未成熟卵母细胞评分系统对人类未成熟卵体外成熟及发育潜能的评价

-408- 第26卷第7期Vol.26,No.7 2006年7月Jul. 2006 生 殖 与 避 孕 Reproduction & Contraception http://www.RandC.cn randc@sippr.stc.sh.cn 未成熟卵母细胞评分系统对人类未成熟卵 体外成熟及发育潜能的评价 李 媛 姜晶晶 马水英 李 梅 胡京美 杨惠军 陈子江 (山东大学山东省立医院生殖医学中心, 济南, 250021) 【摘要】 目的: 建立未成熟卵母细胞评分系统，并评价其对人类未成熟卵体外成熟及发育潜能的 预测作用。 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 : 将未成熟卵母细胞取出体外，根据卵母细胞形态及其周围颗粒细胞形态、分布 进行评分，然后分别进行成熟培养和体外受精，再将卵母细胞评分与其成熟率、受精率、优质胚 胎率，以及相应卵母细胞的颗粒细胞凋亡情况进行比较。结果: 随着卵母细胞评分的降低，卵子 的成熟率、受精率、卵裂率及优质胚胎率均下降，而颗粒细胞的凋亡率升高。结论: 本研究所设 计的未成熟卵母细胞评分系统能够较准确地反映卵母细胞的发育潜能，具有一定的应用价值。 关键词: 人; 卵母细胞; 评分; 体外; 成熟 中图分类号: R713.7 文献标识码: A 文章编号: 0253-357X(2006)07-0408-06 本课 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 受山东省优秀中青年科学家奖励基金资助 (编号: 2005BS02018) 通讯作者: 陈子江; Tel: +86-531-87068226; E-mail:sdemily@126.com 近年来，卵母细胞体外成熟培养/体外受精- 胚胎移植(in vitro maturation / in vitro fertilization and embryo transfer, IVM/IVF-ET)技术被越来越多的生 殖中心应用于不孕患者的治疗。在经典的IVF技术 中，取出体外的卵母细胞送往实验室后，会得到 形态学评价，以对该卵母细胞的质量和发育潜能作 出初步估计，对促排卵过程具有反馈性指导价值， 还能提供选择由高质量卵母细胞得到的胚胎进行移 植的可能性, 从而提高胚胎着床率，减少胚胎移植 数目, 减少多胎妊娠。因此, 对卵母细胞进行较准 确的评价具有重要意义。但是, 目前对于人类未成 熟卵母细胞尚没有公认的具临床实用价值的较准确 的评分系统。Smitz等根据卵子的核成熟程度及颗 级方法比较复杂, 在实验室应用中受到一定的限制。 在本研究中, 我们参考以往对人成熟卵母细胞进行 评分的 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 , 拟定了未成熟卵母细胞的评分系统, 并 评价该评分系统对卵母细胞发育潜能的预测作用及 其可靠性。 1 资料与方法 1.1 未成熟卵母细胞 未成熟卵母细胞来源于2003.03-2004.05间就 诊于山东省立医院生殖医学中心, 拟定在未刺激周 期进行IVM/IVF-ET的多囊卵巢综合症(PCOS)患 者。PCOS的诊断标准如下: ①月经稀发或闭经， 伴或不伴肥胖、多毛等症状; ②基础内分泌检查(月 经周期d 3)显示睾酮(T0)升高(>45 ng/dl, 化学发光 法检测, BECKMAN公司)，LH/FSH>2; ③阴道B超 检查发现每侧卵巢中直径2-8 mm的卵泡>10个[2]。 黄体酮撤退, 月经来潮后d 10-12行阴道B超监 测卵泡。如果双侧卵巢中无直径>8 mm的卵泡, 即 肌注hCG 10 000 IU, 36 h后在异丙酚静脉麻醉下行 经阴道未成熟卵取卵术, 采用COOK公司生产的K- 粒细胞的形态对未成熟卵进行了分级[1]。但是该分 -409- OPS-WOOD-1235穿刺针，抽吸负压为7.5 kPa。 158例患者, 进行IVM周期184个, 取得2 296个未 成熟卵母细胞。 1.2 未成熟卵母细胞培养和体外受精 取出的卵泡液在保温条件下马上送入实验室, 体视镜下将含卵-冠-丘复合体(oocyte-cumulus- corona complex, OCCC)的黏液团挑选出, 并在放大 200倍的倒置显微镜下，进行卵母细胞形态和成熟 度评价(图1,2)。