大肠埃希菌 Ｆ１８菌毛结构亚单位抗原特性的研究

书书书 动物医学进展，２００９，３０（２）：４７ ＰｒｏｇｒｅｓｓｉｎＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅ 大肠埃希菌Ｆ１８菌毛结构亚单位抗原特性的研究 成大荣１，朱善元２，钱金梅１，董丙敏１ （１．扬州大学兽医学院，江苏扬州 ２２５００９；２．江苏畜牧兽医职业技术学院，江苏泰州 ２２５３００） 　　摘　要：利用已经 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达的大肠埃希菌Ｆ１８ａｂ和Ｆ１８ａｃ菌毛各结构亚单位（ＦｅｄＡ、ＦｅｄＥ、ＦｅｄＦ）的融合蛋 白ＧＳＴＦｅｄＡ／ａｂ、ＧＳＴＦｅｄＡ／ａｃ、ＧＳＴＦｅｄＥ／ａｂ、ＧＳＴＦｅｄＦ／ａｂ、ＧＳＴＦｅｄＦ／ａｃ分组肌肉注射免疫成年健康 家兔，分别制备抗ＧＳＴＦｅｄＡ／ａｂ、ＧＳＴＦｅｄＡ／ａｃ、ＧＳＴＦｅｄＥ、ＧＳＴＦｅｄＦ／ａｂ、ＧＳＴＦｅｄＦ／ａｃ的多价血清。玻 板凝集试验结果表明，抗ＧＳＴＦｅｄＡ／ａｂ、ＧＳＴＦｅｄＡ／ａｃ、抗ＧＳＴＦｅｄＥ／ａｂ、ＧＳＴＦｅｄＦ／ａｂ、ＧＳＴＦｅｄＦ／ａｃ多 价血清均能同时凝集Ｆ１８ａｂ＋大肠埃希菌Ｆ１０７／８６株、Ｆ１８ａｃ＋大肠埃希菌８８１３株。通过荧光抗体染色法对 抗ＦｅｄＡ／ａｂ、ＦｅｄＡ／ａｃ、ＦｅｄＥ／ａｂ、ＦｅｄＦ／ａｂ、ＦｅｄＦ／ａｃ的单因子血清的研究，发现Ｆ１８菌毛“ａ”抗原因子分布 于ＦｅｄＡ、ＦｅｄＥ、ＦｅｄＦ亚单位上，“ｂ／ｃ”抗原因子分布于ＦｅｄＡ、ＦｅｄＦ亚单位上。 　　关键词：大肠埃希菌；Ｆ１８菌毛；结构亚单位；抗原因子 中图分类号：Ｓ８５２．６１２ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００７５０３８（２００９）０２０００４０４ 　　Ｆ１８菌毛是蛋白质，具有良好的抗原性，由表达 Ｆ１８菌毛的大肠埃希菌制备的抗体防治仔猪水肿病 和断奶腹泻具有明显的作用［１２］。ＢｅｒｔｓｃｈｉｎｇｅｒＨＵ 等选用遗传易感性仔猪，在断奶前１０ｄ用产Ｆ１８ａｃ 大肠埃希菌培养物口服免疫，连续３ｄ；断奶后９ｄ 或１１ｄ利用产Ｆ１８ａｂ或Ｆ１８ａｃ的大肠埃希菌连续３ ｄ攻击仔猪，结果表明，其对Ｆ１８ａｃ和Ｆ１８ａｂ疫苗的 定居均具有抵抗作用［３］。ＲｉｐｐｉｎｇｅｒＰ等根据Ｆ１８ 的抗原性，将其分为２个抗原变种———Ｆ１８ａｂ和 Ｆ１８ａｃ。血清学试验表明，这些菌毛含有共同的抗原 因子“ａ”，还有特异性抗原因子“ｂ”或“ｃ”；Ｆ１８ａｂ含 有“ａ、ｂ”抗原因子的菌毛，Ｆ１８ａｃ含有“ａ、ｃ”抗原因 　　　收稿日期：２００８１２３１ 　　　基金项目：泰州市科技发展计划项目（ＴＬ０７０３）；扬州大学科技创新培育基金（２００７ＣＸＪ０２５） 　　　作者简介：成大荣（１９７３－），男，江苏赣榆人，副教授，博士，主要从事畜禽病原微生物学研究 櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙 。 ［１１］　卢晟晔，王丽颖．大肠杆菌中外源蛋白高效表达的影响因素 及策略研究的新进展［Ｊ］．中国实验诊断学，２００６，１０（９）： １１００１１０３． 犘狉狅犽犪狉狔狅狋犻犮犈狓狆狉犲狊狊犻狅狀犪狀犱犘狌狉犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳狋犺犲 犈狓狋狉犪犮犲犾犾狌犾犪狉犇狅犿犪犻狀犵犆犌犲狀犲狅犳犘狊犲狌犱狅狉犪犫犻犲狊犞犻狉狌狊犅犪狉狋犺犪犛狋狉犪犻狀 ＬＩＵＱｉｎｇｗｅｉ１，２，ＱＩＵＹａｆｅｎｇ１，ＷＡＮＧＸｉａｏｄｕ１，ＧＵＯＬｉｎ１， ＬＩＵＣｈａｏ１，ＳＨＥＮＹａｎｇ１，ＬＩＸｉａｎｇｄｏｎｇ１，ＳＨＡＮＨｕ２，ＭＡＺｈｉｙｏｎｇ１ （１．犇犲狆犪狉狋犿犲狀狋狅犳犞犲狋犲狉犻狀犪狉狔犘狌犫犾犻犮犎犲犪犾狋犺，犛犺犪狀犵犺犪犻犞犲狋犲狉犻狀犪狉狔犚犲狊犲犪狉犮犺犐狀狊狋犻狋狌狋犲，犆犺犻狀犲狊犲 犃犮犪犱犲犿狔狅犳犃犵狉犻犮狌犾狋狌狉犪犾犛犮犻犲狀犮犲狊，犛犺犪狀犵犺犪犻，２００２４１，犆犺犻狀犪；２．