多西紫杉醇PLGA_nHA复合微球的制备及体外释放研究

文章编号： 1005- 8982（2009）19- 2946- 05 ·论著· 多西紫杉醇 PLGA/nHA复合微球 的制备及体外释放研究* 李 像 1，魏 坤 1，罗 云 2，高 新 2，赵 娜 1，郭武生 1 （1 .华南理工大学材料科学与工程学院，广东 广州 510641； 2.中山大学附属第三医院 泌尿外科，广东 广州 510630） 摘要：目的 制备多西紫杉醇（DTX）聚乳酸羟基乙酸（PLGA）/ 纳米羟基磷灰石（nHA）复合微球，研究纳米 羟基磷灰石对复合微球的载药量，包封率和体外释放等性质的影响，以及抑制前列腺癌细胞的增长效应。 方 法 以疏水性抗癌药物多西紫杉醇作为模型药物，采用单乳化溶剂挥发法（S/ O/W）制备 PLGA/ nHA- DTX 复 合微球，对载药前后的纳米羟基磷灰石进行透射电子显微镜观察和 FTIR 分析，并采用扫描电镜、激光粒度仪 和高效液相色谱对微球的载药量、包封率、粒径及体外释药性质进行研究。结果 FTIR 结果 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明纳米羟基磷灰 石对多西紫杉醇有较强的吸附作用。PLGA/ nHA- DTX复合微球的载药量和包封率分别为 3.92%和 88.7%，较 之单纯的 PLGA- DTX微球均有很大的提高。经过体外释放药物突释后，复合微球比单纯 PLGA微球的药物释 放慢。在第 30 d时，复合微球和单纯的 PLGA微球累积药物释率放分别为 62.40%和 72.70%。MTT 实验结果显 示 PLGA/ nHA复合微球对癌细胞增长的抑制效果优于单纯 PLGA微球和药物。 结论 与单纯的 PLGA- DTX 微球相比，由于纳米羟基磷灰石对多西紫杉醇存在较强的吸附作用，使 PLGA/ nHA- DTX 复合微球的载药量 和包封率得到了较大的提高，具有更好的药物缓释效果，抑制癌细胞增长的作用更有效。 关键词：多西紫杉醇;乳酸 - 羟基乙酸共聚物;羟基磷灰石;复合微球;药物释放 中图分类号：R943 文献标识码：A Preparation and in vitro release of Docetaxel loaded PLGA/ nHA microspheres* LI Xiang1, WEI Kun1, LUO Yun 2, GAO Xin 2, ZHAO Na1, GUO Wusheng1 (1.College of Materials Science and Engineering, Materials, Ministry of Education, South China University of Technology, Guangzhou 510640; 2. Department of Urology of Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou Guangdong, 510630 P.R.China) Abstract:【Objectives】To prepare docetaxel (DTX) loaded PLGA/nHA microspheres, research the effect of nHA on drug loading, encapsulation efficiency, in vitro of composite microspheres and inhibiting the growth of prostate cancers.【Method】PLGA/nHA-DTX composite microspheres were prepared by a single-emulsion solvent evapora－ tion method (S/O/W), with hydrophobic anticancer docetaxel as model drug. nHA and drug-loaded nHA were ana－ lyzed by TEM and FTIR, and drug loading, encapsulation efficiency, size and in vitro release of microspheres were studied with SEM, laser particle size analyzer and HPLC, etc. 