼠缺氧性肺动脉收缩和血管重构中的作用和分子机制资助类别面上项目亚类说明附注说明申请代码H:心肌细胞血管细胞损伤、修复、重构和再生H:肺循环及肺血管疾病基地类别科技部和黑龙江省生物医药工程重点实验室部门开放研究年限年月年月研究属性基础研究摘要(限字):肺动脉高压(PAH)可导致右心肥大、衰竭甚至死亡。PAH确切机制尚未阐明多认为与肺动脉收缩和重构所致的外周阻力增大有关。钙敏感受体(CaSR)是G蛋白偶联受体。本课题组首次发现心肌组织有CaSR存在并证实它参与心肌缺血再灌注损伤、细胞凋亡和心肌肥大的发生。但是CaSR与PAH发生发展的关系迄今国内外尚无报道。在前期研究中我们发现大鼠肺动脉有CaSR的功能表达并在预实验中观察到缺氧时CaSR表达增加。我们推测缺氧时肺动脉CaSR表达可诱导肺血管收缩和重构这可能是缺氧性肺动脉高压的一个新机制。为证实这一假说我们将复制大鼠急性和慢性缺氧模型采用分子生物学、流式细胞仪等技术从整体血管环细胞三个层次观察CaSR表达增加或活化对肺动脉张力、血管重构的影响及其信号传导通路。本课题将从新的视觉阐明PAH发生的分子机制并为PAH的防治提供新靶点。关键词(用分号分开最多个)缺氧性肺动脉高压钙敏感受体肺动脉平滑肌血管重构大鼠国家自然科学基金申请书版第页版本项目组主要参与者(注:项目组主要参与者不包括项目申请人国家杰出青年科学基金项目不填写此栏。)编号姓名出生年月性别职称学位单位名称电话电子邮箱项目分工每年工作时间(月)席玉慧女讲师硕士哈尔滨医科大学xyhuicom分子生物学李鸿珠女讲师博士哈尔滨医科大学lihongzhucom细胞内钙测定李光伟男博士生硕士哈尔滨医科大学liguangweisohucom肺血管重构的信号传导郝静辉女硕士生学士哈尔滨医科大学haojinghuicom肌张力检测王欣燕女主治医师硕士哈尔滨医科大学wxylyfcom免疫组化孙健女博士生硕士哈尔滨医科大学mdjsunjiancom细胞周期孔凡娟女硕士生学士哈尔滨医科大学kfjsinacom生化测定贾洪丽女硕士生学士哈尔滨医科大学jiahonglicom模型制备吴博女助教硕士哈尔滨医科大学wubowcom分子生物学总人数高级中级初级博士后博士生硕士生说明:高级、中级、初级、博士后、博士生、硕士生人员数由申请人负责填报(含申请人)总人数由各分项自动加和产生。国家自然科学基金申请书版第页版本经费申请表(金额单位:万元)科目申请经费备注(计算依据与说明)一研究经费科研业务费()测试计算分析费mRNA测序、引物合成、图像分析、流式细胞仪、电镜检查费等()能源动力费()会议费差旅费学术会议×人次,科研调研差旅费()出版物文献信息传播费国内外期刊论文发表费,文献资料费,答辩评审费,信息传播费()其他不可预见费实验材料费()原材料试剂药品购置费RNA试剂盒、RTPCR试剂、各种抗体、化学试剂、PCR引物的设计、各种耗材()其他标准实验动物购买及饲养仪器设备费()购置氮气发生器()试制实验室改装费协作费二国际合作与交流费项目组成员出国合作交流参加国际会议人次境外专家来华合作交流境外专家短期来华合作交流国际旅费和生活费三劳务费参加课题的研究生和博士后的劳务和生活补助费四管理费按基金委规定:经费%为管理费合计与本项目相关的其他经费来源国家其他计划资助经费其他经费资助(含部门匹配)其他经费来源合计国家自然科学基金申请书版第页查看报告正文撰写提纲报告正文(一)立项依据与研究内容项目的立项依据肺动脉高压(pulmonaryarterialhypertensionPAH)是不同病因导致的以肺动脉压力和肺血管阻力升高为特点的一组疾病或临床综合征发病率和死亡率很高其发病机制主要为血管收缩、血管重构和血栓形成【】。如果PAH不加治疗最终导致右心衰竭、容量负荷增加直至死亡【】。通常肺动脉高压的判定标准为:平均肺动脉压力在静息状态下>mmHg运动状态下>mmHg。PAH有多种分类方法。年前仅分为原发性肺动脉高压(PPH)和继发性肺动脉高压(SPH)两大类。年第届威尼斯PAH会议将PAH进一步分为:①特发性PAH(IPAH)②家族性PAH(FPAH)③获得性PAH(APAH)④与重要静脉或毛细血管相关的PAH⑤新生儿持续性PAH(PPHN)。根据美国疾控中心的资料各类型PAH患病率已超过O~O人/万人【】。