Snapshot技术平台(中文)

Snapshot技术平台　　SnaPshot技术平台是AppliedBiosystems,ABI公司推出了专为检测SNP 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 的 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 软件和试剂盒可对多个SNP位点同时进行基因分型,也被称为minisequencing。该方法针对不同突变位点设计不同长度的引物SNaPshot反应后,产物通过电泳分离、五色荧光检测、Genemapper分析,可在一次电泳胶内检测多个SNP位点。这个平台是建立在3730，3130等PCR测序仪上的技术。3730XL型DNA序列检测仪一.   SnaPshot工作原理应用SNaPshot进行定点的序列分析,其基本原理遵循了DNA直接测序中的双脱氧终止法,所不同的是PCR反应中只有不同荧光标记的ddNTP。由于每个SNP位点的引物3′端都紧靠SNP点,因此每一种引物在聚合酶作用下,根据模板的的序列,只延伸一个核苷酸。然后用先进的荧光检测系统,检测延伸的那个核苷酸的种类。1．多重SNaPshot反应的工作原理：在一个SNaPshot反应体系中，针对每个待测SNP位点在其上游或下游设计一条单向的寡核苷酸引物（正向引物或反向引物），引物的Tm值要求在50度以上，在AmpliTaq聚合酶和4种不同荧光标.记的ddNTP存在的情况下,各条引物与各自互补的DNA模板结合,聚合酶在引物的3’末端延伸单个碱基反应即告终止,产物的长度为引物长度+1bp。延伸的碱基就是该样本在该位点上的基因型，其中纯合子表现为单峰，杂合子表现为双峰。为了能够分辨不同SNP的不同基因型，可在引物的5’末端加上不同长度的PolyC或PolyT，使各条引物以长度区分。经电泳将其分开。最短的引物一般设定为20bp,相邻两个SNP的引物之间长度一般相差4-6个核苷酸，以便区分。多重SNaPshot反应即利用引物间长度的差异和单碱基延伸4种荧光标记的ddNTP而最终达到区分不同SNP位点的作用,一次反应可以同时对4-5个SNP进行基因分型,是一种通量较高的基因分型的方法。图1SnaPshot实验原理图解2．多重SNaPshot反应的工作通量工作的进度取决于多重PCR和EXTENSION的条件优化过程。还有测序仪的通量也是很重要的，3730每天可以做16次96道电泳，如果每次出4个位点，那每天的通量就是6000个GENOTYPING，是中等通量的检测。二.   SnaPshot工作 流程 快递问题件怎么处理流程河南自建厂房流程下载关于规范招聘需求审批流程制作流程表下载邮件下载流程设计 1．引物的设计SNAPSHOT可以检测多重的SNP，我们一般选择4－5个位点做一个组合。现对这些目的SNP进行引物的设计。每个SNP设计3条引物，其中2条是目的片段的扩增，长度在200－500bp左右，Tm值在60度左右。第3条的引物的是延伸ddNTP,设计在SNP位点的上游或者是反向的下游。引物设计注意事项：1．同一反应管中，不同位点的引物长度必须不同，最好能相差4-6个碱基。2．引物与模板互补部分（有效引物）的Tm值至少要50(C。3．为了改变引物的长度，区分不同的位点，可以在引物的5’端加poly(dT)、poly(dA)、poly(dC)或者poly(dGACT)尾巴。这四种尾巴理论上不容易形成二级结构，并且都经过实验验证。小心：poly(dT)有可能与真核基因3’端的poly(dA)尾巴互补。4．引物在毛细管中的迁移受引物长度、碱基组成、标记的荧光染料等因素影响。引物越短，影响越显著，越有可能偏离仅仅根据片段长度预期的引物迁移距离。当引物长度小于36个碱基时，ABI强烈建议用户使用PrimerFocus试剂盒做预实验，确定各种引物在多重电泳中的精确迁移距离。5．合成长度大于30个碱基的引物时，建议采用HPLC方法纯化。6．在引物设计的时候，如果+链DNA的序列不理想，难以设计出最佳引物，请使用-链DNA设计引物。进行多重SNaPshot反应时,需多条引物和多个模板同时进行。为了保持反应的一致性,对引物的设计要求是尽量保持相近的Tm值,否则会引起非特异性产物的扩增,造成碱基误读。另外,反应混合液中不同模板和其对应引物的量还应选择合适比例。与单重SNaPshot反应相比,多重反应不但节省了反应时间,还大大减少了试剂用量,降低了反应成本。 