【Results】The results show that nHA have a strong adsorption with DTX. Drug loading and encapsulation efficiency of PLGA/nHA-DTX composite microspheres were 3.92% and 88.7%, and have greatly improved compared to neat PLGA-DTX microspheres. After initial burst, com－ posite microspheres released more slowly than neat PLGA microspheres. At the 30d after in vitro release, the cumu－ lative release rate of composite microspheres and neat PLGA microspheres were respectively 62.40% and 72.70%. Cytotoxicity test results showed that PLGA/nHA composite microspheres had better effect than PLGA microspheres and 收稿日期：2009- 08- 03 *基金项目：中国高新技术 计划 项目进度计划表范例计划下载计划下载计划下载课程教学计划下载 （No：2007AA021807）、（No：2007AA021908）；中国自然科学基金重点项目（No：50732003） [通信作者] 魏 坤，E- mail：weikun@scut.edu.cn 第 19卷第 19期 中国现代医学杂志 Vol. 19 No. 19 2009年 10月 China Journal of Modern Medicine Oct. 2009 2946· · 第 19期 李 像，等：多西紫杉醇 PLGA/nHA复合微球的制备及体外释放研究 多西紫杉醇又名紫杉特尔（Taxotere）或泰索帝， 可抑制微管解聚和纺锤体形成，通过干扰细胞的有 丝分裂使其停止于分裂中期而抑制细胞增殖。该药 对卵巢癌、乳腺癌、肺癌和前列腺癌具有良好的疗 效[1，2]。因为其水溶性很差，目前注射剂泰索帝浓溶 液中含有大量的吐温 80，临床应用易引发严重过敏 反应。另外由于单用药物治疗毒副作用大，因而有必 要研发新的多西紫杉醇药物输送系统。国内外载多 西紫杉醇的药物载体的报道很少，主要集中在 PLA、 PLGA、glycol chitosan、脂质体和白蛋白等纳米粒子 作为载体。虽然这些纳米粒载体系统具有独特的靶 向性和提高药物稳定性、减少毒副作用等特点，但是 这些载体释放药物时间都比较短，最短的 1、2 d，最 长的为 15 d左右[3，4]。因此，需要研究更长释药时间 的载体。 无机材料羟基磷灰石（HA）由于具有良好的生 物相容性和生物活性而被广泛用作药物控释载体研 究[5～8]，然而这种载体只是通过吸附或机械混合的方 式载药，释放时总是在初始阶段造成大量的突释，随 后的释放速度很慢甚至没有，不能满足长效局部给 药的目的。而聚合物微球具有方便的控制药物释放 的优势，另外还能在一定程度上增强无机材料的机 械性能[9～11]。因此，无机材料 /聚合物材料的复合微 球能综合两种材料的长处，为长效控释给药提供新 的途径。 PLGA由于具有良好的生物相容性和生物降解 性而被广泛用作药物载体，但其有一个缺点是因降 解产物呈酸性，pH值降低而易致发炎。生物陶瓷羟 基磷灰石（HA）在水溶液中释放碱性离子，可以用来 中和 PLGA降解产物的酸性，另外还可以提高材料 的生物活性。因此，可以用在 PLGA载体材料中引入 HA解决酸性问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 [12]。最近关于 PLGA和 HA共同作 为载体报道很多[12～20]，但都是以水溶性药物为模型 研究。本文以脂溶性抗癌药多西紫杉醇为模型，采 用单乳液挥发法制备 PLGA和 PLGA/nHA微球，利 用纳米羟基磷灰石对药物吸附作用，提高药物的包 封率，起到长效缓释给药的效果。 