许多慢性呼吸系统疾病或缺氧可引起低氧性PAH:)阻塞性肺疾病:慢性阻塞性肺疾病(COPD)、囊泡性纤维化支气管扩张等)间质性肺病:特发性间质性肺炎等)肺泡换气不足:肥胖通气不良综合症神经肌肉病等()睡眠障碍性呼吸:睡眠呼吸暂停等()久居高山或高原()发育异常新生儿肺疾患【】。PAH的发生机制复杂。特发性和家族性PAH主要与BMPR等基因突变有关【】。众所周知肺血管收缩是PAH的早期组分由细胞内钙增加触发信号传导通路主要包括PKC、Rho激酶和环磷酸腺苷(cAMP和cGMP)钙库操纵性钙通道和电压门控性钾通道(见图)【】。图肺动脉平滑肌细胞的钙稳态调节机制在高肺血流、低氧、毒物等病理条件下血管内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞以及血小板和单核巨噬细胞分泌血管活性介质的平衡失调可促进血管收缩、血管重构以及血栓形成(图)【】。PAH发生的分子机制与血管舒张和收缩因子失衡、骨形态发生蛋白II型受体(BMPRII)信号通路激活、弹性蛋白酶活化、钾通道功能障碍、线粒体异常、瞬时受体电位钙通道(TRPC)激活、AMPK激活血管壁促炎反应等有关(图)【】。气体信号分子NO、CO、HS及其调节等已成为PAH的研究热点【】杜军保等已开展了系列研究。Notch国家自然科学基金申请书版第页信号传导途径在促进PAH发展中作用开始受到人们重视(LiXDetal,naturemedicine:)近年来哈医大朱大岭等对HETE在低氧性PAH的作用和机制进行了系统研究【】。图各种细胞在肺动脉高压时血管重构中作用图肺动脉高压(PAH)分子发生机制根据PAH发生的分子机制人们采用弹性蛋白酶抑制剂、Kv开放剂、TRP通道抑制剂、负性生存素、他汀类药物、PPARγ激动剂、各种生长因子受体的抑制剂、肾上腺髓质素、Rho激酶抑制剂、内皮祖细胞、环孢霉素A等治疗【】。国内在PAH的研究是方兴未艾。笔者以“肺动脉高压”为检索主题词检索国家自然科学基金委网站结果显示:最近年内得到国家自然科学基金委资助的有关“肺动脉高压”研究项目合计项呈逐年增加趋势(年项年项年项年项年项)研究内容主要涉及上述提到的有关因素【】。但是肺动脉高压的研究虽有多年的历史其发病机制至今尚未阐明【】。尽管现代化的治疗明显改善了PAH患者的生理功能和延长了寿命但其死亡率仍高达【】。这就要求人们从国家自然科学基金申请书版第页新的视觉进一步阐明肺动脉高压的发生机制以便为其有效防治提供新靶点。钙敏感受体(calciumsensingreceptor,CaSR)是G蛋白耦联受体的C家族成员。年﹐Brownetal首次由牛甲状旁腺克隆出CaSR。CaSR由氨基胞外域(ECD)、个跨膜螺旋的跨膜域(TCD)和胞内羧基尾部所组成(见图)。CaSR主要分布在参与钙稳态调节的甲状旁腺、肾肠道、骨组织和肾组织以及其他细胞(例如中枢和外周神经、肝脏血细胞、胰腺β细胞等)。其功能主要是维持Ca和其他金属离子稳态尚可调节细胞增殖、分化、离子通道开启、激素分泌等。细胞外Ca+是CaSR的主要配体Mg+、Gd+、新霉素、精胺(spermine)等多价阳离子亦是CaSR的激动剂。图钙敏感受体机构示意图心血管领域CaSR的研究开展较晚。项目申请人与加拿大WangRui教授合作首次在国际上证明了大鼠心肌有CaSR表达(WangR,XuCQ,ZhaoWM,etalCalciumandpolyamineregulatedcalciumsensingreceptorsincardiactissuesEurJBiochem:–)。迄今该文被SCI引用次。年TfeltHansen等人报告CaSR在新生大鼠心室肌细胞也有功能性表达。近年来其他实验小组也提供了一些证据表明CaSR在主动脉等血管的内皮细胞和平滑肌有功能性表达-。最近MasihulAlam等证实性肾衰时的血管钙化伴有血管平滑肌细胞功能性钙敏感受体的丢失【】。年以来项目申请人获得了项国家自然科学基金资助:)《大鼠心肌细胞钙敏感受体的生物学活性及其在心肌缺血再灌注损伤中的作用》())大鼠心肌多胺代谢规律和"双刃剑"作用机制的研究》()()《钙敏感受体对动脉粥样硬化大鼠急性心肌梗死易感性的影响和保护研究》()。