第五章 DNA克隆用载体(1)

null第五章 DNA克隆用载体 第五章 DNA克隆用载体 第一节 载体的功能及其特征第一节 载体的功能及其特征外源DNA片段要进入细胞(受体细胞)，并在其中进行复制与 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达，必须有一个适当的运载工具将其带入细胞内并载着外源DNA一起进行复制与表达。这种运载工具称为载体(vector)。 一、载体的功能一、载体的功能1.运送外源基因高效转入受体细胞 2.为外源基因提供复制能力或整合能力 3.为外源基因的扩增或表达提供条件 二、载体必须具备下列条件： 二、载体必须具备下列条件： ①在受体细胞中，载体可以独立地进行复制。（拷贝数越高越好） 所以，载体本身必须是一个复制单位，称复制子(replicon)，具有复制起点。而且插入外源DNA后不会影响载体本身复制的能力。 null②具有合适的选择性标记，易于鉴定、筛选。也就是说，容易将带有外源DNA的重组体与不带外源DNA的载体区别开来。 null③易于引入受体细胞，具有对受体细胞的可转移性 。 在原核生物的DNA重组中常用的载体是质粒和噬菌体。酵母和动物病毒等常用作真核生物克隆的载体。 从安全角度考虑，要求载体不能随便转移，仅限于在某些 实验室 17025实验室iso17025实验室认可实验室检查项目微生物实验室标识重点实验室计划 内特殊菌种内才可复制等等。null④具有多种单一的酶切位点（多克隆位点: multiple cloning sites ，MCS） ，便于基因工程操作。 由人工构建完成。null自主复制型载体和附加载体的扩增方式 null⑤长度尽可能小，载装能力强，便于运载大的外源基因。 由人工方法去掉非必需序列。 三、载体分类三、载体分类按功能来分： 克隆载体: 克隆一个基因或DNA片断 表达载体: 用于一个基因的蛋白表达 整合载体: 把一个基因插入到染色体组中按来源来分：按来源来分：质粒载体 噬菌体载体 柯斯质粒载体 真核细胞克隆载体null载体的种类和特征第二节 质粒载体第二节 质粒载体质粒(Plasmids)是存在于细菌细胞质中独立于染色体而自主复制的共价、封闭、环状双链DNA分子（Covalently closed Circular DNA, ccc DNA），并不是细菌生长所必需的，但可以赋予细菌某些抵御外界环境因素不利影响的能力。nullnull一、质粒的大小一、质粒的大小细菌质粒的分子量相差较大，一般在5～400kb之间。 常用质粒大小在2～10kb之间。二、质粒的基本特性 二、质粒的基本特性 （一）自主复制性 质粒DNA携带有自己的复制起始区（ori）以及一个控制质粒拷贝数的基因，因此它能独立于宿主细胞的染色体DNA而自主复制。不同的质粒在宿主细胞内的拷贝数也不同，少则几个多则几百个不等，当然由于质粒上并没有复制酶的基因，所以其复制需要使用宿主细胞复制染色体DNA的多种酶群。 null质粒pBR322 DNA nullpGEX-6P-1 质粒物理图谱 nullSV40， 猴空泡病毒40 null巨细胞病毒 （CMV）（二）不相容性 （二）不相容性 利用同一复制系统的不同质粒（RNAI RNAII Rop因子）如果被导入同一细胞中，它们在复制及随后分配到子细胞的过程中，就会彼此竞争，它们在单细胞中的拷贝数也会有差异，拷贝多的复制更快，结果在细菌繁殖几代之后，细菌的子细胞中绝大多数都含有占优势的质粒，因而这两种质粒中只能有一种长期稳定地留在细胞中，这就是所谓的质粒不相容性。 null（三）可扩增性 （三）可扩增性 质粒能自主地进行复制，这样它才能随着细菌细胞的分裂而稳定地遗传。 质粒就其复制方式而言分为两类：松弛型复制及严谨型复制。 松弛型复制：拷贝数高，一个细胞中可达上千个拷贝； 严谨型复制：拷贝数低，一个细胞中一般低于5个拷贝（1个－－几个）。（四）可转移性 （四）可转移性 在天然条件下，很多天然质粒都可以通过细菌接合作用从一种宿主细胞内转移到另外一种宿主内，这种转移依赖于质粒上的tra基因产物。 