胃癌及高级别上皮内瘤变组织的微卫星不稳定性的研究

山西医科大学学报 (J Shanxi Med Univ)2008年 7月，39(7 文章编号： 1007—6611(2008)07—0607—04 胃癌及高级别上皮内瘤变组织的微卫星不稳定性的研究 · 607 · 庞瑾昱 ， 杨宣琴 ， 李 丽 ， 王全红 ( 山西医科大学病理教研室， 太原 030001； 山西省肿瘤医院病 理科； 通讯作者，E—mail：wangrenk@public．ty．sx．ca) 摘要： 目的 对照检测伴有正常及高级别上皮内瘤变的胃腺癌组织中微卫星不稳定性(microsatellite instability，MSI)的情 况，以探讨其在 胃癌及高级别上皮 内瘤变组织中的变化规律及其与胃癌临床病理的关系。 方法 选择 55例伴有正常及高 级别上皮内瘤变的胃腺癌标本，应用手工显微切割、多聚酶链反应等分子病理学技术 ，对照 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 正常、高级别上皮 内瘤变和胃 腺癌组织中9号染色体上的10个微卫星位点的MSI变化，分析其与临床病理参数的关系。 结果 ①在有信息的病例中， 高级别上皮内瘤变组织中的MSI总发生率为28％，胃腺癌组织中的MSI总发生率为38％，正常组织中未发生 MSI。②在胃 癌组织中，MSI发生率与胃癌的家族史和肿瘤的发生部位有关(P<0．05)；与胃癌患者的性别、淋巴结是否转移、肿瘤大小及 组织病理分型方面无关(P>0．05)。在高级别上皮内瘤变中，MSI发生率与胃癌的家族史有关(P<0．05)。 结论 ①MSI 在高级别上皮内瘤变中的存在，提示 MSI可能是胃癌的多步骤发生过程中的早期而重要的分子事件，在胃癌的发生、发展过 程中扮演重要角色；②胃癌在染色体 9p21区发生有高频率的MSI，提示在染色体9p21区域可能存在多个与胃癌相关的肿瘤 抑制基因。 关键词： 胃癌； 微卫星不稳定性； 高级别上皮内瘤变 ； 肿瘤抑制基因 中图分类号： R735．2 文献标识码 ： A Study on microsatellite instability in gastric cancer and high-grade intraepithelial neoplasia tissues PANG Jin-yu ，YANG Xuan—qin2，LI Li ，WANG Quan—hong2 ( Dept of Pathology，Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China；2Dept ofPathology，ShanxiProvincialPeople’sHospital，*Correspondingauthor，E-mail：wangrenk@public．ty． sT,．C?1) Abstract： Objective To detect the microsatdlite instability(MSI)in gastric carcinoma with high-grade intraepithelial neoplasia and normal tissues，and to explore the changeable patterns of MSI in gastric carcinoma and the relationship between MSI and clinico— pathological features． Methods MSI of ten microsatellite markel8 on chromosome 9 were detected in 55 cases of gastric carcinoma with high-grade intraepithelial neoplasia tissues and normal tissues by microdissection and polymerase chain reaction technology，and the relationship between MSI rate and clinicopathological parameters was analyzed． Results ① In the informative cases，total fre— quency of MS1 was 28％ in high-grade intraepithdial neoplasia and 38％ in gastric carcinoma．②In gastric carcinoma，MS1 was relat— ed to family history of gastric carcinoma and the positions of the tumor，but not with sex，transfusion of tum or，size of tum or an d pathological type．