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p16基因甲基化在人二倍体成纤维细胞衰老中的作用

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p16基因甲基化在人二倍体成纤维细胞衰老中的作用 �基础研究� p16基因甲基化在人二倍体成纤维细胞 衰老中的作用 陈培利 � 童坦君 � 张宗玉 � � 摘要! � 目的 � 研究 DNA 甲基化与衰老细胞中细胞周期负调控因子 p16MTS1/ INK4a高表达的关系。 � 方法 � 应用甲基化敏感的 DNA 限制性内切酶与 PCR相结合的方法, 分析特定位点的甲基化状态。 � 结果 � 人胚肺二倍体成纤维细胞衰老过程中 p16 基因表达增高,中年细胞及衰老细胞中 p16 基因 的表达水平分别约为年轻细胞的 3倍和 10 倍。p16基因外显子∀限制性内切酶S...

p16基因甲基化在人二倍体成纤维细胞衰老中的作用
�基础研究� p16基因甲基化在人二倍体成纤维细胞 衰老中的作用 陈培利 � 童坦君 � 张宗玉 � � 摘要! � 目的 � 研究 DNA 甲基化与衰老细胞中细胞周期负调控因子 p16MTS1/ INK4a高 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达的关系。 � 方法 � 应用甲基化敏感的 DNA 限制性内切酶与 PCR相结合的方法, 分析特定位点的甲基化状态。 � 结果 � 人胚肺二倍体成纤维细胞衰老过程中 p16 基因表达增高,中年细胞及衰老细胞中 p16 基因 的表达水平分别约为年轻细胞的 3倍和 10 倍。p16基因外显子∀限制性内切酶Sma ∀位点的甲基化 水平则表现出随增龄而降低的趋势,在年轻细胞、中年细胞中分别约为 64%和 41% , 虽然在衰老细胞 中仅为 24% ,但仍保持一定的水平。 � 结论 � p16基因外显子 ∀的 Sma ∀位点的甲基化水平改变可 能与其在衰老过程中的高表达有一定的关联, 其重要性值得进一步研究。 � � 关键词! � 基因, p16; � DNA 甲基化; � 细胞衰老 The role of p16 methylation in the aging of human fetal lung diploid fibroblasts � CHEN Peili, TONG Tanjun, ZHANG Zongyu. Department of Biochemistry and Molecular Biology , Peking University H ealth Science Center , Beijing 100083 , China � � Abstract! � Objective � The relationship between DNA methylation and the overexpression of cell cycle negative regulator p16MTS1/ INK4a in senescent cells was studied. � Methods � PCR amplification of p16 exon I following digestion with Sma I , a methylation sensitive DNA endonuclease, was adapted to determine the methylation status at specific site. � Results� T- he increased expression of p16 in the aging process of human fetal lung diploid fibroblasts ( 2BS) was observed. In middle�aged and old cells, the p16 level was about 3 folds and 10 folds respectively as that in young cells. The methylation level of the Sma I site in p16 exon I tended to decline with aging, being about 64% and 41% in young and middle�aged cells respectively, but still maintain relatively as high as about 24% in senescent cells. � Conclusions � The overexpression of p16 in senescent human fibroblasts might be related to the alteration of methylation level of exon I, its mechanisms need to be defined further. � � Key words! � Genes, p16; � DNA methylation; � Cell aging � � DNA甲基化是真核生物基因表达调控的重要 方式之一,它参与了细胞分化、细胞周期调控、X染 色体失活及基因印记( genomic imprinting)等诸多过 程#1∃,同样,衰老过程也伴随着 DNA甲基化水平的 改变。体外培养的人胚肺二倍体成纤维细胞 ( human fetal lung diploid fibroblasts, 2BS) DNA甲基化 水平随细胞代龄的增加而降低, 并且衰老时 DNA 的甲基化呈现出不均一性#2∃。我室以前的实验结 果也表明,大鼠脑基因组中5�甲基胞嘧啶的含量随 增龄而明显降低#3∃。细胞周期负调控因子 p16MTS1/ INK4a在衰老 2BS细胞中表达增高,并且导入 p16MTS1/ INK4a cDNA的年轻 2BS 细胞较对照细胞出 � � 基金项目: 国家重 点基础研究 发展规划资助 项目 ( G2000057001、G1999053906)和国家自然科学基金重点资助项目 ( 39930170) � � 作者单位: 100083北京大学医学部生化与分子生物学系#陈培 利(博士生)、童坦君、张宗玉∃ 现明显的衰老指征#4∃。p16 基因的失活或低表达 可见于多种肿瘤,其重要机制之一是 p16基因启动 子区及外显子 ∀处的高甲基化#5∃。我们于 1998年 4月至 1999年 4月通过本实验探讨了 p16甲基化 与细胞衰老间的关系。 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 和方法 � � 一、材料 � � 2BS细胞由卫生部北京生物制品研究所建系, 低于 30 代为年轻细胞, 30~ 50代为中年细胞, 55 代以上为衰老细胞。基因扩增仪 GTC�1 由美国 Precision Scientific公司制造。Taq DNA 聚合酶、三 磷酸脱氧核糖核苷( dNTPs)、限制性内切酶 Sma ∀ 及随机引物标记试剂盒( Prime���gene)等购自美国 Promega公司, p16及 ��肌动蛋白( ��actin) PCR引物 由北京赛百盛公司合成 , 其序列如下 : p 16 , 上 游: GAAGAAAGAGGAGGGGCTG, 下 游: 44 中华老年医学杂志 2001年 2 月第 20卷第 1 期 � Chin J Geriatr, Feb. 2001, Vol. 20, No. 1 GCGCTACCTGATTCCAATTC; ��actin, 上 游: GAATTCATGTTTGAGACCTTCAA, 下 游: GGATCCATCTCTTGCTCGAAGTCCA。 � � 二、方法 � � 1. 基因组 DNA的提取及酶切: 不同代龄细胞 常规传代培养, 待生长至约 80%融合时胰蛋白酶 消化, 4 000 r/min 离心 5 min, 收集约 3 % 106细胞。 按0�5 ml/ 106 细胞加入 DNA 提取液 ( 10 mmol/ L Tris�HCl, pH 8�0; 1 mmol/ L EDTA, pH 8�0; 0�5% SDS; 100 g/ ml蛋白酶K) , 50 & 消化 3~ 4 h。酚�氯 仿抽提,无水乙醇沉淀提取 DNA。所获 DNA以吸 光度 A 260#A ,吸光度, 旧称光密度( OD )∃定量。取 各组 DNA各 1 g加入 Sma ∀约 40 U, 25 & 酶切过 夜。 � � 2. p16基因外显子 ∀及 ��actin 的 PCR扩增: 每50 l的反应体系内含有 模板 个人简介word模板免费下载关于员工迟到处罚通告模板康奈尔office模板下载康奈尔 笔记本 模板 下载软件方案模板免费下载 DNA 0�1 g, 10 % Taq DNA 聚合酶反应缓冲液 5 l, 1�5 mmol/L 的 MgCl2, 200 mol/ L 的 dNTPs, 5%的二甲基亚砜, 50 pmol的上下游引物及Taq DNA聚合酶 2~ 3 U。依 据不同的引物选定适当的退火温度, p16 为 60 & , ��actin为 50 & 。