三、质粒的构建 三、质粒的构建 （一） 质粒人工构建的方法 方法就是在天然质粒的基础上进行DNA重组，拼拼接接，以改变其性能。（二） 质粒人工构建的目的 （二） 质粒人工构建的目的 （1）加入合适的选择标记基因，如两个以上，易于用作选择； （2）增加或减少合适的酶切位点，便于重组； （3）缩短长度，切去不必要的片段，提高导入效率，增加装载量；null（4）改变复制子，变严紧为松弛，变少拷贝为多拷贝； （5）根据基因工程的特殊要求加装特殊的基因元件； 四、质粒的分类：四、质粒的分类：人工构建的质粒根据其功能及用途分为 1.多拷贝质粒 2.测序质粒 3.整合质粒 4.穿梭质粒 5.表达质粒 6.探针质粒 7.细菌人工染色体质粒质粒DNA的类型质粒DNA的类型1.多拷贝质粒 1.多拷贝质粒 复制子经过人工突变，除去控制拷贝数负调节基因，使质粒拷贝数达到每个细胞数千，用于扩增外源基因。 实验室常用质粒均属于此。 2.测序质粒2.测序质粒PCR产物直接用于克隆测序的载体，称为T载体。 常用： pMD 18-T Vector pMD 18-T Simple VectorpMD 18-T VectorpMD 18-T VectorpMD 18-T Vector说明：pMD 18-T Vector说明：pMD 18-T Vector是一种高效克隆PCR产物 (TA Cloning) 的专用载体。它是由pUC18载体改建而成的。在pUC18载体的多克隆位点处的Xba I 和Sal I 识别位点之间插入了EcoR V 识别位点，用EcoR V 进行酶切反应后，再在两侧的3‘端添加“T”而成。因大部分耐热性DNA聚合酶反应时都有在PCR产物的3’末端添加一个“A”的特性，所以使用本制品可大大提高PCR产物的连接、克隆效率。 nullpMD 18-T Simple VectorpMD 18-T Simple Vector说明：pMD 18-T Simple Vector说明：pMD 18-T Simple Vector是在pMD 18-T Vector的基础上进一步开发得到的，可以用于PCR产物直接克隆（TA克隆）的线性载体。与pMD 18-T Vector相比，它除去了LacZ基因上的多克隆酶切位点，但保持b-半乳糖苷酶能够正常表达。T-载体使用说明：T-载体使用说明：1. 在微型离心管中制备下述连接反应液，全量为10 ul。 （取0.5 ul进行实验也可得到满意的结果。实际操作时，可按实验需要使用适量的T载体） null2. 16℃反应30分钟（过夜反应也不影响连接效率）。 3. 全量 （10 ul） 转化至JM109感受态细胞（100 ul）中。null4. 在含有X-Gal、IPTG、Amp的L-琼脂平板培养基上培养，形成单菌落。计数白色、蓝色菌落。 5. 挑选白色菌落，使用PCR法或 （和）双酶切法确认T载体中插入片段的长度大小。使用注意问题使用注意问题1. Ligation Solution I 请于冰浴中融解。 2. 在进行克隆时，Vector DNA和Insert DNA的摩尔比一般为：1: 2 ~ 10。在本制品中， pMD18-T Vector 1 ml (50 ng) 的摩尔数约为0.03 pmol，Control Insert DNA 1 ml (50 ng) 的摩尔数约为0.15 pmol。null3. 克隆时使用的Insert DNA片段 (PCR 产物) 尽量进行切胶回收纯化，PCR产物中的短片段DNA(甚至是电泳也无法确认的非特异性小片段)、残存引物等杂质都会影响TA克隆的效率。 4. 按照本实验操作进行连接后，直接进行转化时的连接液不要超过20 ul。当进行转化的DNA用量较大或准备进行电转化时，需对连接液进行乙醇沉淀，纯化DNA后再进行转化。 null5. 连接反应请在16℃下进行，温度升高 (>26℃) 较难形成环状DNA。 6. 连接效率偏低时，可适当延长连接时间至数小时。 7. 感受态细胞可使用适合于pUC系列载体的感受态细胞，如：JM109等。 提高克隆效率的方法：提高克隆效率的方法：1. 纯化PCR产物。切胶回收的PCR片段最好。 2. 除去残存的引物等杂质。 