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首页 分子病理学-细胞凋亡及检测技术ppt课件

分子病理学-细胞凋亡及检测技术ppt课件.ppt

分子病理学-细胞凋亡及检测技术ppt课件

爱问超人
2019-04-23 0人阅读 举报 0 0 0 暂无简介

简介:本文档为《分子病理学-细胞凋亡及检测技术ppt课件ppt》,可适用于医药卫生领域

细胞凋亡及检测技术智汇文库*概述细胞凋亡过程细胞凋亡的调控细胞凋亡与疾病细胞凋亡的检测*概述*一、细胞死亡的模式■Necrosis=细胞病理性死亡■Apoptosis=细胞自发性死亡坏死凋亡*Conceptofapoptosis:体内外生理或病理因素触发细胞内死亡程序rarr细胞死亡*细胞坏死与细胞凋亡的区别*细胞凋亡与细胞坏死的区别特征细胞凋亡细胞坏死诱导因素生理及弱刺激强烈刺激受累范围单个细胞丢失成群细胞死亡膜完整性保持到晚期早期即丧失细胞体积减小、固缩增大肿胀染色质凝聚成半月形稀疏成网状细胞器无明显变化肿张破坏溶酶体保持完整破坏外溢细胞形状形成凋亡小体破裂成碎片基因组DNA有控降解随机降解大分子合成一般需要不需要基因调控有无后果不引起炎症反应引起炎症反应意义生理死亡方式病理死亡方式*凋亡的生理学意义:■胚胎发育期去除某些细胞■维持内环境稳定增殖细胞群中细胞去除、去除潜在有害的自身反应性淋巴细胞■参与防御反应细胞毒T细胞凋亡过多或不足rarrrarr疾病:肿瘤、艾滋病、神经变性性疾病、缺血性损伤*二、凋亡时细胞的主要变化形态学改变(Themorphologiccharacteristicsofapoptosis)凋亡细胞(实体细胞)与周围细胞脱接触胞膜空泡化(Blebbing)细胞固缩(Condensation)、核固缩和发芽凋亡小体(Apoptoticsmallbody)*(扫描电镜)正常细胞(扫描电镜)(透射电镜)凋亡细胞mdash凋亡小体*DNA片断化caspase激活灭活凋亡抑制物水解活性蛋白水解结构蛋白CaMgZn①②③生化改变(Thebiochemicalcharacteristicsofapoptosis)钙超载*■DNA片段化(DNAladdingpattern)核酸内切酶激活核小体连接区DNA降解~bp整数倍的DNA片段*■细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻*细胞凋亡过程cAMPCa神经酰胺凋亡诱因凋亡信号转导凋亡基因激活细胞凋亡凋亡细胞清除受体死亡信号DNase活化Caspases活化darr∶DNA片断darr凋亡小体形成巨噬细胞吞噬、分解*细胞凋亡的调控㈠细胞凋亡相关因素诱导性因素大量糖皮质激素darr淋巴细胞凋亡射线高温强酸强碱乙醇抗癌药物CTL分泌粒酶HIVrarrCD细胞凋亡*抑制性因素细胞因子(ILNGF)激素(ACTH睾丸酮雌激素)金属阳离子(Zn)药物(苯巴比妥半胱氨酸酶抑制剂)病毒EB病毒牛痘病毒*(二)细胞凋亡信号的转导*细胞凋亡的两条通路:死亡受体途径、线粒体途径*()死亡受体途径(deathreceptorpathway)死亡受体(deathreceptor,DR)肿瘤坏死因子受体超家族成员跨膜蛋白与相应配体结合传递细胞信号Fas(CD),TNFR,RAILRDR*参与死亡受体信号转导的接头蛋白:死亡结构域蛋白(deathdomainprotein,DD)TRADD:TNF受体相关死亡结构域蛋白TNFTNFR(死亡结构域)TRADDrarrrarr细胞凋亡FADD:Fas相关死亡结构域蛋白FasLFas(死亡结构域)FADDrarrrarr细胞凋亡*FasLFas凋亡诱导复合物(DISC)FADD(C端DD结构域与Fas胞内段结合N端DED结构域与无活性caspase酶原交联)caspase酶原聚集到复合物上一系列caspase激活细胞凋亡*FADD(Fasassociateddeathdomain)DD(deathdomain)DED