扩增按以下条件进行: 95 & 5 min, 退火 2 min, 72 & 2 min,循环 1次; 94 & 45 s, 退火 30 s, 72 & 45 s, 循环 30次后 72 & 保温 10 min。以 上实验均重复 2~ 3次, 取平均值。 � � 3. PCR产物的鉴定: PCR产物以 1�2%的琼脂 糖凝胶电泳鉴定。以吸光度扫描法测定扩增带的 相对强度, 并以平行扩增的 ��actin 为内参照计算 甲基化的程度(所扩增的 ��actin片段内不含限制 性内切酶 Sma ∀/ Xma ∀的识别位点)。 � � 4. RNA 提取与 Northern 印迹分析: 取各代龄 2BS 细胞依 Chomczynski 和 Sacchi 的方法提取总 RNA。所获RNA以A 260定量。Northern印迹分析按 标准方法进行。各组 p16 mRNA 于放射自显影后 以吸光度扫描法作相对定量, 以各组 ��actin mRNA 的吸光度作内参比。 结 � � 果 � � 一、2BS细胞衰老过程中 p16基因表达水平的 变化 � � 以 p16 cDNA为探针的 Northern 印迹分析结果 见图 1、2。p16基因在 2BS细胞衰老过程中表达增 加,中年 2BS细胞中 p16基因的表达水平约为年轻 细胞的3倍。随着衰老进程的发展, p16基因的表 达进一步增高, 衰老 2BS细胞中 p16基因的表达水 平约为年轻细胞的 10倍。 � � 泳道 1、2、3分别为衰老、中年、年轻 2BS细胞 � � 图 1 � 不同代龄2BS细胞 p16基因的 Northern印迹分析结果 � � 图 2 � 不同代龄2BS细胞 p16 Northern杂交条带相对吸光度值 � � 二、2BS细胞衰老过程中 p16基因外显子 ∀甲 基化水平的改变 � � 不同代龄 2BS细胞 p16基因外显子 ∀的 PCR 扩增结果见图 3、4及表 1。由结果可见, 酶切 DNA 为模板的 p16基因外显子 ∀的扩增产量均低于相 应的未酶切对照组。相对甲基化水平随着代龄的 增加而趋于降低,在年轻细胞中相对甲基化水平约 为 64%, 而在衰老细胞中则仅为 24%, 降低约 40%。这表明,虽然在衰老细胞中仍保持一定的水 平, p16基因外显子 ∀Sma ∀位点处甲基化水平存 在着随增龄而降低的趋势。 � � 泳道 1、3、5分别为年轻、中年、衰老 2BS细胞酶切 DNA, 泳道 2、4、6分别为年轻、中年、衰老 2BS细胞未酶切DNA,下图同 � � 图 3 � 不同代龄2BS细胞p16基因外显子 I 的 PCR扩增电泳图 45中华老年医学杂志 2001年 2 月第 20卷第1 期 � Chin J Geriatr, Feb. 2001, Vol. 20, No. 1 � � 图 4 � 不同代龄2BS细胞p16基因外显子 I 的PCR扩增电泳图 表 1� 不同代龄2BS细胞 p16 外显子 ∀及 ��actin PCR扩增条带的吸光度扫描值 组别 p16外显子∀ ��actin p16外显子∀酶切/未切# 年轻细胞 Sma∀酶切 0�695 1�19 � � � � � � 未酶切 1�006 1�10 0�6364 中年细胞 Sma∀酶切 0�375 1�02 � � � � � � 未酶切 1�082 1�20 0�4076* 衰老细胞 Sma∀酶切 0�238 0�93 � � � � � � 未酶切 0�960 0�90 0�2395* � 注: # 以��actin的值校正后结果; t 检验,与年轻细胞相比, *P < 0�05 讨 � � 论 � � 一、DNA甲基化参与基因表达的调控 � � DNA 甲基化可以通过改变 DNA 构象及 DNA 与蛋白质因子的相互作用而调节基因的活性。基 因调控区的高甲基化常常可以导致该基因的转录 抑制。已在多种肿瘤中发现多种抑癌基因, 如 p16 (肺癌、乳腺癌等)、p15(白血病)、RB (视网膜母细 胞瘤)、VHL(肾细胞癌)及 H19( Wilm∋ s tumor)等, 可 以通过该方式失活#6∃, 并且, 这些(失活(的基因可 以通过脱甲基化而)复活(#7∃。除此之外, 某些基 因,如雌激素受体基因则在正常衰老的细胞中因高 甲基化而失活#8∃。然而, 目前对甲基化调控基因表 达的机制尚不明了。 � � 二、甲基化在 p16基因表达调控中的作用 � � p16基因的 5∋ 及 3∋ 端均有丰富的 CpG岛,因 此该基因的表达较易受甲基化的影响。近年来的 研究表明, 在多种肿瘤及细胞系中存在 p16基因因 甲基化而失活的现象#5∃。人 2BS 在体外培养 60~ 80代后即丧失继续分裂增殖的能力, p16基因表达 增加, 细胞阻滞于 G1期。经 DNA 甲基化抑制剂 5�氮杂胞苷处理可以加速正常人成纤维细胞的衰 老进程#9∃。