In gastric carcinoma with high-grade intraepithelial neoplasia，MS1 was related to fam ily history of gastric carcino- ma． Co nclusion The results indicate that MSI may be an early and important molecular event in the occurrence of gastric carcino— ma，and that there are some tum or depressive genes rdated with gastric carcinoma in chromosome 9p21． Key words： gastric carcinoma； microsatellite instability； high—grade intraepithelial neoplasia； tum or depressive gene 胃癌是消化道最常见的恶性肿瘤之一，在我国 其死亡率居恶性肿瘤之首【 。胃癌的发生涉及一 系列分子遗传学改变 ，包括癌基因的激活、抑癌基 因的失活、端粒酶活性改变等。自1993年在遗传 性非息肉性大肠癌中发现微卫星不稳定性 (mi— crosatellite instability，MSI)现象以来，在多种恶性肿 瘤包括胃癌中均检测到 MSI的存在，提示其在胃癌 的发生发展过程 中可能具有重要意义 J。目前， MSI与 胃癌发生发展的分子机制尚不十分清楚。 本研究选择定位于9号染色体上的10个微卫星位 点，对正常组织、高级别上皮内瘤变和胃癌组织进 行 MSI检测，观察 MSI在胃癌发生发展中的变化 情况 ，从分子水平进一步探讨 MSI在胃癌中的作用 机制，为胃癌的基因诊断和基因治疗提供一定的理 论依据。 1 材料与方法 1．1 材料 选择山西省肿瘤医院 55例伴有正常 组织及高级别上皮 内瘤变手术切除的胃癌标本。 所有标本离体后立即无菌取材，80％酒精固定，石 蜡包埋，按照 WH02003年新 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 进行病理学分 级[3I。 维普资讯 http://www.cqvip.com · 608 · 山西医科大学学报 (J Shanxi Med Univ)2008年7月，39(7 1．2 主要试剂及仪器 PCR引物购 自美国 Re— search Genetics公司(见表 1)；蛋白酶 K购自Sigma 公司；Taq DNA聚合酶购自Promega公司；基因扩 表 1 微卫星位点引物序列、扩增片段参数 Tab 1 The primer sequence arid products of microsatellite DNA 增仪：TC-48／I-I(t)(美国)；高压电泳仪：EC3000 90(美国)。 1．3 方法 1．3．1 制片 选取 55例伴有正常、高级别上皮内 瘤变的胃腺癌组织蜡块，连续切取约 5脚 厚的白 片若干张，取其中1张做HE染色，在显微镜下标记 正常、高级别上皮内瘤变和 胃腺癌组织的定位区 域，供显微切割参照用。 1．3．2 显微切割 将改良HE 染色的组织切片置 于低倍显微镜(4×)下，对照 HE 染色切片所示细胞 区域，寻找目的细胞区。用一次性无菌皮试针头将 目的细胞与周围组织分离，分别刮取正常体细胞、 高级别上皮内瘤变和腺癌组织。 1．3．3 PCR扩增 10 l反应体系含：aaH20 4．9 l、10×buffer液 1．0 l、MgCI2 0．8 l、dNTP 0．8 ffl、引物 20 ffmol／L各 0．2 l、Taq DNA聚合酶 5 U l 0．1 l、模板 DNA液 2．0 l。PCR反应条件： 95℃变性 6 min；95℃变性 1 min、55℃退火 1 min、 72℃延伸1 min，35个循环；72℃延伸10 min；取出 后立即放入冰盒内，以备高压电泳。 1．3．4 6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 用前取 6％ 变性聚丙烯酰胺母液 80 ml，加入 500 l的APS液 和 35 l的TEMED液，混匀后灌制成 6％变性聚丙 烯酰胺凝胶。将 PCR扩增产物在 6％变性聚丙烯 酰胺凝胶中进行高压电泳(60 w，1 800 V)，1．5— 2．5 h。 1．3．5 硝酸银(AgNO3)染色 分离胶板，进行 Ag— NO 染色，显影至条带清晰，室温晾干，照相。 1．4 结果判断 当正常对照组织的扩增产物为2 条分开的主要条带时，说明此位点为杂合性，判断 为有意义的信息个体；当正常对照组织的扩增产物 仅为 1条时，说明此位点为纯合子，判断为无意义 的信息个体。 在有意义的信息个体中，与正常组织DNA电 泳带比较，若被测病例DNA条带发生位置改变、丢 失或获得异常条带即可判定为微卫星不稳定性 (MSI)~4-6]。 1．5 统计学分析 采用 SPSS12．0统计软件对实 验数据进行对数似然比卡方检验分析，P<0．05为 差异有统计学意义。 2 结果 2．1 MSI的发生 本研究在正常胃黏膜腺上皮内 未检测到MSI。在有信息的病例中，高级别上皮内 瘤变组织中 10个微卫星位点 MSI的发生率依次 为：D9S175为 38％、139S1876为 38％、D9S166为 36％、D9S1118为 33％、D9S1822为 33％、IFNA为 27％、139S171为 21％、D9S941为 18％、D9s9l0为 14％、D9S942为 11％，MSI总发生率为 28％(132／ 478)。