分子克隆技术第二章

第二章基因工程的工具酶第一节限制性核酸内切酶一、限制性核酸内切酶的发现Restrictionendonucleases Restriction-modificationsystemsoccurinmanybacterialspecies,andconstituteadefensemechanismagainsttheintroductionofforeignDNAintothecell. Theyconsistoftwocomponents;thefirstisarestrictionendonuclease,whichrecognizesashort,symmetricalDNAsequence,andcuts(hydrolyzes)theDNAbackboneineachstrandataspecificsitewithinthatsequence.ForeignDNAwillhencebedegradedtorelativelyshortfragments.2017/2/21有关的几个概念限制(restriction)修饰(modification)宿主控制性限制(host—controlledrestriction)限制性核酸内切酶的生物学功能 Thesecondcomponentofthesystemisamethylase,whichaddsamethylgrouptoaCorAbasewithinthesamerecognitionsequencesinthecellularDNA.ThismodificationrendersthehostDNAresistanttodegradationbytheendonuclease.RestrictionendonucleasesRestrictionendonucleasesarebacterialenzymeswhichcut(hydrolyze)DNAintodefinedandreproduciblefragments.Inbacteria,theyformpartoftherestriction-modificationdefensemechanismagainstforeignDNA.Theyarethebasictoolsofgenecloning.二、限制性核酸内切酶的分类核酸酶核糖核酸酶（RNase）脱氧核糖核酸酶（DNase）核酸外切酶（exonuclease）核酸内切酶（endonuclease）1二、限制性核酸内切酶的分类1、Ⅰ型限制性核酸内切酶类型I限制性内切酶属于复合核酸酶，既具有内切酶的活性又具有甲基化酶的活性Messelson、YuanEcoKEcoB:T-G-A-N8-T-G-C-T5`----TGA*NNNNNNNNTGCT---------3`3`----ACTMMMMMMMA*CGA---------5`约1000bp切割(2)Ⅱ型酶的识别与切割顺序II型酶的识别序列一般是4-6个碱基，也有6个以上的，但没有4个以下的，这些序列具有双重螺旋对称的结构形式，换言之，这些核苷酸对的顺序是呈回文结构。EcoRⅠ：5`-------GAATTC------3`3`-------CTTAAG------5`②5`粘性末端（sticky/cohesiveend/termini)EcoRⅠ：5`----GAATTC---3`5`---GAATTC---3`3`CTTAAG5`3`---5`---CTTAAG2017/2/212、Ⅱ型限制性核酸内切酶（1）一般性质一般是37℃HaeⅢ70℃、SamⅠ25℃、TaqⅠ65℃牛血清白蛋白（BSA）和二硫苏糖醇（DTT）1单位酶活性(1unit1U)：星活性(staractivity)：EcoRⅠ*①平末端（blunt/flushend/termini)HaeⅢ：5`----GGCC-----3`5`----GGCC-----3`3`CCGG5`3`-----5`CCGGSmaⅠ：5`----CCCGGG-----3`5`----CCCGGG---3`3`GGGCCC5`3`GGGCCC5`--③3`粘性末端PstⅠ:5`---CTGCAG---3`5``---CTGCAG---3`3`GACGTC5`3`5`GACGTC---22017/2/21Cohesiveends Thoseproductsofrestrictionenzymedigestionwithprotrudingendshaveafurtherproperty;theseendsareknownascohesive,or‘sticky’ends,sincetheycanbindtoanyotherendwiththesameoverhangingsequence,bybasepairing(annealing)ofthesingle-strandedtails.Hence,forexample,anyfragmentformedbyanEcoRIcutcanannealtoanyotherfragmentformedinthesamewayandmaysubsequentlybejoinedcovalentlybyligation.Infact,insomecases,DNAendsformedbyenzymeswithdifferentrecognitionsequencesmaybecompatible,providedthesingle-strandedtailscanbase-pairtogether.Recognitionsequences Theactionofrestrictionendonucleases(restrictionenzymesforshort)isillustratedinFig.1aincludingthearchetypalenzymeEcoRIasanexample.Thisenzyme,whichactsasadimer,willonlyrecognizea6bppalindromicsequence(thesequenceisthesame,reading5’→3’,oneachstrand).TheproductofthecuttingreactionatthissiteonalinearDNAistwodouble-strandedfragments(restrictionfragments),eachwithanidenticalprotrudingsingle-stranded5’-endwithphosphategroupattached.The3’-endshavefreehydroxylgroups.