在上述项目的资助下本课题组首次发现:()CaSR在大鼠心肌组织中存在及不同鼠龄的表达规律()CaSR激活通过G蛋白PLCIP通路引起Cai增加导致钙超载()CaSR在心肌缺血再灌注时的表达规律可通过线粒体通路、Fas死亡受体通路和内质网应激通路诱导心肌细胞凋亡()PKCε介导CaSR活性改变参与了缺血后适应()CaSR通过神经钙调磷酸酶参与AngII诱导的大鼠心肌肥大()CaSR表达增加可使动脉粥样硬化大鼠对心肌梗死的敏感性增加【】。迄今已发表相关论文余篇其中SCI收录篇(详见下面研究基础)。国家自然基金项目《大鼠心肌细胞钙敏感受体的生物学活性及其在心肌缺血再灌注损伤中的作用》已获年黑龙江省政府自然科学二国家自然科学基金申请书版第页等奖(申请人排名第一)。CaSR目前已成为国际的研究热点在我国也开始得到关注。迄今为止国家自然基金委资助有关CaSR的研究项目共项(见下表):尽管国内外学者在心血管系统的钙敏感受体(CaSR)方面开展了一些研究但是肺动脉平滑肌细胞有无CaSR的功能表达及其病理生理意义迄今未见有PubMed收录论文发表。笔者在网上检索了PubMed。在“题目摘要”范畴内以“肺动脉高压”、“肺动脉平滑肌”、“肺动脉平滑肌细胞”、“钙敏感受体”为检索词分别检出、、、篇论文但是将“钙敏感受体”与其他检索词联合检索则检索结果均为“”(见下表)。MoJunLin等观察到慢性缺氧时瞬时受体电位(TRPC)基因负责编码的钙库操纵性阳离子通道和受体操纵性阳离子通道在肺动脉平滑肌表达上调并认为这可能是缺氧性PAH的一个新机制【】。鉴于CaSR普遍在机体各系统、器官、组织和细胞中有表达而且CaSR引起细胞内钙升高的机制也是通过钙库操纵性钙通道(SOCC)和受体操纵性钙通道(ROCC)因此我们推测CaSR在肺动脉平滑肌细胞有功能表达并可能参与缺氧性肺动脉高压的发生。这种假说已在预实验中得到了初步证实(详见工作基础):国家自然科学基金申请书版第页我们研究小组和同济医学院胡清华研究小组在国内同时开展了肺动脉CaSR的研究并分别证明肺动脉有CaSR的表达:胡清华教授的博士研究生罗友根发表了他的学位论文“新的细胞外钙感受机制在缺氧引起肺动脉平滑肌细胞胞桨钙离子浓度变化中的作用”()本人的博士研究生李光伟在《第七届海峡两岸心血管科学研讨会》(,昆明)也作了“钙敏感受体在大鼠肺动脉平滑肌细胞的功能性表达”的学术报告(文稿KM)目前英文稿件已投出【】。慢性呼吸系统疾病或缺氧情况在临床上很常见。例如慢性阻塞性肺疾病(COPD)在我国的北方地区(尤其农村)十分常见。慢性支气管炎→阻塞性肺气肿→缺氧性肺动脉高压→右心肥大→右心衰竭几乎成了疾病发生发展的规律。缺氧性PAH的发展对疾病的进展起着推波助澜的作用。慢阻肺(COPD)不仅给患者带来了巨大的痛苦也给家庭和社会带来了沉重的经济负担。我们的研究将进一步揭示缺氧性肺动脉高压的发生机制为其有效防治提供新理论和药物新靶点。参考文献ChanSYLoscalzoJ.Pathogenicmechanismsofpulmonaryarterialhypertension.JMolCellCardiol():StenmarkKR,McMurtryIFVascularremodelingvesusvasoconstrictioninchronichypoxicpulmonaryhypertension:atimeforreappraisalCircRes:FarberH,LoscalzoJPulmonaryarterialhypertensionNEnglJMed:–张颖刘双杨京华。肺动脉高压诊断及分类。心肺血管病杂志():王伟王玉林肺动脉高压发病机制研究进展实用儿科临床杂志():RedaEGirgis,StephenCMathaiPulmonaryHypertensionAssociatedwithChronicRespiratoryDiseaseClinChestMed()–MainaliPrabha,JINHongfang,TIANYue,TANGChaoshuandDUJunbaoMechanismsresponsibleforpulmonaryhypertensionChinMedJ():AngelCogolludo,LauraMoreno,EduardoVillamorMechanismsControllingVascularToneinPulmonaryArterialHypertension:ImplicationsforVasodilatorTherapyPharmacology:–MarleneRabinovitchMolecularpathogenesisofpulmonaryarterialhypertensionTheJournalofClinicalInvestigation,():–LeiGuo,XiaoboTang,XiaojieChu,LihuaSun,LeiZhang,ZhaopingQiu,ShuoChen,YumeiLi,XiaodongZheng,DalingZhuRoleofproteinkinaseCinHETEinducedhypoxicpulmonaryvasoconstrictionProstaglandins,LeukotrienesandEssentialFattyAcids()–ShuangWang,YaliWang,JingJiang,RuifangWang,LisaLi,ZhaopingQiu,HongWu,DalingZhuHETE国家自然科学基金申请书版第页protectsratpulmonaryarterialsmoothmusclecellsfromapoptosisviathePIKAktpathwayProstaglandinsotherLipidMediators()–ZaimanA,FijalkowskaI,HassounPM,TuderRMOnehundredyearsofresearchinthepathogenesisofpulmonaryhypertensionAmJRespirCellMolBiol:WangXX,ZhangFR,ShangYP,ZhuJH,XieXD,TaoQM,etalTransplantationofautologousendothelialprogenitorcellsmaybebeneficialinpatientswithidiopathicpulmonaryarterialhypertension:apilotrandomizedcontrolledtrialJAmCollCardiol:.Brown,EdwardM,andRJohnMacLeodExtracellularCalciumSensingandExtracellularCalciumSignalingPhysiolRev:–,WangR,XuCQ,ZhaoWM,etalCalciumandpolyamineregulatedcalciumsensingreceptorsincardiactissuesEurJBiochem,–()TfeltHansenJ,HansenJL,SmajilovicS,etalCalciumreceptorisfunctionallyexpressedinratneonatalventricularcardiomyocytesAmJPhysiolHeartCircPhysiol():HRoyCZiegelstein,YaliXiong,ChaoxiaHe,etalExpressionofafunctionalextracellularcalciumsensingreceptorinhumanaorticendothelialcellsBiochemicalandBiophysicalResearchCommunications()–SanelaSmajilovic,JakobLercheHansen,TueEHChristoffersen,etalExtracellularcalciumsensinginrataorticvascularsmoothmusclecellsBiochemicalandBiophysicalResearchCommunications()–MasihulAlam,JohnPaulKirton,FionaLWilkinson,etalCalcificationisassociatedwithlossoffunctionalcalciumsensingreceptorinvascularsmoothmusclecellsCardiovascularResearch(),–孙轶华张力,徐长庆(),李弘,时飒,赵雅君,韩丽萍,张红雨。