胃腺癌组织中10个微卫星位点 MSI的发生 率 依 次 为：D9S171为 50％、D9S175为 48％、 D9S1876为 47％、D9Sl118为 45％、D9S166为 42％、IFNA为 41％、139S1822为 40％、D9S910为 26％、D9S941为22％、D9S942为 15％，MSI总发生 率为 38％(183／478)。 维普资讯 http://www.cqvip.com 山西医科大学学报 (J Shanxi MedUniv)2008年 7月 ，39(7 2．2 MSI检测结果与各临床病理参数的关系 应 用 SPSS12．0统计软件对 10个微卫星位点 MSI检 测结果与患者的性别、消化道肿瘤家族史、发生部 位、肿瘤大小、病理分型及淋巴结转移情况分别进 行对数似然比卡方检验。在胃癌组织中，MSI的发 · 609 · 生率与在胃癌家族史和肿瘤的发生部位有关 (P< 0．05)；其发生与 胃癌患者的性别、淋 巴结是否转 移、肿瘤大小及组织病理分型无关(P>0．05)。在 高级别上皮内瘤变中，MSI的发生率与胃癌家族史 有关(P<0．05)，表 2。 表2 MSI与胃癌临床病理特点的关系 (例) Tab 2 Relationship between MSI and the clinicopathological features in gastric carcinoma (cas~s) 3 讨论 肿瘤分子遗传学研究表明，一个正常逐步获得 恶性表型需要多个遗传改变的积累。一类是癌基 因、抑癌基因的突变，另一类遗传改变就是近年来 发现的微卫星不稳定性，认为它是肿瘤发生的一种 新的重要机制 。微卫星(microsatellite，MS)是基 因组DNA中1—6个核苷酸组成的简单重复序列， 其重复可达 10—50次。具有高度多态性、遗传稳 定性和孟德尔共显性遗传方式 ，广泛应用于基因定 位和连锁分析。微卫星不稳定性(microsatellite in— stability，MSI)是指由于 DNA复制错误(replication error，RER)引起的简单重复序列的增加或丢失。 其发生原因可能与 DNA错配修复基因(mismatch repair，MMR)的缺陷有关。近年来，肿瘤遗传学的 研究表明基因的不稳定性是人类癌症多步骤发生 过程中最重要的环节。MMR的突变及功能异常造 成 RER不断累积，导致微卫星 DNA序列的改变， 使其不能发挥正常调控作用，而导致肿瘤的发生。 自1993年在遗传性非息 肉性结、直肠癌 中发现 MSI以来，很多学者又发现在胃癌等人类肿瘤中同 样具备MSI。国外资料 ，9 J表明，在人类散发性胃 癌中MSI发生率大多在 13．0％一44．0％，国内报 道l10,11 JMSI发生率为23．3％一58．8％。 研究表明，MSI在 胃癌中也是一频发事件，平 均发生率为 33．9％。本研究选择了涵盖 9号染色 体全长的10个微卫星位点，对山西地区55例伴有 高级别上皮内瘤变的胃癌患者进行微卫星不稳定 性分析。结果显示 55例胃腺癌组织中MSI总发生 率为38％，高级别上皮 内瘤变组织中 MSI总发生 率为 28％。提示 MSI与胃癌的发生发展过程关系 密切，说明 MSI可能为胃癌发生过程中的早期分子 事件，并且 在 胃癌发 展过 程 中持续 发挥 作用。 D9S175位于染色体9q13+q31，邻近PCSK5基因，此 基因编码 subtilisin—like蛋白，对它的研究较少见，与 肿瘤发生发展过程的相关性不明。本研究结果显 示，在高级别上皮 内瘤变组织 中 D9S175位点 的 MSI发生率为 38％，胃腺癌组织 中其发生率为 48％。提示 D9S175位点与胃癌的发生关系密切， 其附近可能存在有与胃癌发生发展相关的抑癌基 因。 在胃腺癌组织中D9S171位点的MSI发生率为 50％，高于本研究中的其他位点。D9S171位于 p16 基因上游与另一相邻抑癌基因 p15之间，其 MSI的 发生提示该位点重复序列的改变可能激活特定的 维普资讯 http://www.cqvip.com · 610 · 山西医科大学学报 (J Shanxi Med Univ)2008年 7月，39(7 癌基因或使p15和p16基因突变失活，导致癌变发 生及进展。 MSI与胃癌临床病理的关系目前尚存在争议， 文献报道也不尽一致。但很多学者认为 MSI多见 于多发胃癌，多位于胃窦部，少有淋巴结转移，恶性 程度较低，预后较好。本研究发现，MSI的发生率 与胃癌患者的性别、淋巴结是否转移、肿瘤大小及 组织病理分型无关(P>0．05)，而与胃癌的家族史 和肿瘤的发生部位有关(P<0．05)。中、高分化腺 癌的 MSI阳性率显著高于低分化腺癌，提示 MSI 阳性的胃癌恶性程度较低，对预测胃癌的预后有一 定意义。结果显示，胃窦癌较贲 门癌更易发 生 MSI；有消化道家族史病例的 MSI阳性率明显高于 无家族史的病例。MSI的发生率和肿瘤的发生部 位及是否与胃癌家族史有关，目前还没有结论，有 待于大样本的进一步研究。国内对胃癌 MSI的研 究资料较少，且结果不一致，这可能与遗传背景、研 究对象的数量、选择微卫星位点的位置和数 目有 关。 胃黏膜高级别上皮内瘤变被认为是胃癌的癌 前病变，与胃癌的发生有密切关系。部分胃癌的发 生可能是癌前病变过程中一系列基因变异积累的 结果。