抑郁症患者外周血白细胞中CREB1基因表达研究

国神经精神疾病 蠢 Q 生 箜 鱼鲞 箜 237 · 论 著 · 抑郁症患者外周血白细胞中 CREB1基因表达研究 刘晓华 徐一峰 崔东红 江三多 钱伊萍 禹顺英 江开达 【摘要】 目的 探讨抑郁症患者外周血白细胞中cAMP反应元件结合蛋白(cyclic AMP response element—bind— ing p 。tein．CREB)基因 CREB1的表达情况。方法 采用 TaqMan实时定量反转录 一聚合酶链反应 (reverse tran— scripti0n—Do1vmerase chain reacti0n，RT—PCR)法 ，对 36例首发未用药抑郁症患者及44名正常对照外周血白细胞中的 CREB1基 表达水平进行定量分析。结果 患者组和对照组的 CR~B1基因平均表达量(amole／0．3 cDNA)分 别为(0．20±0．10)和(0．17±0．06)，差异无统计学意义(t=1．50，P>0．05)。根据性别 、发病年龄 、汉密尔顿抑郁 量表一24项(HAMD一24)评分对患者进行分组，仍未发现患者组的基因表达量与对照组的差异有统计学意义(P> 0．05)，且与 HAMD一24量表各因子分无相关(P>0．05)。结论 抑郁症患者外周血白细胞中 CREB1基因的表达水 平未见异常 ，号 别 、发病年龄和疾病严重程度无关。 【关键词】 抑郁症 cAMP反应元件结合蛋白基因 反转录一聚合酶链反应 【中图分类号】 R749．4 【文献标识码】 A The study on the gene expression of cyclic AM P response element-binding protein in peripheral leucocyte from patients with major depression．LIU Xiaohua．XU Yifeng，CUI Donghong，JIANG Sanduo，QIAN ing，YU Shunying， JIANG Kaida．Shanghai Mental Health Center，Shanghai Jiaotong University，600 South Wan Ping Road，Shanghai 200030，Chi· na．Tel：021—34289888． 【Abstract】 Objective To investigate expression level of cyclic AMP response element—binding protein(CREB) gene，CREB1，in peripheral leucocyte from patients with major depression．Methods Thirty—six first—episode drug—naive depressive patients and 44 healthy controls were recruited．Relative TaqMan real—time quantitative reverse transcription—pol— ymerase chain reaction(RT—PCR)of CREBI gene in peripheral leukocyte was performed using the standard curve method on ABI PRISM~ 7900 sequence detection system．Amplification of an endogenous control，house—keeping glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)gene，was performed to standardize the amount of unknown samples．Furthermore， the relationship between CREB1 gene expression levels and gender，onset age，severity of depressive symptoms，as well as scores of HAMD一24 rating scale were analyzed．Results CREB1 gene expression level(amole／0．3 L cDNA)in periph— eral leucocvte from patients and controls was 0．20±0．10 and 0．17±0．06，respectively．There was no significant differ— ence between two groups(t=1．50，P>0．05)．Moreover，gene expression levels were not correlated with total scores and factor scores of HAMD一24 rating scales(P>0．05)．Conclusions CREBI gene expression level in peripheral leucocyte not different nor related to gender，onset age and symptom severity． 【Key words】 Major depression CREBI gene RT—PCR 抑郁症的发病机制至今不明。