位点 SNP PCRLEFTPRIMER TM PCRRIGHTPRIMER TM 长度 SNP1 c/t GAGCCAGAGGAGGATGTTGA 60.35 GGCTAGAAGGAGCGAGGACT 60.12 248 SNP2 C/T ACGTTGCAGTTGCCTTTCTT 59.92 GACTCTGCAGTGAGGCCCTA 60.55 210 SNP3 A/G CCTTGATACCACGTGCATTG 59.99 TTCTTCAGCCTCTGCCATTT 59.96 185 SNP4 C/G TCAAGCCCAGTCCTTTCTGT 59.84 CCCAATAGCCGTATCTGGAA 59.92 296 位点 延伸引物 TM 方向 产物长度 Ntsadded SNP1 CGATCATAGTCAGCTGGCCT 60.4 R 20 A/G SNP2 cccccccc-GGCACGGTACCTGGGCT 62.1 L 25 C/T SNP3 cccccccc-TCATCAATTGCTGAGGACAGAG 60.4 L 30 A/G SNP4 ccccccccccccc-AACTCTGGGAGATTCTCCTATTGAC 60.36 L 38 C/G2．片段扩增引物稀释,将2OD的引物稀释到100mM.加入的TE的量为660000/MW如分子量为7003，则加入660000/7003=94.2ul做试验前将一组的引物加DDH2O稀释成10mM.反应体系：用量10×Buffer(15MmMg2＋)1(LPrimer(10Mm)0.4(LdNTP(10Mm)0.3(LHotStar(5u/ul)0.1(LDNA1(LMg2＋(25Mm)0.52(LddH2O6.68(LTotalVolume10(L多重PCR反应采用Touch－down的PCR反应程序:95℃15min;94℃40s,63℃1min每个循环下降0.5℃,72℃1.5min,15个循环;94℃40s,56℃40s,72℃1.5min,25个循环;72℃8min;结束后4℃保存。PCR产物经琼脂糖电泳检测有片段的表明实验成功。多重PCR产物凝胶电泳3．PCR产物的纯化多色SNP实验的模板DNA可以是质粒，也可以是PCR产物(0.01到0.4pmol)。质粒可以直接用于反应，但PCR产物必须先作好纯化，SAP酶将残余dNTPs去磷酸化,ExoI降解游离单链引物。（1）纯化酶：SAP和ExoI（2）作用原理：SAP去除多余的dNTP和引物ExoI去除单链引物和其他单链DNA产物（3）反应体系：PCR产物6(L＋2(L酶混合液（含2USAP和2UExoI），振荡混匀（4）反应条件：37(C孵育保温1hr，然后75(C保温15min以灭活SAP和ExoI酶。纯化好的模板可以在4(C保存24hr或-20(C长期保存。4．SNaPshotPCR混合模板：如果以PCR产物作为SNaPshotPCR的模板，在纯化好后，每种各取2(L，混合。混合SNaPshot的PCR引物：每种引物在反应体系中的终浓度分别为0.2(M。混合SNaPshot的PCR引物：每种引物在反应体系中的终浓度分别为0.2(M。(每个SNP引物加1-2ul到500ulDDH2O中)SNaPshotPCR：用量((L/Sample)标准品((L)ReactionMix0.55PooledPCRProducts22PooledPrimers1.21dH2O1.32总体积5(L10(LPCR循环条件为：96(C10sec((96(C10sec(50(C(53(C)5sec(60(C30sec)(25循环(60(C30sec(4(C5．SNaPshotPCR产物的纯化在5(L上述SNaPshotPCR产物中加入0.5USAP或者1UCIP，震荡混匀，37(C保温1hr，75(C保温15min以灭活酶，4(C可保存24hr或-20(C长期保存。6．310、3100、3730电泳样品制备试剂用量((L)Hi-DiFormamide9.25GS-120LIZ0.1SNaPshot产物1总体积10.35(L95(C变性5min(迅速冰冷4min。每个电泳样本都加入了LIZ－120内标，使延伸片段的长度大小可以精确定位。图2，liz-120分子内标电泳峰形7．GeneMapper4.0软件分析图3.不同样本多重SNAPSHOT电泳结果图4.1个SNP位点的不同样本的基因型结果，G/A,AA,GG软件分析后输出数据结果 SampleName Marker Allele1 Allele2 LH005 RS1010 G 　 LH006 RS1010 G A LH007 RS1010 A 　 LH009 RS1010 G A LH010 RS1010 G A LH012 RS1010 G 　 LH014 RS1010 G A LH017 RS1010 G A LH019 RS1010 G 　 LH020 RS1010 G A LH022 RS1010 G A LH024 RS1010 G 　 LH025 RS1010 G 　 LH027 RS1010 A 　 LH028 RS1010 A 　三SnaPshot技术平台的优点1．引物和探针合成周期短，国内一周之内可以合成完毕。2．可以做多重的SNP检测，降低了成本。3．样本数量要求不要，100到1000的样本量都很适合。4．位点成功率和准确率>95％。12011080625035252015