不同鼠龄大鼠心肌组织中钙敏感受体的表达及与缺氧再灌注损伤的关系。中国病理生理杂志():-ZhangWH,FuSB,LuFH,WuB,GongDM,PanZW,LvYJ,ZhaoYJ,LiQF,WangR,YangBF,XuCQ()Involvementofcalcium–sensingreceptorinischemiareperfusion–inducedapoptosisinratcardiomyocytesBiochemiacalandBiophysicalResearchCommunications,:.SunYH,LiuMN,LiH,ShiS,ZhaoYJ,WangR,XuCQ()CalciumsensingreceptorinducesratneonatalventricularcardiomyocyteapoptosisBiochemicalandBiophysicalResearchCommunications()–JiangCM,HanLP,LiHZ,QuYB,ZhangZR,WangR,XuCQ(),LiWMCalciumsensingreceptorsinduceapoptosisinculturedneonatalratventricularcardiomyocytesduringsimulatedischemiareperfusionCellBiologyInternational()吴博,张伟华,李全凤,高秀香,张力,杨金霞,王秀丽,张明爽,张卓然,徐长庆()钙敏感受体对大鼠心肌缺氧-复氧损伤时细胞凋亡的影响中国病理生理杂志,():LuF,TianZ,ZhangW,ZhaoY,BaiS,RenH,ChenH,YuX,WangJ,WangL,LiH,PanZ,TianY,YangB,WangR,XuC()CalciumSensingReceptorsInduceApoptosisinRatCardiomyocytesviatheEndo(sarco)plasmicReticulumPathwayduringHypoxiaReoxygenationBasicClinPharmacolToxicolDecEpubaheadofprintZhangWH,LuFH,ZhaoYJ,WangLN,TianY,PanZW,LvYJ,WangYL,DuLJ,SunZR,YangBF,WangR,XuCQ()PostconditioningprotectsratcardiomyocytesviaPKCmediatedcalciumsensingreceptorsBiochemiacalandBiophysicalResearchCommunications,:WangLN,WangC,LinY,XiYH,ZhangWH,ZhaoYJ,LiHZ,TianY,LvYJ,YangBF,XuCQ()InvolvementofcalciumsensingreceptorincardiachypertrophyinducedbyangiotensinIIthroughcalcineurin国家自然科学基金申请书版第页pathwayinculturedneonatalratcardiomyocytesBiochemicalandBiophysicalResearchCommunications,():GuoJ,LiHZ,ZhangWH,WangLC,WangLN,ZhangL,LiGW,LiHX,Yang,BFWuLY,WangR,XuCQ()IncreasedexpressionofcalciumsensingreceptorsinducedbyoxLDLamplifiesapoptosisofcardiomyocytesduringsimulatedischaemia–reperfusionClinicalandExperimentalPharmacologyandPhysiology(),e–eMoJunLin,GeorgePHLeung,WeiMinZhang,etalChronicHypoxia–InducedUpregulationofStoreOperatedandReceptorOperatedCaChannelsinPulmonaryArterialSmoothMuscleCells–ANovelMechanismofHypoxicPulmonaryHypertensionCircRes:LiGW,WangQS,HaoJH,XingWJ,GuoJ,LiHZ,BaiSZ,LiHX,YangBF,WuLY,WangRandXuCQ()FunctionalexpressionoftheextracellularcalciumsensingreceptorinratpulmonaryarterysmoothmusclecellsAMJPHYSIOLLUNGC(insubmit)项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键科学问题研究内容()大鼠肺动脉平滑肌钙敏感受体的分布、表达和功能(已基本完成)采用组织化学和免疫荧光技术确定CaSR在大鼠肺动脉平滑肌和细胞的分布特点采用PRPCR和WesternBlot技术观察CaSR在大鼠肺动脉平滑肌组织和细胞的表达情况采用激光共聚焦技术确定CaSR激活引起肺动脉平滑肌细胞Cai增加的机制和途径采用血管环检测技术观察CaSR对肺动脉平滑肌张力的影响。慎密分组应用各环节激动剂或抑制剂以确保结论可靠(下详)。()缺氧时大鼠肺动脉平滑肌钙敏感受体表达的变化及其对血管收缩和重构的影响采用大鼠整体缺氧模型和细胞缺氧模型作为研究对象采用上述各种实验技术观察急慢性缺氧(缺氧不同时间)对大鼠肺动脉平滑肌的CaSR表达、肌张力、组织重构(细胞增殖和细胞凋亡)的影响揭示CaSR表达增加和激活对肺血管收缩、血管重构的影响和信号传导途径以便阐明CaSR在缺氧性肺动脉高压中的作用和分子机制。CaSR表达、肌张力和Cai测定的方法同上用细胞增殖和细胞凋亡作为反映血管重构的指标观察形态学、增殖(凋亡)率、相应信号传导通路关键分子表达的变化。具体的研究内容、方法和路线详见下面的研究方案。研究目标()证实大鼠肺动脉平滑肌有功能性钙敏感受体(CaSR)的表达。()揭示缺氧时肺动脉平滑肌CaSR表达增加通过促进血管收缩、血管重构参与缺氧性肺动脉高压(PAH)的形成从新的视觉揭示其分子机制为缺氧性PAH的防治提供新思路和新靶点。拟解决的关键科学问题()肺动脉平滑肌有功能性钙敏感受体(CaSR)的表达这是探讨CaSR在肺动脉高压发生中的作用以及后续研究的前提和基础。根据KWonneberger等人的文献欲判断某组织是否存在CaSR需用分子生物学方法和功能性检验证实:()Cao增加可引起Cai增加()Cai增加来源于国家自然科学基金申请书版第页钙库动员()外钙内流需经非电压依赖性钙通道()Gd和Ca是激动剂()CaSR转录和表达的存在(用PTPCR免疫组化northernblot,westernblot等证实)(KWonneberger,MAScofield,PWangemannEvidenceforacalciumsensingreceptorinthevascularsmoothmusclecellsofthespiralmodiolararteryJMembrBiol():)。我们通过研究内容()所示各种相关实验将充分证实肺动脉平滑肌细胞有CaSR的功能性表达。()一般认为肺血管收缩、重构和原位血栓形成是肺动脉高压(PAH)发生发展的重要病理生理基础。本实验拟通过实验证实缺氧(尤其慢性缺氧)能使肺动脉平滑肌CaSR表达增多后者又通过细胞内钙增加促进肺血管收缩通过调节细胞凋亡和细胞增殖引起血管重构进而导致缺氧性PAH的发生发展。如果上述假设得到证实这将为肺动脉高压的“CaSR激动假说”提供通过了坚实的实验依据。研究成果将具有重要理论意义和潜在的应用前景。拟采取的研究方案及可行性分析本项目的科研设计将依据随机对照和重复的三大原则。根据不同情况分别采用组间对照和自身前后对照并进行相应的统计分析。()实验设计和技术路线)正常大鼠肺动脉平滑肌CaSR的功能性表达①实验动物:Wister大鼠体重g,雌雄不拘清洁级哈医大动物中心提供。每组n=(视具体情况而定)。