如果卵细胞浆内见生发泡(germinal vesicle, GV), 无极体, 为GV期卵; 如无GV, 也无极 表 1 人未成熟卵母细胞的评分标准 Table 1 The scoring system of human immature oocyte 评分Grade GV期或MI期卵和胚胎特征 Characters of oocyte and embryo in GV phase or MI phase 4 黏液团丰富, 卵细胞形态规则, 周围颗粒细胞层完整, 层数≥6层, 与卵母细胞紧密连接。 Oocyte shape: regular and normal; cumulus cells: fully enclosed, 6 or more layers, closed connected with oocyte 3 卵细胞形态基本规则, 周围颗粒细胞层基本完整, 层数3-6层, 紧密包裹在卵子周围。 Oocyte shape: regular, normal/ minor abnormal; cumulus cells: fully enclosed, 3 to 6 layers, tight dense cells 2 卵细胞形态轻度不规则, 颗粒细胞层不完整, 层数≤3层。 Oocyte shape: lightly irregular morphologic; cumulus cells: not integrate (partially naked), 3 or less layers 1 卵细胞形态不规则, 或有其它形态结构异常。颗粒细胞层不完整或者缺如。 Oocyte shape: irregular morphologic or other abnormal morphologic, not integrate or lack of cumulus cells 0 卵母细胞发黑, 或者卵母细胞包裹在发黑的颗粒细胞团中, 无法清楚分辨卵细胞的形态。 Darked oocyte, or the oocyte be enclosed by darked cumulus cells and the morphology be difficult to recognize 注: ①GV期: 卵细胞浆内可见生发泡 GV phase: germinal vesicle in cytoplasm ②MI期: 无第一极体, 且卵细胞浆内无生发泡 MI phase: no first polar body and no germinal vesicle in cytoplasm 体, 为第一次减数分裂中期(MI)卵。同时根据卵母 细胞形态和周围颗粒细胞的情况进行卵母细胞评分, 评分标准见表1。如果遇到观察困难的情况, 卵母 细胞包裹在发黑的颗粒细胞团中, 无法清楚分辨卵细 胞的形态, 可将含OCCC的黏液团铺于100 mm平 皿中, 略微倾斜后, 倒置显微镜下观察; 也可略微翻 转OCCC, 调整观察角度。此时, 如果仍然无法观察 到卵母细胞结构, 记为0分。并将所有照片用胚胎 图像记录系统(FertiMorph embryo morphology system, Imagehouse, 丹麦)进行记录保存及前后比较。 a: 4分grade 4; b: 3分grade 3; c: 2分grade 2; d: 1分grade 1; e: 0分 grade 0 图 1 MI期未成熟卵 (200×) Figure 1 Scoring of immature MI phase oocyte(200×) -410- 图2 GV期未成熟卵评分(a: 4分; b: 3分; c: 2分; d: 1分; e: 0分) (200×) Figure 2 Scoring of immature GV phase oocyte (a: grade 4; b: grade 3; c: grade 2; d: grade 1; e: grade 0) (200×) 随后将OCCC放入含有0.075 IU FSH、0.5 IU hCG、10 ng/ml EGF、0.29 mmol/L丙酮酸钠、10％ 胎牛血清的TCM-199中，在37℃, 5％CO2环境中 培养, 28-30 h后去除颗粒细胞后, 评价其成熟情况, 有第一极体释放的卵母细胞被认为已经达到成熟, 即 行单精子卵浆内注射(ICSI)。受精16-18 h后, 卵 细胞浆内如出现原核, 即为受精, 继续在胚胎培养液 中培养24 h后进行胚胎评分(表1)。 1.3 颗粒细胞凋亡 将上一实验脱下的颗粒细胞用TUNEL法[3]进 行凋亡观察, 并与该对应卵子成熟培养后的发育潜 能进行比较。颗粒细胞计数时, 在显微镜下任意选 取视野, 共计数500个细胞, 并记录其中凋亡的细胞, 计算凋亡率。凋亡细胞表现为细胞核形态不规则 (染色质凝集、核固缩), 核中有局部或弥漫性分布 的棕黄色颗粒。非凋亡细胞核形态规整，核染色 呈均匀的淡绿色(甲基绿染色)。