上述这些现象表明, p16基因的甲基化 在衰老过程中可能同样发挥重要的调控作用。 � � 三、甲基化可能参与衰老细胞 p16的高表达 � � 实验显示, p16基因外显子 ∀的 Sma ∀位点处 甲基化水平存在着随增龄而降低的趋势,且该趋势 与 p16 在衰老细胞中的表达增加呈正相关。 Brenner等#10∃新近发现,人乳腺上皮细胞分裂次数 的增加亦与 p16基因的甲基化有关,而去甲基化所 导致的生长阻滞则以 p16 的表达增强为前提。可 见,甲基化在调节 p16在衰老中的表达确实起着一 定的作用。但是,该过程如何参与 p16的调节尚需 进一步的研究。其机制可能涉及 p16基因调控区 与蛋白质因子相互作用, 或者, 衰老过程影响了 DNA的甲基化状态。这些机制的过程和意义目前 还不清楚,但是,由于 p16在衰老中的重要作用, 进 一步研究其调控机制,尤其是 DNA甲基化的作用, 将有助于进一步阐明衰老及其与肿瘤发生的关系。 参 � 考 � 文 � 献 1 Razin A. CpG methylat ion, chromatin structure and gene silencing: a three�way connection. EMBO J, 1998, 17: 4905�4908. 2 Zhang ZY, Mao ZB, Nan XS, et al. Heterogeneous methylation of liver DNA in aging rats. J Cell Biochem, 1993, 17D: 167. 3 毛泽斌, 张宗玉,吴跃南,等.大鼠衰老过程中脑细胞 DNA 与 C�Ha� ras原癌基因的甲基化. 生物化学杂志, 1994, 10: 570�574. 4 Zhang ZY, Liu PW, Duan JM , et al. Involvement of p16INK4a in repl icative senescence of human diploid f ibroblast which senescence delay can be induced by anti�sense p16INK4a expression. FASEB J, 2000, 14:A1544. 5 Herman JG, Merio A, Mao L, et al. Inactivation of the CDKN 2/ p16/ MTS 1 gene is frequent ly associated with aberrent DNA methylation in all common human cancer. Cancer Res, 1995, 55: 4525�4530. 6 Baylin SB, Herman JG, Graff JR, et al . Alterations in DNA methylat ion: a fundamental aspect of neoplasia. Adv Cancer Res, 1998, 72: 141�196. 7 Jones PA, Taylor SM . Cell different iation, cyt idine analogue and DNA methylat ion. Cell, 1995, 20: 85�93. 8 Issa J�PJ, Ottaviano YL, Celano P, et al . Methylation of the estrogen receptor CpG island links aging and neoplasia in human colon. Nat Genet, 1994, 7: 536�540. 9 毛泽斌, 张宗玉, 童坦君. DNA去甲基化对细胞衰老的影响. 生物化学杂志, 1997, 13: 318�321. 10 Brenner AJ, Stampfer MR, Aldaz CM. Increased p16 expression with first senescence arrest in human mammary epithelial cells and extended growth capacity with p16 inactivat ion. Oncogene, 1998, 17: 199�205. (收稿日期: 1999�07�22) (本文编辑: 张富秀) 46 中华老年医学杂志 2001年 2 月第 20卷第 1 期 � Chin J Geriatr, Feb. 2001, Vol. 20, No. 1
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