近年来提出的神经 可塑性假说认为 ，抑郁症发生的关键可能不局限于受 体或受体前水平，可能还包括与突触可塑性相关的受 体后信号转导、基因转录调控及其下游靶基因表达水 平的改变。而 cAMP反应元件结合蛋 白(cyclic AMP response element—binding protein，CREB)是这一假说的 国家 自然科学基金资助项目(编号：30270729) 上海交通大学医学院附属精神卫生中心(上海 200030) 通讯作者(E—mail：jiangkaida@yahoo．COIII．cn) 核心要件之一，它作为一个重要的整合器 ，将影响神经 可塑性和神经元存活的细胞外刺激整合起来 ，继而影 响下游靶基 因的表达⋯。CREB1是 CREB的编码基 因，定位于染色体2q32一q34，这一区域曾被报道与女性 抑郁症存在关联或连锁 。 。这些均提示 CREB1基 因可能是抑郁症的候选基因。故本研究采用 TaqMan 实时定量反转录 一聚合酶链反应(reverse transcription— polymerase chain reaction，RT—PCR)法对抑郁症患者外 周血白细胞中CREB1基因的表达水平进行定量分析， 以进一步探讨 CREBI基因与抑郁症的关系。 238 1 对象与方法 1．1 研究对象 为2005年6月 1日至2006年 1月31 日就诊于上海市精神卫生中心与复旦大学附属华山医 院心理咨询门诊的抑郁症患者。入组标准：①年龄 l6 ～ 60岁；②汉族；③符合美国精神障碍诊断与统计手 册第4版(DSM—IV)重性抑郁障碍的诊断标准，无其他 轴I诊断或物质滥用的证据；④汉密尔顿抑郁量表_24 项(HAMD-24)评分≥20分；⑤首次发病，从未服用任 何抗抑郁药物。排除标准：①有脑血管疾病、高血压、 糖尿病等严重躯体疾病者；②其他精神疾病伴发抑郁 状态者；③曾有躁狂发作或抗抑郁药诱发的躁狂发作 者。由两位高年资精神科医师复核诊断。共纳入 36 例，其中男 17例，女 19例。年龄 17～60岁，平均 (34．39±11．69)岁；发病 年龄 为 17～59岁 ，平 均 (33．69-4-11．69)岁 ；病程 0．75～24个月，平均(7．32± 7．30)个月；HAMD一24评分为 20～47分 ，平均(30．00 ±6．95)分。正常对照组来 自上海市精神卫生中心及 其他单位的职工，排除有各种精神疾病者、严重躯体疾 病及有阳性精神疾病家族史者。共纳入 44名 ，其中男 17名，女27名，年龄 18～52岁 ，平均(33．70±11．31) 岁。均为汉族。 所有患者及正常对照均对本研究知情同意。两组 的年龄、性别和文化程度均匹配，差异均无统计学意义 (P>0．05)。 1．2 方 法 1．2．1 样本准备 抽取静脉血 1．5 mL，以2％的乙二 胺四乙酸 (ethylene diamine tetraacetlc acid，EDTA)抗 凝。采用 QlAamp RNA Blood Mini Kit(QIAGEN)抽提 总 RNA，同时采用 RNase．Free DNase Set(QIAGEN)纯 化 RNA。测定每个样 本 中总 RNA的浓度 和纯度， OD260／OD280均 大于 1．8。采用 Omniscript Reverse Transcription Reagents(QIAGEN)和随机引物(Promega) 合成第一链 eDNA，同时使用 RNA酶抑制剂防止 RNA 降解。cDNA合成的总体积为20 ，反应体系及反应 条件参见公司提供的相应操作手册。 1．2．2 实时定量 PCR分析 采用 TaqMan MGB探针 的相对定量标准曲线法在96孔ABI Prism~7900序列 检测系统上进行荧光实时定量 PCR扩增 ，以甘油醛-3- 磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde 3·phosphate dehydrogenase， GAPDH)基因作为内对照基因分析 CREB1基因的起 始拷贝数。根据 ABI公司提供的参考序列及上下文序 列设计标准品的PCR引物，进行PCR反应。引物序列 (Invitrogen合 成 )CREB1一F：5 -AGTCTCCACAAGTC— CAAACA一3 和 R：5 一GCTCCTCCCTGGGTAATG-3 ；GAP- DH—F：5 一CTCTGCTCCTCCTGTTCG．3 和 R：5 ．GTTCT— cAGccrrrGAcGGT 3 。反应总体积为50 ，内含cD· NA 50 ng、引物各 10 pmoL、dNTPs 0．3 mmoL／L、MgC1 1．5 mmoL／L及 Taq酶(Promega)1．5 U。经 95℃预变 性 3 rain，热循环 参数 转速和进给参数表a氧化沟运行参数高温蒸汽处理医疗废物pid参数自整定算法口腔医院集中消毒供应 为95℃ 30 S、退火(CREB1基因 61℃ ，GAPDH基因60 oC)30 S和 72 qC 30 S，共 35个 循环。PCR产物经 1．5％琼脂糖凝胶电泳 (溴化乙啶 染色)进行电泳，采用 QIAquick Gel Extraction Kit(QIA— GEN)进行割胶回收纯化以制得标准品。测定标准品 的 cDNA 浓 度，稀 释 为 50amole、10amole、2amole、 0．4amole和0．08amole 5个梯度，在每个反应板上绘制 CREBI和 GAPDH基 因的标准 曲线，进行 CREB1和 GAPDH基因的实时定量 PCR扩增，反应体系及条件 相同。总体积为 10 ，其中TaqMan Universal PCR Mastermix(2×)5 IxL、TaqMan MGB探针和引物各0．