3. DNA片段的立体结构、DNA片段的长短都会影响克隆效率。一般情况下，大片段DNA的克隆效率（连接效率与转化效率）小于短片段DNA，在使用大片段DNA的连接液进行转化时，建议采用电转化方法。PCR产物难以插入载体的原因：PCR产物难以插入载体的原因：1. 确认PCR反应使用的DNA聚合酶在PCR产物的3’端是否附加了“A”。有些DNA聚合酶扩增的PCR产物是平端，如使用TaKaRa公司的Pyrobest DNA聚合酶 等扩增得到的PCR产物不能直接用于T-A克隆；null2.PCR产物保存时间不要过长, 长时间保存的PCR产物会脱去末端的“A”碱基。 3. PCR产物中短片段杂质DNA太多，这时应切胶回收纯化DNA片段，回收时PCR产物不要在紫外线下暴露时间过长。null4. 确认感受态细胞的转化效率，使用的感受态细胞的转化效率最好大于108 cfu/mg pUC118 DNA。 5. 确认抗生素的浓度是否过大。null6. 确认Ligation Solution I 的连接效率是否降低，多次反复冻融会降低的Ligation Solution I 连接效率。 7. 最好使用新配制的平板培养基。转化后的菌落全为蓝色 (或淡蓝色) 的原因探讨：转化后的菌落全为蓝色 (或淡蓝色) 的原因探讨：插入的PCR片段较短（小于500 bp)，且插入片段没有影响lacZ基因的阅读框时，平板培养基上出现的菌落有可能呈现蓝色。pMD 18-T Simple Vector 使用特别说明：pMD 18-T Simple Vector 使用特别说明：由于载体上的多克隆位点被破坏，所以使用本载体进行克隆时，必须注意要在PCR引物上设计出酶切位点。否则难以进行亚克隆。 3.整合质粒 3.整合质粒 装有整合促进基因及整合特异序列，便于外源基因准确重组整合入受体细胞的染色体上 。4.穿梭质粒4.穿梭质粒含有原核和真核两个不同的复制子，能在原核和真核两种不同的受体细胞中复制。 null5.表达质粒5.表达质粒装有强的启动基因，合适的顺序以及有效的终止子，以便任何外源基因在受体细胞内的高效表达。6.探针质粒6.探针质粒筛选克隆或寻找基因元件，通常装有一个可以定量测定其表达的标记基因，如抗性基因。筛选启动基因、终止子等。 7、细菌人工染色体质粒7、细菌人工染色体质粒细菌人工染色体质粒是一个能插入更长的DNA片段的质粒，简称BACs(bacterial artificial chromosomes)。nullBAC载体nullBACs优点：BACs优点：它含有抗氯霉素的选择性标记(CmR)，并具有一个稳定的复制原点(Ori)，可独立地进行复制，以使其在每个细胞中保持1～2个拷贝；它可插入几百kb长的DNA片段。重组的DNA通过电穿孔法可进入宿主菌细胞。 nullnullnull五、质粒的制备 五、质粒的制备 实验室一般使用两种方法制备质粒： （一）碱裂解法 （二）沸水浴法 质粒DNA抽提的基本原理质粒DNA抽提的基本原理在细菌细胞内，共价闭环质粒以超螺旋形式(ccc DNA）存在。在提取质粒过程中，除了超螺旋DNA外，还会产生其它形式的质粒DNA。如果质粒DNA两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，形成松驰型的环状分子，称开环DNA(Open circular DNA，简称 ocDNA)；如果质粒DNA的两条链在同一处断裂，则形成线状DNA(Linear DNA)。当提取的质粒DNA电泳时，同一质粒DNA其泳动速度为： cccDNA>线状DNA>开环DNA 质粒DNA的构型：质粒DNA的构型： SC型 共价闭合环形DNA（cccDNA） OC型 开环DNA（ocDNA） L 型 线性DNA（cDNA） nullLOCSC质粒DNA抽提的基本原理质粒DNA抽提的基本原理细菌基因组均比较大，如大肠杆菌的染色体约有4700 kb长，在处理细胞过程中断裂成不同长度的双链DNA片段。当溶液的pH值调节到大于12时，双链DNA中的氢键被破坏，于是染色体DNA双链分离成单链；而超螺旋状态的质粒DNA仅仅部分氢键被破坏，只是部分双链解离成单链。