凋亡率＝(凋亡细 胞数/所计细胞总数)×100％。 1.4 统计学方法 采用SPSS 11.0软件进行相关数据c2检验和t 检验，并以P<0.05为具有统计学意义。 2 结果 2.1 卵子不同评分与其发育潜能的关系 将卵子按照评分不同分类, 将其体外成熟培养/ 体外受精后卵子的成熟率、受精率及形成的优质胚 胎率进行比较, 结果见表2。发现评分为0分的卵 母细胞其成熟率、受精率与MI和GV期的 2-4分的 卵母细胞相比有统计学差异(P<0.01)，优质胚胎率 与MI和GV期 3-4分的卵母细胞相比有统计学差 异(P<0.05)。评分为0-4分的MI卵母细胞, 其成熟 率、受精率、卵裂率和优质胚胎率与卵母细胞评 分成正相关关系(r分别为0.988、0.931、0.930、 0.955, P<0.05), 即随着卵母细胞评分的增高, 各指 标随之升高; 评分为0′-4′GV卵母细胞亦如此(r分 别为0.996、0.942、0.947、0.985, P<0.05)。 2.2 不同成熟时期卵母细胞体外成熟培养后发育潜 能的比较 在未刺激周期卵穿刺, 分别获取MI期和GV期 末成熟卵母细胞497枚和1 614枚。将这些卵母细 胞在相同的条件下进行培养后, 其成熟、受精及卵 裂情况见表2。MI期卵和GV期卵的成熟、受精 及胚胎形成情况无明显差别, 但0分者的成熟率和受 精率与MI期和GV期卵相比明显降低(P<0.01), 胚 胎形成情况则无差别(P>0.05)。 2.3 颗粒细胞凋亡与卵子评分的关系 由表3可见, 培养前评分为1分和0分卵子的颗 粒细胞凋亡率明显高于为3、4分者。培养后，在 评分相同的卵母细胞中，随着形成胚胎的评分降 低，颗粒细胞凋亡率升高。不能成熟或能成熟但 -411- 表 3 培养前卵母细胞评分情况与颗粒细胞凋亡率的关系 Table 3 The development potential of oocytes in different maturation phase 卵母细胞评分 卵母细胞数(n) 颗粒细胞凋亡率(%) Grade of No. of Apoptosis rate oocytes oocytes of GCs(%) 4 68 7.89±0.031 3 138 8.04±0.026 2 132 9.51±0.024 1 44 13.87±0.014* 0 30 17.35±0.019** *: P<0.05, **: P<0.01, 与4分和3分组比较 compared with grade 4 and 3 groups 表 4 培养后卵母细胞发育潜能与颗粒细胞凋亡的关系 Table 4 Relationship between apoptosis rate of GCs and grade of oocytes before cultured 取卵时卵母 胚胎发育 卵母细胞 颗粒细胞 细胞评分 情况 数(n) 凋亡率(%) Grade of Quality of No. of Apoptosis rate oocytes embryos oocytes(n) of GCs(%) 3-4分 优质胚胎 72 4.86±0.02 High quality embryo 非优质胚胎 64 6.26±0.02 Poor quality embryo 不能成熟或能成熟但 70 10.81±0.02 授精后不能形成胚胎 Can’t be fertilized or can’t develop to embryos after fertilization 2分 优质胚胎 46 5.55±0.03 High quality embryo 非优质胚胎 44 7.56±0.04 Poor quality embryo 不能成熟或能成熟但 42 13.69±0.02* 授精后不能形成胚胎 Can’t be fertilized or can’t develop to embryos after fertilization 0-1分 不能成熟或能成熟但 74 15.27±0.02** 授精后不能形成胚胎 Can’t be fertilized or can’t develop to embryos after fertilization *: P<0.05 **: P<0.01, 与以上各组比较 compared with all the groups above 授精后不能形成胚胎的卵母细胞的颗粒细胞凋亡率 明显高于能形成良好胚胎者(表4)。 3 讨论 在IVF周期中，挑选高质量、具有良好发育 潜能的胚胎进行移植是非常必要的，有助于提高胚 胎着床率，减少胚胎移植的个数，从而降低多胎 妊娠率。