(deatheffectordomain)FSALFADDProcaspaseCaspaseCaspaseProcaspaseFasDEDDEDDD**()线粒体途径线粒体释放细胞色素Crarrrarr细胞凋亡PT孔开放rarr线粒体跨膜电位darr细胞色素C释放促凋亡蛋白Bax促PT孔开放抗凋亡蛋白Bcl、Bclxl抑制PT孔开放*细胞色素CApafcaspase前体mdash凋亡小体召集并激活caspaserarrrarr细胞凋亡Apaf:凋亡蛋白酶活化因子*线粒体途径(mitochondrialpathway)*Caspase特点:(Cysteineasparticacidprotease)以酶原的形式存在受激活后内部的天冬氨酸残基水解形成大、小亚基聚集成四聚体而活化Caspase依赖的细胞凋亡*Caspase家族的分类凋亡启动亚类Caspase蛋白酶:CaspaseCaspaseCaspase凋亡效应亚类Caspase蛋白酶:CaspaseCaspaseCaspaseICE(interlukinbetaconvertingenzyme)亚类Caspase蛋白酶:参与炎症反应CaspaseCaspaseCaspaseCaspase,CaspaseCaspaseCaspase*■Caspase通路分类启动亚类(Caspase,,)效应亚类(Caspase,,)▲Caspase死亡受体途径线粒体途径**Caspase可激活CAD(caspaseactivatedDNase)核酸酶该酶在核小体的连接区将DNA切断形成约bp整倍数的核酸片段正常情况下CAD与抑制物ICADDFF结合存在于胞质中无活性Caspase活化后降解抑制物ICADCAD激活并入核降解DNA使其片段化*ProcaspaseICAD(抑制性CAD)被水解CAD(caspase活化DNA酶)活化caspaseEffectorcaspaseCaspaseProcaspase*Caspase非依赖的细胞凋亡(Caspaseindependentapoptosis)■凋亡诱导因子(AIF)线粒体蛋白AIF释放到胞质内与抑制凋亡的因子结合从而促发凋亡■钙超载*钙超载引起凋亡机制胞浆Cauarr■激活核转录因子加速凋亡相关基因的转录■激活CaMg依赖的核酸内切酶降解DNA链■激活谷氨酰胺转移酶使细胞骨架分解rarr凋亡小体细胞凋亡*(三)、细胞凋亡的调控基因(Regulatedmechanismofapoptosis)*Bcl基因(Bcelllymphomaleukemia)广泛存在于造血细胞、上皮细胞、淋巴细胞、神经细胞及多种瘤细胞Bcl家族已发现个成员可分为个亚族:Bcl亚家族:抑制细胞凋亡Bax亚家族:促进细胞凋亡BH亚家族:促进细胞凋亡**Bcl抑制凋亡机制:■抑制线粒体PT孔开放Cytc、AIF释放darr■结合和灭活Apaf阻断caspase活化■特异性结合细胞色素C■维持细胞钙稳态*p促凋亡机制:与Bcl基因相互作用下调Bcl的表达诱导线粒体内凋亡的相关蛋白(Bax等)表达并触发细胞色素C释放和caspase活化诱导死亡受体Fas表达*Cmyc双向调控凋亡调控细胞周期基因编码的蛋白是DNA结合蛋白调控基因转录。GF充足时主要激活介导细胞增殖的基因GF不足时激活凋亡基因*凋亡与疾病(Diseasesassociatedtoapoptosis)*(一)细胞凋亡不足(Apoptosisinhibition)肿瘤(Tumor)■bcl基因过表达滤泡状和弥漫性B细胞淋巴瘤染色体t()易位IgH基因与bcl基因拼接bcl基因活化细胞凋亡速率darr肿瘤发生(乳腺癌、肝癌、膀胱癌、肺癌、胶质瘤等也存在Bcl高表达)*■p基因缺失或突变p的稳定性、细胞内定位或(和)活性异常p表达或功能缺陷细胞凋亡率darr肿瘤发生■病毒的癌基因HBV编码的HBX是Caspase的强效抑制物与肝癌发生密切相关*■异常融合蛋白慢性髓细胞性白血病(CML)染色体易位t()Bcrabl融合基因(pBcrabl蛋白质)NFB活化、细胞凋亡速率darr髓系祖细胞的克隆扩增肿瘤发生*.