再将溶液的pH值调回中性时，单链DNA互相缠绕并且与蛋白质结合生成网络状大分子，而超螺旋的质粒发生复性反应后仍然是小分子，通过离心很容易将两者分开。达到分离的目的。 碱裂解法小量制备质粒DNA 碱裂解法小量制备质粒DNA (1) 菌体的收集 a. 将培养液倒入1.5ml离心管中，12000r/min，4℃离心30s，倒尽上清液。 b. 用1ml STE Buffer悬浮菌体沉淀，再离心回收菌体。重复一次。 (2) 将沉淀悬浮于100ul冰预冷的溶液Ⅰ，强烈振荡混匀。溶液I组成溶液I组成 葡萄糖 50mM Tris-HCl 50mM EDTA 10mM 溶菌酶 5mg/mg 使用前加入。 葡萄糖的作用是增加溶液的粘度，减少抽提过程中的机械剪切作用，防止破坏质粒DNA； EDTA的作用是络和掉Mg2+等二价金属离子，防止DNA酶对质粒分子的降解作用； Tris•Cl能使溶菌液维持溶菌作用的最适PH范围null(3) 加200ul溶液Ⅱ（不超过5min，溶液现配），颠倒5次（不要强烈振荡），冰浴中放置3min。至溶液几乎澄清，成淡黄色透明粘液状。溶液II组成溶液II组成 NaOH 0.2M SDS 1.0% 使用前用母液配制。 SDS的作用是解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之变性； NaOH(pH>12)的作用是破坏氢键，使DNA分子变性。 null(4) 加150ul溶液Ⅲ，倒置离心管温和振荡10s，冰浴中放置3--5min。看到淡黄色消失，有大量白色沉淀生成，然后离心。 溶液III组成溶液III组成由KAc与HAc组成，是pH值为5.5的高盐溶液。 5mol/L乙酸钾 60ml 冰乙酸 11.5ml 能中和溶液II的碱性，使染色体DNA复性而发生缠绕并使质粒DNA复性。 K+离子会与SDS形成溶解度很低的盐并与蛋白质形成沉淀而除去。溶液中的染色体DNA也会与蛋白质-SDS形成相互缠绕的大分子物质，很容易与小分子的质粒DNA分离，此外，高盐溶液也有利于各种沉淀的形成。 null(5)常温15 000rpm离心10分钟，小心吸取上清液于另一离心管中。注意，不要把白色絮状物混入上清液中。上清液加入等体积的苯酚/氯仿(400ul)，振荡器上振荡混匀。 null细胞裂解液中的杂质除了染色体DNA外，还有各种细胞壁、膜的碎片、各种酶与其他蛋白质、脂质类杂质以及RNA等。纯化步骤应有针对性地将它们去除。离心去除各种细胞碎片；用酚处理去除蛋白质，包括各种酶；用RNA酶处理去除RNA等。 nullTris饱和酚溶液： 苯酚溶解后用10mM Tris（pH8.0）平衡至上清中的水相pH升至8.0。 酚是一种作用非常强烈的蛋白质变性剂，能非常有效地是蛋白质变性进而去除。氯仿有强烈的溶脂性，可去除脂质类杂质。酚/氯仿可节约重蒸酚。氯仿能将微量的溶于DNA水溶液中的酚抽提掉，否则微量的酚对于以后的酶切、转化等过程都会产生不利影响。抽提完成后的水溶液中仍有痕量的酚、氯仿等，可用乙醇沉淀的方法将它们除去。 null(6)常温15 000rpm离心10分钟，小心将上清液转移至另一离心管。注意不要将下层有机相混入上清液中。 上清液加入2－2.25倍体积的-20℃无水乙醇（500-600ul）或异丙醇，沉淀30min以上。也可室温下放置5min，但产量较低。null乙醇沉淀的特点是能在浓缩DNA的同时更换整个缓冲系统，但DNA会有一定的损失。由于杂质不易在乙醇中沉下，沉淀过程可在0℃进行。乙醇较异丙醇易挥发，沉淀得到的DNA比较干净。 盐等杂质易在异丙醇中沉下。沉淀DNA时加入盐类的目的是中和链上的电荷，使DNA易于形成沉淀。 null(7) 离心10--15 min，用70%乙醇（1ml）漂洗一下，稍微离心，用真空泵吸干液体，室温下放置片刻。 (8) 用50ulH2O 或 TE Buffer溶解沉淀，同时加入0.5-1ul RNaseA。 （二） 沸水浴法 （二） 沸水浴法 （1）将菌体悬浮浮在含有EDTA和Triton X-100的缓冲液中 （2）加溶菌酶破细胞壁 （3）放入沸水浴中煮40秒 （4）离心，用无菌牙签挑去沉淀物 （5）乙醇异丙醇沉淀 两种方法比较:两种方法比较:碱裂解法制备的质粒较纯，收得率高，但繁琐，且质粒中有开环现象； 沸水浴法制备的质粒不纯，收得率低，且制备规模小，但快速，特别适用于重组质粒的鉴定。null细菌 DNA 提取 null质粒 DNA 提取 方法 第三节 以噬菌体DNA 为基础的载体第三节 以噬菌体DNA 为基础的载体null噬菌体（phage）是感染细菌的一类病毒，有的噬菌体基因组较大，如λ噬菌和T噬菌体等；有的则较小，如M13、f1、fd噬菌体等。用感染大肠杆菌的λ噬菌体改造成的载体应用最为广泛。null噬菌体载体分类噬菌体载体分类一、λDNA载体 二、考斯质粒 三、M13-DNA 四、噬菌粒 一、λDNA载体一、λDNA载体λ噬菌体是大肠杆菌的噬菌体，它由外壳蛋白和λ-DNA组成 。 λ-DNA为线状双链DNA分子，两端各有一个12核苷酸的互补单链（粘性末端）GGGCGGCGAC CT， CCCGCCGCTGGA，称为cos区，全长48.5kb。 图 λ－DNA的结构 图 λ－DNA的结构 nullλ phage48.5 kb in length Linear or circular genome (cos ends) 溶菌阶段 (复制和释放) 溶源阶段 (整合到寄主染色体上)nullDNAProtein coatcoscosNonessential regionLong (left) armshort (right) armExogenous DNA (~20-23 kb)λ phage12bpλ-DNA作为载体的优点λ-DNA作为载体的优点1) λ-DNA可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效感染大肠杆菌； 2) λ-DNA作为载体，其装载外源DNA的能力为25kb，远远大于质粒的装载量； null3) 重组λ-DNA的筛选较为方便； 4) 重组λ-DNA分子的提取比质粒容易。λ-DNA的抽提λ-DNA的抽提1) 大肠杆菌培养至对数生长期（在含有乳糖的培养基中） 2) 加入λ-噬菌体或重组λ－噬菌 体悬浮液，37℃培养1小时 3) 用新鲜培养稀释，继续培养4-12小时null4) 高速离心，沉淀噬菌体 5) 苯酚抽提，释放λ-DNA 6) 乙醇或异丙醇沉淀DNA null λ噬菌体 的侵染循环 二、考斯质粒二、考斯质粒（粘性质粒，柯斯质粒，粘粒，cosmid） 考斯质粒是一类用于克隆大片段DNA的载体，它是由λ噬菌体的cos（cohesive）末端及质粒（plasmid）重组而成的载体。null cosmid载体带有质粒的复制起点、克隆位点、选择性标记以及λ噬菌体用于包装的cos末端等，因此该载体在体外重组后，可利用噬菌体体外包装的特性进行体外包装，利用噬菌体感染的方式将重组DNA导入受体细胞。但它不会产生子代噬菌体，而是以质粒DNA的形式存在于细胞内。nullCos质粒pJB8 null（二） 考斯质粒的优越性 （二） 考斯质粒的优越性 1) 能象λ-DNA一样体外包装，并高效导入受体细胞； 2) 可以装载比质粒或λ-DNA大得多的外源DNA片段，如cos区及附近顺序长为1.7 kb，质粒长为3.3kb，则该考斯质粒最大可装载46.5kb的外源DNA ；null3) 由于携带质粒的选择标记，便于筛选； 4) 由于质粒上的多种单一酶切位点，便于克隆。 null利用 Cos 质粒 进行 克隆 三、M13-DNA 三、M13-DNA M13是一种线状、单链DNA噬菌体，总长6407bp。这类载体主要用来获得大量的单链ＤＮＡ片段，这种单链ＤＮＡ片段在遗传学研究中主要用来测定ＤＮＡ序列（sanger双脱氧法）、基因的定点突变研究、异源双链DNA的分析等。 M13的侵染周期也很短，不需要插入寄主的基因。 nullM13噬菌体 的侵染循环 nullM13单链DNA噬菌体的生命周期M13噬菌体的特点M13噬菌体的特点感染Ecoli后，在宿主细胞内会形成双链的复制型ＤＮＡ（ replication form DNA，RF DNA）。