②重要试剂的使用浓度:CaSR激动剂:GdClmM–mMCaSR抑制剂NPSμM肌浆网(SR)钙泵抑制剂:ThapsigarginμM磷脂酶C(PLC)抑制剂:UμMU的类似物UμM钠钙交换体抑制剂:NiClmML型钙通道抑制剂:CdClmMSR钙库耗竭剂:CoffeinemM③具体实验方法:(后详)④技术路线:国家自然科学基金申请书版第页图正常大鼠肺动脉和肺动脉平滑肌细胞CaSR的表达、定位、功能检测和机制探讨)慢性缺氧大鼠肺动脉平滑肌CaSR表达变化及其与肺动脉高压的关系①实验动物:同上②重要试剂的使用浓度:同上③具体实验方法:(后详)④技术路线:ACaSR激活对缺氧性肺动脉收缩的影响图CaSR激动剂和抑制剂对急性缺氧条件下肺动脉环肌张力的影响国家自然科学基金申请书版第页B慢性缺氧大鼠肺动脉CaSR表达与肺动脉高压的相关性图慢性缺氧时大鼠肺动脉CaSR的表达与肺动脉高压相关参数的变化C缺氧时肺动脉CaSR表达增加对血管重构的影响及其机制国家自然科学基金申请书版第页图缺氧对培养肺动脉平滑肌细胞CaSR表达和细胞增殖及凋亡的影响及其信号传导通路()研究方法)肺动脉血管张力的测定:国家自然科学基金申请书版第页Wister大鼠戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(mgkg)。开胸取心脏和肺脏立即置于℃盛有Hepes液的培养皿中体视显微解剖镜下游离直径mm肺内肺动脉除去血管周围脂肪和结缔组织剪成长度约为mm血管环悬挂在两根钨丝三角环上,一端挂在塑料支架下面的铁钩上置于盛有mlKrebs液恒温浴槽内,另一端挂在张力换能器的电极上持续通以OCO混合气。在min内逐渐给肺动脉环负荷g的基础张力平衡h后分别测定不同条件下的血管张力。【参见:ZhuD,EffrosRM,HarderDR,RomanRJ,JacobsER()TissuesourcesofcytochromePAandHETExynthesesinrabbitlungs,AmJRespirCellMolBiol,,】)肺动脉平滑肌细胞的原代及传代培养:采用Ⅱ型胶原酶消化法培养肺动脉平滑肌细胞的方法即取g左右的大鼠用ml水合氯醛麻醉。将麻醉后的大鼠固定于手术台用酒精棉对大鼠表面皮肤进行消毒。沿着大鼠剑突部位剪开胸腔暴露心脏和肺部用镊子轻提心脏沿气管处取下肺部至于PBS缓冲液中。将肺叶固定于硅胶板上用显微手术剪在体式显微镜下取出远端肺动脉去内皮后用剪刀将血管剪成碎块置于Ⅱ型胶原酶中消化成絮状。用DMEM高糖培养液终止消化后用转离心分钟取下层沉淀用培养液重悬放于培养瓶中培养。隔天进行换液一周后进行鉴定。原代培养细胞长满瓶底即可传代培养取第代生长良好的用于实验。传代培养的肺动脉平滑肌细胞长至左右融合时换无血清培养h进行实验。【参见:LÜChangLian,YEHong,TANGXiaoBo,ZHUDaLing,()ERKsignalingpathwayisinvolvedinhydroxyeicosatetraenoicacidinducedhypoxiapulmonaryvosoconstriction,ActaPhysiologicaSinica,():】)肺动脉平滑肌细胞鉴定(抗αactin免疫组化染色):取正常培养未加任何处理的肺动脉平滑肌细胞培养在多聚赖氨酸处理的盖玻片上纯丙酮固定min后PBS清洗HO稀释的甲醇室温作用min灭活内源性酶PBS清洗两次。滴加正常山羊血清室温作用min。滴加抗鼠α肌动蛋白抗体(:)℃过夜。PBS清洗次滴加生物素标记的山羊抗兔二抗℃孵育minPBS洗次。滴加SABC℃孵育minDAB显色min。自来水冲洗苏木素复染二甲苯透明封片光镜下观察摄片。)大鼠缺氧细胞模型的复制:培养的肺动脉平滑肌细胞置于自制的可封闭的有机玻璃盒中培养小时盒内持续通以N、O、CO的混合气体玻璃盒浸于恒温浴箱中。)大鼠缺氧在体模型的复制:健康雄性大鼠体重为g正常组吸入大气,氧气分数为(FiO)。缺氧组大鼠置于缺氧培养箱中(下图)其吸入氧浓度为连续饲养d、d、d、d。。缺氧箱上有通气孔可使缺氧箱内外空气相通氧气监控器检测缺氧箱内氧浓度并自动控制氮国家自然科学基金申请书版第页气流入量以保持箱内氧气分数(FiO)为低氧箱内有风扇调匀气体。空气经通气管进入SPB全自动空气源经SP

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