因此，从卵母细胞、原核期胚胎、早 分裂期胚胎到囊胚期胚胎，出现了一系列评分系 统，理论上讲，挑选从最好的卵母细胞来源的、 各期评分都最好的胚胎能够获得最高的胚胎着床 率。单纯就卵母细胞的评价来讲，到目前为止， 表 2 不同评分卵子的发育潜能比较 Table 2 Compare the development potential of different grade oocyte 卵子评分 卵子数(n) 成熟数(%) 受精数(%) 卵裂数(%) 优质胚胎数(%) Grade of No. of No. of oocytes No. of matured oocytes No. of oocytes No. of high quality oocyte oocytes matured (%) fertilized (%) cleaved (%) embryos(%) MI 497 406(81.7)** 291(71.7)** 254(62.2) 184(45.3) 4 143131(91.6)**△ 112(85.5)**△ 103(78.6)** 69(52.7)* 3 175150(85.7)**△ 108(72.0)**△ 93(62.0) 74(49.3)* 2 103 75(72.8)**# 47(62.7)**# 39(52.0) 29(38.7) 1 76 0(65.8) 24(48.0) 19(38.0) 12(24.0) GV 1 614 1 257(77.9)** 956(76.1)** 823(65.5) 590(46.9) 4 309267(86.4)**△ 221(82.8)**△ 212(79.4)** 153(57.3)* 3 755589(78.0)**△ 468(79.5)**△ 393(66.7)277(47.0)* 2 459339(73.9)**# 236(69.6)**# 194(57.2)# 142(41.9) 1 91 62(68.1) 31(50.0) 24(38.7) 18(29.0) 0 185100(54.1) 47(47.0) 36(36.0) 20(20.0) 合计Total 2 296 1 763(76.8)1 294(73.4) 1 113(63.1)794(45.0) *: P<0.05, **: P<0.01, 与0分卵子比 compared with grade 0 oocyte△: P<0.01, 与1分卵子比 compared with grade 1 oocyte #: P<0.01与4分卵子比 compared with grade 4 oocyte -412- 还没有可靠的生化指标可以提示卵母细胞的发育状 态，只能用形态学的方法进行评价。但是，在未 成熟卵体外培养技术中，尚无较简单易行、又能 较准确评价卵母细胞质量的评分标准。Smitz等根 据卵子的核成熟程度及颗粒细胞的形态对未成熟卵 进行分级的评分方法比较复杂，且记录繁复[1]。按 照他的方法对卵母细胞进行评分，至少要观察和记 录10个指标，而且有些指标，如卵母细胞浆的颗 粒粗细、是否有空泡、卵周间隙的大小等，在尚 未脱去OCCC中的颗粒细胞时无法观察；而如果脱 去颗粒细胞，又会影响未成熟卵母细胞的体外成 熟，因此实用性欠佳。 在未刺激周期通过卵泡穿刺抽吸得到的卵母细 胞, 根据细胞核成熟度可以分为2个阶段，即处于 减数分裂第一次分裂前期(prophase I，PI)和中期 (metaphase I, MI)。处于PI期的卵母细胞浆内通常 会看到生发泡(germinal vesicle, GV)。如果该卵母 细胞恢复成熟分裂, GV就会破裂(GV break down, GVBD)。MI期是一个过渡期，此时既观察不到 GV，也没有第一极体。此后卵母细胞进一步成熟 就会进入减数分裂第二次分裂中期(metaphase II， MII)，释放出第一极体，此时认为卵母细胞核已 经达到成熟，并停留在此阶段等待受精。 在本文的卵母细胞评分系统中, 将未成熟卵母 细胞按照细胞核的成熟度分为GV期和MI期, 再根 据其他指标进行1-4分的评分。结果发现GV期和 MI期卵母细胞的成熟、受精和卵裂情况二者无明 显差异, 即二者的发育潜能没有差异, 说明评分系统 中按照卵母细胞核成熟度分级可能是不必要的。但 是对于PCOS病人进行促性腺激素刺激周期治疗[4,5], 获得的GV期和MI期卵母细胞二者的发育潜能是否 没有差异还有待于进一步验证。 卵母细胞的成熟有赖于促性腺激素作用于颗粒 细胞上的相应受体，最终促进卵母细胞核和细胞质 的成熟[6,7]。卵母细胞能够正常受精、形成原核、 卵裂、形成囊胚，直至形成胎儿，这些发育过程 的顺利完成与卵母细胞质成熟度密切相关[8,9]。颗 粒细胞与卵母细胞之间的关系十分密切, 通过缝隙连 接相互影响、相互作用。