可以象质粒ＤＮＡ那样在体外进行纯化和操作。 具有多克隆位点(MCS)，方便克隆。许多M13载体的多克隆位点与质粒载体pUC序列的多克隆位点是相同的，在克隆位点选择上更为方便。 nullM13克隆载体分子结构图nullRF DNAnullnull成熟的噬菌体颗粒仅能感染E.coli的F+细胞，这是因为这种噬菌体的感染位点在性菌毛上。但是无论是RF DNA或ss DNA都能转染E.coli的F+或F-细胞。 噬菌体颗粒的大小是受其ＤＮＡ的大小制约的，这一点正好与λ噬菌体相反。所以M13噬菌体并不存在包装限制的问题。nullBlue-white selection M13-DNA作为载体的优点及用途 M13-DNA作为载体的优点及用途 最为显著的优点是它能使插入的外源DNA片段变成单链， 用途： （1）用于双脱氧末端终止测定DNA顺序 （2）用于单链DNA的定点诱变 （3）用于合成探针 四、噬菌粒（Phagemid） 四、噬菌粒（Phagemid） 噬菌粒是质粒与M13-DNA的重组体，是由质粒载体和单链噬菌体载体结合而成的新型的载体系列。null具有质粒的复制起点、选择性标记、多克隆位点等，方便DNA的操作，可在细胞内稳定存在；又具有单链噬菌体的复制起点，在辅助噬菌体的存在下，可进行噬菌体的繁殖，产生单链的子代噬菌体。 由于不含包装蛋白基因，载体本身长度减少，装载量增大，比质粒大，不及λ-DNA。 null噬菌粒pEMBL8的结构 null将pEMBL8 转化为单链形式 null常用的噬菌粒载体pUC118和pUC119常用的噬菌粒载体pUC118和pUC1191.具有较小分子量的共价、闭合、环形的基因组DNA，可克隆10kb的外源DNA片段，并易于进行分离与操作； 2.编码一个ampr基因作为选择记号，因此只有携带pUC118或pUC119噬菌粒载体的大肠杆菌转化子细胞，才能够在含有氨苄青霉素的培养基中生长，便于转化子的选择；null3. 拷贝数含量高，每个寄主可高达500个，所以只要用少量的大肠杆菌细胞培养物，便可制备出大量的载体DNA； 4. 存在着一个多克隆位点区，因此许多种不同类型的外源DNA片段，不经修饰便可直接插入到载体分子上；null5. 由于多克隆位点区阻断了大肠杆菌lacZ基因的5’-端编码区，可按照IPTG组织化学显色反应试验，筛选重组子； 6. lacZ基因是置于lac启动子的控制之下，这样插入的外源基因便会以融合蛋白质的形式表达；null7. 含有质粒的复制起点，在没有辅助噬菌体的情况下，克隆的外源基因可以像质粒一样按常规的方式，复制形成大量的双链DNA分子 8. 带有一个M13噬菌体的复制起点，在有辅助噬菌体感染的寄主细胞中，可以合成出单DNA拷贝，并包装成噬菌体颗分泌到培养基中； null9. 在pUC118和pUC119这两个载体中，多克隆位点区的核苷酸序列取向是彼此相反的，于是它们当中的一个可转录克隆基因的正链DNA，另一个则可转录出负链DNA； 10. 可以直接对克隆的DNA片断进行核苷酸的序列测定，免去了从质粒载体到噬菌体的这一烦琐的亚克隆步骤。null第四节 酵母载体第四节 酵母载体一、2um质粒 二、酵母附加载体 三、酵母整合质粒(YIps) 四、酵母复制质粒(YRps) 五、酵母人工染色体(YAC)一、2um质粒 一、2um质粒 2um质粒是非常好的克隆载体，它有6kb大小，在酵母细胞中的拷贝数在70-200之间，利用质粒的复制起始位点进行复制，许多酶由寄主细胞提供，质粒中含有编码蛋白质的基因REP1，REP2。 null质粒中含有LEU-2合成基因，为了利用LEU氨酸作为选择标记，需要用到一种特殊的寄主，寄主必须是LEU-2营养缺陷体，这样的寄主只有在添加亮氨酸的条件下才能生长。 2um质粒可以在基本培养基上生长。 nullleu-作为 酵母载体的 选择标记基因 二、酵母附加载体二、酵母附加载体来自于2um质粒的载体称为酵母附加载体或者YEps。YEps可以含有完整的2um质粒，也可以只含有2um质粒的复制起点，如YEp13以后的类型。 