1 实验 1.1 微球的制备 1.1.1 PLGA微球的制备（O/W） 称取 0.9 g PLGA （50∶50，Mw3万，济南岱罡生物有限公司）溶于 6 mL二氯甲烷，再加入 50 mg Docetaxel（北京益康思 达医药科技有限公司）作为油相，将上述溶液迅速倒 入相对于二氯甲烷体积大得多含 0.4%（W/V）乳化 剂甲基纤维素（M450）的去离子水溶液中，形成W/O 乳液，以一定速度搅拌，挥发溶剂二氯甲烷直至挥发 完全；静置 4 h后以 10 000 r/min的速度离心，分离 出沉淀，以去离子水洗涤 3次，然后置于冷冻机中真 空状态下冷冻干燥 36 h以上至完全脱水，所得微球 颗粒干燥状态下保存。 1.1.2 PLGA/ nHA微球的制备（S/ O/W） 取 50 mg Docetaxel 溶于 30 mL二氯甲烷中，再加入 0.25 g nHA纳米粒子超声 10 min,再磁力搅拌 24 h混合均 匀，形成半透明的乳液，然后 40℃干燥，除去 DCM。 将载 Docetaxel的 nHA干粉末加入到溶有 0.9 g PL- GA的 6 mL二氯甲烷溶液中，10 000 r/min高速搅拌 1 min，充分混合分散后，形成 S/O乳液，将上述混悬 液迅速倒入相对于二氯甲烷体积大得多的含 0.4% （W/V）乳化剂甲基纤维素的去离子水溶液中，得到 S/O/W乳液，剩下的处理过程与 1.1.1相同[21]。 1.2 纳米羟基磷灰石的结构表征 载药前后纳米羟基磷灰石形貌和微观结构通过 透射电子显微镜（TEM，H- 7650型，日立公司）对样 品进行观察。药物与 nHA相互作用通过傅里叶转换 红外光谱仪（FTIR，Nexus 型，美国 Nicolet 公司）分 析。 1.3 微球的物化性质表征 用扫描电子显微镜（SEM，Nova NanoSEM 430， FEI公司）观察所得微球的外观形貌及分散性。采用 激光散射粒度分布测试仪（LA- 950型，日本 Hortiba 公司）分析所得微球的平均粒径和粒径分布。 1.4 载药量及包封率测定 精密称取一定量的载药微球，加 1 mL二氯甲烷 溶解，然后加入 5 mL乙腈与磷酸溶液（2 mmol/L）的 DTX to inhibit cancer cell growth. 【Conclusion】 Because nHA has a strong adsorption with DTX, PLGA/nHA- DTX composite microspheres compared to neat PLGA-DTX microspheres enhance drug loading and encapsulation efficiency, and have better drug delivery effect. The effect of inhibiting the growth of cancers of the composite micro－ spheres is also better. Key words: Docetaxel; PLGA; hydroxyapatite; composite microsphere; drug delivery 2947· · 混合溶液（50∶50，V/V），在通氮气的条件下旋涡搅 拌5min，使二氯甲烷蒸发完全至溶液澄清，采用 HPLC法（HPLC，LC- 10A型，日本岛津公司）测定其 中多西紫杉醇的含量。色谱条件如下：Diamonsil C18 （200 nm×4.6 mm，5μm） 流动相乙腈 / 水 =65/35；流速：1.0 mL/min；柱温：30℃；检测波长：230 nm。以峰面积（Y）对对照溶液浓度（X，mg/L）回归得 到 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 曲线：Y=16.531X- 6.3176，r2 =0.9999。 1.5 体外释放 称取微球 15 mg，用 5 mL释放介质（pH 为 7.4 的 PBS和 0.1%W/V吐温 80）分散，置透析袋内，精 密封口后混悬于 15 mL释放介质中，在 37℃恒温水 浴振荡器上以 80 r/min速度振荡，定时取出 10 mL 释放液，并补充 10 mL新鲜的释放介质。取出的释 放液的检测与测包封率相同。 