国内外关于高级别上皮内瘤变 MSI的报道 较少，本研究中高级别上皮内瘤变组织中的MSI总 发生率为 28％，这与 Lee等[12]报道 的结果相似。 在高级别上皮内瘤变中，MSI的发生率与胃癌的家 族史有关(P<0．05)。MSI在高级别上皮内瘤变中 的存在，提示在胃癌癌前病变阶段已出现基因的不 稳定现象，这是 胃癌发生前的早期的分子异常事 件，在胃癌的发生过程中扮演重要角色。高级别上 皮内瘤变组织中MSI的分析将有助于胃癌发生危 险性的预测，对伴有 MSI的患者进行定期随访，可 能会有助于早期胃癌诊断率的提高。 MSI是胃癌发生过程中的常见改变，是基因组 不稳定的一个标记；MSI可能是部分胃癌发生发展 和演进的另一机制，可能是胃癌多步骤发生过程中 的早期分子事件。研究胃癌和高级别上皮内瘤变 组织中MSI的存在情况，可以从基因组不稳定的角 度探讨胃癌的发生机制。MSI能否作为胃癌的早 期诊断指标及 MSI与胃癌临床病理生物学行为的 关系仍需作大量的深入研究。进一步明确 MSI胃 癌的生物学特征，及其与胃癌相关的癌基因、抑癌 基因的关系，这将对 胃癌的诊断、治疗和预后产生 积极的作用。 参考文献： 【1] 徐光炜，郑芝田．胃肠病学[M]．2版．北京：人民卫生出版社， 1993：356． [2] Rugge M，Bersain G，Bertorelle R，et a1．Microsatellite instability and gastric non-invasive neoplasia in a high risk population in Ce· sena[J]．J ClinPathol，2005，58(11)：805—810． [3] Tavassoli FA，Devilee P．World health organization classification of tumors[Mj．Lyon：IARCPress，2003：261． [4] YamadaT，KoyamaT，OhwadaS，et a1．Frameshiftmutationsin the N正 恤 Dl gene in primary gastric cancer with high-fre— quencymicrosatelliteinstability[J]．Cancer Lett，2002，181(1)： l15—120． [5] Furlan D，Casati B，Cerutti R，et a1．Genetic progression in spo— radic endometrial and gastro intestkM c．allcers with high mi· crosatellite instability[J]．J Pathol，2002，197：603—609． [6] Mori Y，Sato F，Selaru FM，et a1．Instability typing reveals U· nique mutational spectra in microsatellite-unstable gastric cancers lJ J．Cancer Res，2002，62：3641—3645． [7] Sasaki K，Bertrand O，Nakazkwa H，et a1．Cell-type-specific ras mutations but microsatellite instability in chemically induced mouse skin tumors and transformed 3T3 cells[J]．Cancer Res， 1995，55(4)：3513～3516． [8] An C，Choi IS，Yao JC，et a1．Prognostic significance of CpG is— lan d methylator phenotype an d microsatellite instability in gastric carcinoma[J]．Clin Cancer Res，2005，11(8)：656—663． [9] WuM，SmabaS，OueN，et a1．Ⅸ F／1<一rasmutation，microsatd· lite，instability，and pron~ter h~ ethylation of hM】朐 ／MGMT in htmaan gastric ca 啪 s[J]．Gastric Qmcer，2004，7(6)：246— 253． [10] 徐盘，杨秀颖 ，刑军，等．胃癌微卫星不稳定性和 hMS} 基因 表达的研究[J]．中国全科医学，2002，5(12)：963～965． [11] 邵云，刘平，赵志泉，等．胃癌组织微卫星不稳定性的研究[J]． 南京医科大学学报，2003，23(4)：347～349． 1l2 J Lee J H，Abraham SC，Kim HS，et a1．Inverse relationship be— twe tm APC gene mutation in gastric adenomas and development of adenocarcinoma[J J．Am J Pathol，2002，161(2)：611—618． 作者简介： 庞瑾昱，女，1980—07生，在读硕士． [收稿日期： 2008—03—20] 维普资讯 http://www.cqvip.com