nullYEp13是一个穿梭质粒，含有2um质粒的复制起点和选择基因LEU2, YEp13还包含pBR322的完整序列，因此可以在大肠杆菌也可以在酵母中进行选择。 nullYEp的结构 nullYEp整合到酵母染色体上 三、酵母整合质粒(YIps) 三、酵母整合质粒(YIps) 主要是细菌质粒含有一个酵母基因。如YIp5，是在pBR322的基础上插入了一个URA3基因，这个基因编码乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶，是嘧啶合成中的一个酶，可以作为选择标记，选择的方法与LEU2标记相同，YIp不能像质粒一样复制，其复制依赖于整合到酵母的染色体上，整合的机制与YEp相同。 null整合型载体 四、酵母复制质粒(YRps) 四、酵母复制质粒(YRps) 由于含有一段包括起始位点在内的染色体DNA, 可以作为独立质粒进行复制。复制起始位点与多个酵母基因距离很近，包括作为选择标记的基因。null复制型酵母载体 五、酵母人工染色体 (YAC)五、酵母人工染色体 (YAC)pYAC3是在pBR322的基础上，插入了几个酵母基因。其中两个基因是URA3和TRP1，可以作为选择标记 ; TRP1-origin-CEN4片段已经包含了人工染色体组成三部分中的两部分。第三部分端粒，有两段称为TEL的序列提供，并不是他们自身组成端粒序列，而是在引入酵母细胞核后，作为种子序列建立端粒。还有最后一部分没有提到的是SUP4，在克隆实验中作为插入片段的选择标记基因。 nullnull正常酵母人工染色体含有： * 四膜虫端粒（tel) * 酵母自主复制序列（ARS) * 酵母着丝点 (CEN) * 酵母的选择标记 (TRP1、URA1)YAC载体null 利用YAC载体克隆外源基因 YAC载体的使用 YAC载体的使用 1、一些哺乳动物的基因大于100kb（如人类膀胱纤维基因有250kb），超过了大肠杆菌载体系统的承受范围，但正好在YAC载体的范围之内。最近的研究发现，在某些情况下，YACs可以在哺乳动物中表达，因此可以在基因存在的生物中研究基因的功能。 2、构建基因文库。第五节 动物病毒载体 第五节 动物病毒载体 一些真核生物病毒能在寄主染色体上整合，可用做真核细胞克隆的载体有一些病毒特别是反转录病毒和腺病毒已经被改造成能把外源DNA导入哺乳动物细胞的“病毒载体”(viralvectors)。 null第六节 农杆菌的Ti质粒 第六节 农杆菌的Ti质粒 几乎所有双子叶植物都容易受到土壤农杆菌感染，而产生根瘤。它是一种革兰氏阴性土壤杆菌（A. tumefaciens）。其致瘤特性是由Ti（tumor－inducing）质粒介导的。 　1. Ti质粒的结构 　1. Ti质粒的结构 Ti质粒大约在160～240kB之间。其中T-DNA大约在15kb-30kb。Vir基因区在36kb左右。除此之外，Ti质粒上还存在Con区（region encoding conjugation)和Ori区（origin of replication)。 nullTi质粒的结构 2.T-DNA2.T-DNATi质粒上有一段DNA，称为T-DNA(transferred DNA，约23kb) 。T-DNA以外的一个约35kb的区域内含有毒性基因(Virulence，Vir)。该毒性基因的产物对T-DNA的转移及整合是必需的。 null当农杆菌和一个植物细胞接触时，它所含的质粒中的T-DNA片段在质粒转化入植物细胞中时，能整合到植物核染色体的随机位点，并导致冠瘿瘤的形成。这是一个罕有的原核生物DNA转移给真核细胞的例子，它代表着一种天然的遗传工程过程。null植物肿瘤－冠瘿瘤 Ti质粒3. 植物细胞转化的共整合系统 3. 植物细胞转化的共整合系统 T-DNA克隆在大肠杆菌质粒上，含有E.coli的选择标记和植物选择标记Kmr。首先在E.coli中筛选重组分子，然后将重组质粒转化到农杆菌中，质粒与Ti质粒上的同源序列发生同源重组，将外源基因整合到Ti质粒上，用于侵染植物细胞。T-DNA重组分子整合到植物细胞染色体DNA上，Kmr筛选转化细胞。 null共整合载体