1.6 细胞培养及体外毒性实验（MTT法分析） 前列腺癌细胞系 PC- 3（american type culture collection）加入培养基，在 37℃、5％二氧化碳和 95％ 的湿度下培养，细胞的汇合度大于 90％后，用含有 EDTA的 0.25％的胰蛋白酶消化后传代。细胞毒性实 验使用 cck8法进行评价。人前列腺癌细胞系 PC- 3， 接种于 96孔细胞培养板，细胞密度为 5×103cells/ 孔。培养 24 h，待细胞贴壁后，去除培养基；加入 200 μL 稀释于培养基中的不同浓度的微球（PL- GA/nHA- DTX、PLGA- DTX、DTX 和 PLGA/nHA），浓 度从 0.4 ng/mL到 32.0 ng/mL，培养 96 h后，小心吸取 培养基，用 PBS洗涤 2次，加入 100μL新鲜培养基和 10μLcck8溶液，培养 2 h，在酶标检测仪上，450 nm 处测OD值。每孔做 3个复孔，重复 3次。细胞抑制率 的计算公式：细胞抑制率（%）=（Ac- As）/（Ac- Ab）× 100%。As：实验孔，含细胞 +培养基 +cck8+毒性物质； Ac：对照孔，含细胞 +培养基 +cck8；Ab：空白孔，含培 养基 +cck8。使用 GraphPad Prism 5.01软件拟合曲 线，计算各种微球的 IC50。 2 结果与讨论 2.1 nHA载药前后的形貌和粒径分析 从图 1透射电子显微镜观察，纳米 HA（ 模板 个人简介word模板免费下载关于员工迟到处罚通告模板康奈尔office模板下载康奈尔 笔记本 模板 下载软件方案模板免费下载 法 制备，未烧结）的形状是无规则形，粒径在 20～50 nm，在 PEG作用下分散均匀。载药后纳米羟基磷灰 石粒径明显变大，这是因为药物通过吸附，包裹在纳 米 HA的表面。 2.2 纳米羟基磷灰石的红外分析 图 2a HA的红外光谱中，472、565、602、962 和 1 035/cm对应的是 PO43- 的振动峰，在 3 570/cm和 630/cm，是 O- H的伸缩振动和弯曲振动峰[22]。图 2c 中 709/cm是 DTX的芳氢面外弯曲振动峰，峰很尖 锐，为特征峰。图 2c是载 Docetaxel的 HA纳米粒子 的红外光谱，709/cm虽有所减弱，但还是清晰可见， 可以证明 HA纳米粒子已吸附 DTX，另外与 HA的 红外光谱相比，3 570/cm和 630/cm的峰逐渐减弱或 发生位移，从 HA和 DTX的结构式判断，HA的 OH- 易与 DTX的 O- H和 N- H生成氢键[21]，归于氢 键效应，也是 HA纳米粒子吸附 DTX的主要机制。 图 2 a、b、c分别为 nHA、nHA DTX和 DTX的 FTIR光谱图 2.3 微球表面形貌观察和分析 图 3显示 PLGA微球表面光滑，形态规整，看不 到有明显的的孔。与 PLGA微球相比，从图 3（c、d） 看出 PLGA/nHA复合微球表面略显“粗糙”，粒径分 散更均匀，表面明显吸附有部分晶体颗粒，同时还有 颗粒脱落后形成的孔洞，图中单个复合微球的 SEM 照片更显示了这种表面形貌。这是由于乳液挥发过 程中，nHA晶体扩散出来而形成的。较多的 nHA晶 体突破球壁在表面形成孔洞，造成一种多孔性的表 面结构。 2.5 微球粒径大小、载药量和包封率 表 1显示，PLGA- DTX微球和 PLGA/nHA- DTX 微球的的平均粒径分别为 37.40μm和 53.88μm， 这与 SEM微球结果相吻合。PLGA- DTX 和 PL- 图 1 a 和 b分别为 nHA和载药 nHA的 TEM图 中国现代医学杂志 第 19卷 波数（/cm） 吸 光 度 吸 光 度 吸 光 度 2948· · 第 19期 李 像，等：多西紫杉醇 PLGA/nHA复合微球的制备及体外释放研究 GA/nHA- DTX 微球的包封率分别是 83.50%和 88.70%，这说明 HA纳米粒子的加入，提高了微球对 药物的包封率。 表 1 微球粒径大小、载药量和包封率 2.6 体外释放 图 4是微球的体外释放曲线，在药物释放第 1 天，PLGA- DTX微球释药 11.13%，无明显突释效应， 而 PLGA/nHA- DTX释放达 19.67%，存在突释。这可 能是由于 PLGA- DTX微球表面吸附的 DTX较少， 而 PLGA/nHA- DTX微球表面有较多的吸附药物的 nHA；另一个原因是复合微球表面有多孔，微球内一 部分药物可能扩散出来。