自身免疫病(Autoimmunediseases)针对自身抗原的免疫细胞未被及时清除机体产生针对自身抗原的体液免疫和细胞免疫导致器官组织损伤。*(二)细胞凋亡过度(Apoptosisexcess)心肌缺血与缺血再灌注损伤■特点▲缺血早期以凋亡为主晚期以细胞坏死为主。▲在梗死灶的中心以坏死为主梗死灶周边以凋亡为主▲轻度缺血以凋亡为主重度缺血以坏死为主■机制▲氧化应激▲Fas通路▲p基因转录增加*心力衰竭氧化应激压力、容量负荷uarr神经内分泌失调TNF缺血、缺氧rarr心肌细胞凋亡*神经元退行性疾病阿尔茨海默氏病(Alzheimerrsquosdisease,AD)beta淀粉样蛋白钙超载氧化应激NGFdarrrarr神经元凋亡帕金森氏症(Parkinsonrsquosdisease)多发性硬化症*病毒感染AIDS细胞凋亡过度**三、细胞凋亡不足与过度并存动脉粥样硬化*细胞凋亡在疾病防治中的意义㈠合理利用凋亡相关因素诱导靶细胞凋亡放疗、化疗高热、高温减少细胞凋亡:NGF、促生长因子、抗氧化剂抑制Bcl抗凋亡作用促进促凋亡基因作用增强P促凋亡作用**㈡干预凋亡信号转导㈢调节凋亡相关基因㈣控制凋亡相关酶学机制㈤防止线粒体跨膜电位的下降*细胞凋亡的检测、细胞凋亡的形态学及流式细胞术检测、磷脂酰丝氨酸外翻分析(AnnexinV法)、线粒体膜势能(mt)的检测、DNA片断化检测、TUNEL法、Caspase活性的检测、凋亡相关蛋白TFAR的表达和细胞定位分析*、细胞凋亡的形态学检测光学显微镜和倒置显微镜未染色细胞:凋亡细胞V变小、变形细胞膜完整但出现发泡现象晚期可见凋亡小体。染色细胞:常用姬姆萨染色、瑞氏染色、苏木精染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化呈新月状附在核膜周围。荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜一般以细胞核染色质的形态学改变来评判细胞凋亡的进展情况。常用的DNA特异性染料有:HO,HoechstHO,HoechstDAPI。电子显微镜观察*NuclearmorphologicalchangesofHeLacellsinapoptosisprocess(nm)*电镜观察凋亡细胞体积变小胞质浓缩。凋亡Ⅰ期的细胞核内染色质高度盘绕出现许多空泡结构。IIa染色质高度凝集、边缘化。凋亡晚期细胞核裂解为碎块产生凋亡小体。*流式细胞术检测:*、磷脂酰丝氨酸外翻分析(AnnexinV法)****ApoptoticHeLacellswerestainedwithFITCAnnexinVPI*、线粒体膜势能(mt)的检测线粒体荧光染料:Rhodamine、DiOC()、JC、TMRM等对线粒体膜电位非常敏感其荧光的增强或减弱说明线粒体内膜电负性的增高或降低。*、DNA片段化分析细胞凋亡时染色质DNA在核小体单位之间的连接处断裂,形成bp整数倍的寡核苷酸片段,在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱(DNAladder)。*、TUNEL法***、Caspase活性检测**、凋亡相关蛋白TFAR蛋白的表达和细胞定位分析凋亡早期TFAR表达uarr并出现快速核转位现象伴随着细胞核形态学的变化持续较长时间在凋亡小体中仍然可见。利用荧光素(FITC)标记的TFAR单克隆抗体为探针进行TFAR蛋白的细胞定位分析智汇文库*DoublestaininganalysisofnuclearlocalizationofTFARinKandHeLacellstreatedwithVP*谢谢!***************************************************************************

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