脱离了颗粒细胞的卵母 细胞在体外不能达到成熟, 颗粒细胞能够促进卵母细 胞成熟, 同时还能保持卵母细胞成熟分裂过程的正常 进行[10,11], 而卵母细胞可以促进卵泡的发生、发育 和颗粒细胞的增生、分化及调节其功能[12]。研究发 现, 当卵母细胞与颗粒细胞连接较紧密时, 卵母细胞 较容易获得成熟, 并达到较好的成熟状态[13]。如果 卵母细胞周围包裹着紧密连接的颗粒细胞，说明该 OCCC可能来自非闭锁状态的卵泡，具有较好的发 育潜能。而来自闭锁或者不正常卵泡的卵母细胞往 往表现为“裸卵”(没有颗粒细胞包裹)或者颗粒细 胞数目很少[13]。虽然这些来自闭锁卵泡的卵母细胞 在体外也能获得成熟[14], 但其发育潜能较差。在卵 母细胞发生发育过程中, 颗粒细胞形态学上的变化也 反应着卵母细胞成熟的过程, 有些变化在光学显微镜 下即可观察到[15,16]。在本评分系统中, 把颗粒细胞 的层数、形态及与卵母细胞的关系作为了一个较重 要的评价指标。通过对颗粒细胞凋亡率的观察也发 现, 评分高的卵母细胞其颗粒细胞凋亡率明显低于评 分低者, 也证实了这一点。 因为对OCCC的形态学观察是主观判断，所 以一些新的研究正在致力于寻找更可靠的方法来评 价卵母细胞的成熟度和质量。颗粒细胞的DNA片 断与细胞核成熟之间的关系已经被提出[17]，其它还 有卵泡液中的一些生化指标, 如抑制素A、抑制素 B和激活素A水平也能反映卵母细胞的质量和受精 能力[18]。但是这些检测指标还不能应用于IVF实验 室的日常工作中, 因此, 对OCCC的形态学评价仍然 是很重要的, 而且是唯一的能够不破坏OCCC正常 结构来观察卵母细胞成熟度和质量的方法[19]。 本中心通过一段时间应用本卵母细胞评分系 统, 确实表明本评分系统可以反映卵母细胞的发育潜 能情况。结合颗粒细胞凋亡率的观察，发现随着 评分的下降，凋亡率随之升高，进一步证实了本 评分系统的准确性，能够较准确地反映卵子的潜在 发育能力, 具有一定的临床应用价值, 值得在今后的 工作中加以推广应用。 参考文献: [1] Smitz J, Nogueira D, Cortvrindt R, et al. 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Methods: Immature oocyte was evaluated after picked up based on its morphologic character. Then the maturation rate, fertilization rate, cleavage rate, the quality of the embryos and the apoptosis of the granulasa cells with the scoring of the correspond- ing oocyte were compared. Results: As the decreasing score of the oocyte, the maturation rate, fertilization rate, cleavage rate and the quality of embryos decreased, meanwhile the apoptosis rate of granulose cells increased. Conclusion: The scoring system of immature oocyte we supposed can correctly reflect the development potential of oocyte, so it has applicative value and can be applied widely. Key words: oocyte; score; in vitro; maturation priming and hCG priming for in-vitro maturation of human oocytes. Hum Reprod, 2003, 18(8): 1 632-6. [5] Du AL, Kadoch IJ, Bourcigaux N, et al. In vitro oocyte maturation for the treatment of infertility associated with polycystic ovarian syndrome: the French experience. 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