突释过后，PLGA/nHA- DTX 微球的药物释放速率小于 PLGA- DTX微球，这主要 是 HA纳米粒子对 DTX较强的吸附作用，使得复合 微球的药物释放较慢。第 30天时，PLGA- DTX微球 药物释放 72.70%，PLGA/nHA- DTX为 62.40%，这说 明两种微球都能达到长期缓释效果，但复合微球药 物释放速度慢于单纯 PLGA微球。 图 3 PLGA- DTX微球（a）（b）和 PLGA/nHA- DTX（c） （d）微球的 SEM图 图 4 微球体外释放曲线 2.7 MTT实验 图 5 不同浓度的 PLGA/nHA- DTX、PLGA- DTX、 DTX和 PLGA/nHA对 PC- 3细胞增值的影响 图 5 显 示 含 有 等 量 Docetaxel 的 PL- GA/nHA- DTX、PLGA- DTX和 DTX均可显著抑制前 列腺癌细胞 PC- 3细胞的增殖，且随着浓度的增高， 抑制作用更明显；而对应浓度的 PLGA/HA对前列 腺癌细胞的增殖影响较小，说明 PLGA/nHA对前列 腺癌细胞的增殖影响很小。表 2所示，PC- 3细胞与 各种 PLGA微球及 DTX共培养 96 h 后，与单用 DTX相比，PLGA- DTX的 IC50轻度减少，由 5.459 ng/mL减少到 4.994 ng/mL，但是差异无显著性（P > 0.05）；而 PLGA/nHA- DTX复合微球的 IC50显著减 少，由 5.459 ng/mL减少到 3.686 ng/mL，差异有显著 性 （P <0.05）；PLGA- DOC 微球与复合微球 PL- GA/HA- DOC 相比较，IC50 由 4.994 ng/mL 减少到 3.686 ng/mL，差异有显著性（P <0.05），说明加入 nHA后的复合微球比 PLGA- DTX微球更有效地抑 制了前列腺癌细胞的增殖。 表 2 DTX、PLGA- DTX和 PLGA/nHA- DTX的 IC50（x±s） 注：1）与 DTX相比，P <0.05； 2）与 PLGA- DTX相比较，P <0.05。 3 结论 以疏水性抗癌药 Docetaxel作为模型药物，采用 O/W 和 S/O/W 单乳化溶剂挥发法分别制备 PLGA- DTX微球和 PLGA/nHA- DTX复合微球。单 纯 PLGA微球球形圆整，表面光滑，而复合微球表面 略显“粗糙”，是由于 nHA晶体的扩散出球壁形成多 孔。 与单纯 PLGA载药微球相比，由于 HA纳米粒 子和 DTX发生 H键作用对药物有着较强的吸附， 在一定程度上提高了 PLGA/nHA- DTX复合微球对 药物的包封率，使药物缓释更慢，1个月复合微球的 微球 平均粒径（μm） 跨距 载药量（%） 包封率（%） PLGA- DTX 37.40 1.3485 4.68 83.50 PLGA/nHA- DTX 53.88 1.3728 3.92 88.70 a b c d 80 70 60 50 40 30 20 10 00 5 10 15 20 25 30 DT X 累 积 释 放 率 （ %） 时间（d） PLGA- DTX PLGA/HA- DTX 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 - 0.2 0.4 0.8 4 8 16 32 抑 制 率 多西紫杉醇浓度（ng/mL） DTX PLGA/nHA- DTX PLGA/nHA PLGA/- DTX 组别 孵育 96 h的 IC50（ng/mL） DTX 5.459±1.099 PLGA- DTX 4.994±1.109 PLGA/nHA- DTX 3.686±1.1031）2） 2949· · 药物累积释放 62.40%。MTT 实验结果表明 PLGA/nHA- DTX复合微球对癌细胞增长的抑制效 果优于单纯 PLGA- DTX 微球和 DTX。因此， PLGA/nHA复合微球有希望作为一种新的长效药物 释放载体，为 Docetaxel治疗前列腺癌开辟了一条新 途径。 参 考 文 献： [1] 李高峰,李桂生,宁四海.国产多烯紫杉醇及联合顺铂治疗小细胞 肺癌临床研究[J].中国医学工程,2005,13(6):622- 625. 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