5 txL、eDNA模板(50 rig)0．3 L，反应条件为：50℃ 2 min--~95℃ 10 min：然后 95℃ 15 S、59℃ 1 rain，共 40 个循环。每个样本均重复 2次 ，分别设立 2个阴性对 照孔。 1．2．3 统计学方法 用 SDS 2．0软件进行实时定量 PCR数据采集。根据标 准曲线分别得 出 CREB1和 GAPDH基因的表达量，以两者之问的比值作为每个样 本 CREB1基因的最终表达量。采用 SPSS 11．5进行独 立样本 t检验、单 因素方差分析(One—way ANOVA)及 Pearson相关分析。检验水准采用 Ol=0．05。 2 结果 2．1 实时定量PCR扩增结果 CREB1基因的标准曲 线见图1，横坐标为起始 cDNA量的 Log值，纵坐标为 循环阈值(Cycle threshold，Ct)值。从构建的标准曲线 可看 出，目的基因与内对照基因的起始 cDNA量与 Ct 值之间呈良好的线性关系，CREB1基因的线性方程为 Y=一3．343x+23．265，相关系数 r=0．9993；GAPDH基 因的线性方程 y=一3．576x+22．591，r=0．9975(图 略)。CREB1和GAPDH基因的PCR扩增效率高，复孔 重复性好，阴性对照孔未出现扩增产物，提示没有污 染。见图2。 2．2 CREB1基因的表达量 患者组与对照组每 0．3 IxL cDNA中CREB1基因的平均表达量分别为(0．20± 0．10)amole和(0．17±0．06)amole，差异无统计学意义 (t=1．50，P：0．14)。见表 1。 将患者分为不同的亚组进行分层分析。男女患者 组 、男女对照组 的基因表达量分别为(0．22±0．13) 240 本研究的一大不足之处。总之，CREB及其编码基 因 [6] 是否参与抑郁症的病理生理学过程以及具有怎样的作 用尚有待深入研究。 参 考 文 献 Duman RS．Pathophysiology of depression：the concept of synoptic plasticity[J]．Eur Psychiatry，2002，17(Suppl 3)：306—310． Levinson DF．The genetics of depression：a review[J]．Biol Psy— ehiatry，2006，60(2)：84—92． Zubenko GS，Hughes HB 3rd，Maher BS，et a1．Genetic：linkage of region containing the CREB1 gene to depressive disorders in women from fanfilies 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。二是服药剂量的差异 ：新加坡研究中患 者服药剂量折合氯丙嗪约 600 m d，明 高于本研究(480 rag／ d)。而许多研究已表明，高药物剂量是TD的主要危险凶素 。 。 另外 ，其它可能的因素，比如饮食习惯 、社会经济因素 、住院的环 境因素等，有待进一步开展跨地区、跨文化研究。 本研究表明，老龄 、慢性病程、阴性症状 和多次住院是发生 TD的危险因素。既往研究表明，年龄超过 5O岁的患者 ，其 TD发 病率是年轻组患者的3～5倍；而且TD的危险性随抗精神病药治 疗时间的增长而增加 。 。另外，研究也显示 ，阴性症状与 TD的 发病和严重程度密切丰}1天 ，但本研究不能阐明阴性症状是否与 TD的发病和迁延有关，或是TD导致的结果，有待于进一步研究。 参 考 文 献 [1] DiehlA，ReinhardI，Sehmitt A，et a1．Doesthe degree of smoking effect the severity tardive dyskinesia?A longitudinal clinical trial l J J．Eur Psychiatry，2009，24(1)：33—40． [2] Chong SA，Tan EC，Tan CH，et a1．Smoking and tardive dyskine— sia：lack of involvement of the CYP1 A2 gene『J]．J Psychiatry Neurosci，2003，28(2)：185—189． [3 J 黄雄 ，许美庭，黄杏梅，等．迟发性运动障碍与吸烟的关系『J]． 中国神经精神疾病杂志，1996，22(1)：35—36． [4 J de Leon J，Diaz FJ．A meta．analysis of worhtwide studies demon— strates an association between schizophrenia and tobacco smoking behaviors[J]．Sehizophr Res，2005，76(2—3)：135—157． [5] ZhangXY，Chen daC，Qi LY，et a1．Gender differencesinthe preva． 1eoce，risk and clinical correlates of tardive dyskinesia in Chinese schizophrenia[J]．Psyehopharmaeology，2009，205(4)：647—654． 【中图分类号】 R749．4：R749．053 (收稿日期：2009—06—11) 【文献标识码】 A (责任编辑 ：曹莉萍) j ] ]J l—l