（3）Ⅱ型限制性内切酶的一些特点①识别及酶切位点相同:HindⅢ：A/AGCTTHsuⅠ：A/AGCTT②识别位点相同但酶切位点不同:SmaⅠ：CCC/GGGXmaⅠ：C/CCGGGCohesiveendRestrictionenzymeproductswithsingle-strandedterminiaresaidtohavecohesiveor‘sticky’end,sincetheycanannealbybasepairingtoanyotherfragmentwithacomplementaryterminus. A6bprecognitionsequencewilloccuronaverageevery46=4096bpinrandomsequenceDNA;hence,averylargeDNAmoleculewillbecutintospecificfragmentsaveraging4kbbysuchanenzyme.Hundredsofrestrictionenzymesarenowknown,andalargenumberarecommerciallyavailable.Theyrecognizesitesranginginsizefrom4to8bpormore,andmaygiveproductswithprotruding5’-or-3’-tailsorbluntends.Thenewlyformed5’-endsalwaysretainthephosphategroups.TheextremelyhighspecificityofrestrictionenzymesfortheirsitesofactionallowslargeDNAmoleculesandvectorstobecutreproduciblyintodefinedfragments.③酶切位点不同但产生相同的粘性末端:BamHⅠ：G/GATCCBglⅡ：A/GATCTBclⅠ：T/GATCASau3A：GATCBamHⅠ：BclⅠ：5`------GGATCA------3`3`CCTAGT5`连接5`------GGATCA-----3`3`------CCTAGT-----5`32017/2/21（4）酶切位点的计算：四核苷酸识别序列：44=256用BglⅡ(A/GATCT)酶切λDNA（49Kb）:46=409649000/4096=122365`ACTGACGCGTTGGATGAGGA3`3`TGACTGCGCAACCTACTCCT5`11495`ATGGACGCGCGTTGGCGCTCT3`3`TACCTGCGCGCAACCGCGAGA5`3、III型限制性内切酶BgaⅠ(5`—GACGC—3`）5`CATGACGCAGAAGTTAACAC3`3`GTACTGCGTCTTCAATTGTG5`三、限制性核酸内切酶的命名1973年史密斯（H.Smith）和纳桑斯（D.Nathans）提议①每一种酶都由产生并纯化生出该酶的细菌的种属名中的三个英文字母合起来代 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf ，第一个字母采用细菌属名的第一个字母，第二和第三个字母小写，采用细菌种名的前两个字母。如大肠杆菌（Escherichiacoli）用Eco表示，而Hae代表从细菌（Haemophilusaegypticus）中分离出的限制性内切酶。②第四个字母表示菌株（不一定大写）的类型，如EcoR中的R代表大肠杆菌R株。③如果一个菌株有几种限制酶，则在代表菌株的字母后用罗马数字表示。如，流感嗜血d株的三种限制酶（Haemophilusinfluenzae）HindI、HindII、HindIII表示。自己写：BaciUusamyloliquefaciensHStreptomycesalbusI第二节DNA分子片段化一、天然DNA的制备1、天然DNA的来源①染色体DNA。染色体DNA是分离目的基因和基因表达调控因子的主要材料。②病毒和噬菌体DNA。主要用于构建基因克隆载体，承载较大片段的外源DNA，经体外包装，导入受体细胞。③质粒DNA。主要用于构建基因克隆载体。④线粒体和叶绿体DNA。这是真核生物特有的染色体外遗传物质，这些DNA被用产分离目的基因和基因表达调控因子，也有可能用来构建基因克隆载体。42017/2/212、天然DNA的提取①准备生物材料。②裂解细胞。对细胞结构简单的原核生物，可用溶菌酶处理，用NaOH和SDS处理，用煮沸处理，用冰冻处理，以及用超声波处理等方法使细胞裂解。对结构复杂的动物、植物材料，首先必须将其粉碎，为此可采用液氮冻结后研磨，或用捣碎机、研钵直接粉碎，随后再参照裂解原核生物细胞的方法裂解细胞。③分离和抽提DNA。酚／氯仿／异成醇或氯仿／异戊醇等有机溶液，可使DNA与蛋白质分开，然后用乙醇或异丙醇处理含DNA的水相，使其沉淀，离心获得DNA。（问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 ：异戊醇的作用？）异戊醇的作用：是消泡，并使蛋白质层紧密，使水相和有机相分层较好。二、DNA的纯化琼脂糖凝胶电泳洗脱法适用于小剂量DNA的纯化和酶切DNA片段的回收。转移上清液到另一离心管中，加入NaAc再加入2体积无水乙醇，-20℃放置1.5min以上，4℃下以12000r／min离心20min，弃去上清液，沉淀在空气中晾干，溶于适量TE缓冲液中。DNA样品在琼脂糖凝胶上电泳分带后切取含有待纯化DNA带的琼脂糖凝胶块装入透析袋透析袋中加入适量经稀释的电泳缓冲液并且置于稀释的电泳缓冲液中电泳1～2h，使DNA脱离琼脂糖凝胶再反向电泳30s～lmin，使附着在透析膜上的DNA重新进人缓冲液中吸取透析袋的洗脱液置于离心管中离心去掉插入DNA中的EB正丁醇（或异戊醇）抽提法向DNA样品溶液中加入等体积用溶解DNA的缓冲液饱和的正丁醇，轻轻混合，待上下相液体分开后，弃去上相正丁醇。重复以上 步骤 新产品开发流程的步骤课题研究的五个步骤成本核算步骤微型课题研究步骤数控铣床操作步骤 至少一次，直至上相正丁醇无桔红色。5