犆狅犾犾犲犵犲狅犳犃狀犻犿犪犾犛犮犻犲狀犮犲犪狀犱犜犲犮犺狀狅犾狅犵狔， 犙犻狌犱犪狅犃犵狉犻犮狌犾狋狌狉犪犾犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔，犙犻狀犱犪狅，犛犺犪狀犱狅狀犵，２６６１０９，犆犺犻狀犪） 犃犫狊狋狉犪犮狋：ＴｏｃｏｎｓｔｒｕｃｔｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｏｆｔｈｅｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｄｏｍａｉｎｇＣｇｅｎｅｏｆＰＲＶ，ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｈｅｇｅｎｅａｎｄｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎｗｅｒｅｃｏｎｄｕｃｔｅｄ．Ａｐａｉｒｏｆｐｒｉｍｅｒｓｗｅｒｅｄｅ ｓｉｇｎｅｄｂａｓｅｄｏｎｔｈｅｇＣｇｅｎｅｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆＰｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓｖｉｒｕｓＢａｒｔｈａｓｔｒａｉｎ（ＰＲＶＢａ）ｐｕｂｌｉｓｈｅｄｉｎＧｅｎＢａｎｋ （ＮＣＥＵ７１９６４１）．ＴｈｅｐａｒｔｉａｌｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｄｏｍａｉｎｇＣｇｅｎｅｏｆＰＲＶＢａｗａｓａｍｐｌｉｆｉｅｄｂｙＰＣＲ，ａｎｄｃｌｏｎｅｄ ｉｎｔｏｐＥＴ２８ａｔｏｃｏｎｓｔｒｕｃｔｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｌａｓｍｉｄ．Ｔｈｅｎｉｔｗａｓｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｉｎｔｏ犈．犮狅犾犻ＢＬ２１ （ＤＥ３）．Ａ３５ｋｕｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎ，ｎａｍｅｄｐＥＴｇＣＮ８１３，ｗａｓｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎｈｉｇｈｙｅｉｌｄａｆｔｅｒＩＰＴＧｉｎｄｕｃｔｉｏｎ． Ｗｈｅｒｅａｆｔｅｒ，ｔｈｅｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎｗａｓｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙｐｕｒｉｆｉｅｄｂｙＨｉｓＢｉｎｄＫｉｔ． 犓犲狔狑狅狉犱狊：Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓｖｉｒｕｓ；ｇＣｇｅｎｅ；ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；ｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎ；ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ 子的菌毛［４］。菌毛抗原多样性赖以产生的基础是基 因的多样性，既可能是较多位点的突变，甚至是某些 位点的插入或缺失，也可能是个别关键位点的突变 所造成［５１１］。菌毛Ｆ１８ａｂ与Ｆ１８ａｃ均由３个结构亚 单位（即ＦｅｄＡ、ＦｅｄＥ和ＦｅｄＦ）组成［１２１４］，那么抗原 因子ａ、ｂ／ｃ就应该分布在ＦｅｄＡ、ＦｅｄＥ和ＦｅｄＦ上。 为证实这一假说，我们在对Ｆ１８菌毛结构亚单位基 因多样性 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 的基础上，进一步表达了这些亚单位， 并利用表达产物制备了这些亚单位抗体，从而为揭 示ＦｅｄＡ、ＦｅｄＥ、ＦｅｄＦ在Ｆ１８菌毛对Ｆ１８菌毛抗原 特性的影响及其在黏附功能中的作用奠定基础。 １　材料与方法 １．１　菌株 表达 Ｆ１８ａｂ菌毛 ＦｅｄＡ 的重组大肠埃希菌 ＰＰＦ１０７Ｇ、表达Ｆ１８ａｃ菌毛ＦｅｄＡ的重组大肠埃希 菌ＰＰＦｅｄＡ／ａｃ、表达Ｆ１８ａｂ菌毛ＦｅｄＥ的重组大肠 埃希菌ＰＰＦｅｄＥ／ａｂ、表达Ｆ１８ａｂ菌毛ＦｅｄＦ的重组 大肠埃希菌ＰＰＦｅｄＦ／ａｂ、表达Ｆ１８ａｃ菌毛ＦｅｄＦ的 重组 大 肠 埃 希 菌 ＰＰＦｅｄＦ／ａｃ［８，１５１７］、含 有 质 粒 ｐＧＥＸ６ｐ１的大肠埃希菌ＢＬ２１，以上菌株均为笔 者构建；大肠埃希菌 ＢＬ２１购自Ｐｈａｒｍａｃｉａ公司； Ｆ１８ａｂ＋大肠埃希菌１０７／８６株、Ｆ１８ａｃ＋大肠埃希菌 ８８１３株、Ｋ８８＋ 大肠埃希菌、Ｋ９９＋ 大肠埃希菌、 ９８７Ｐ＋大肠埃希菌、Ｆ４１＋大肠埃希菌，为扬州大学 兽医微生物实验室收藏菌株。 １．２　抗体 抗Ｆ１８菌毛单抗、抗Ｋ８８菌毛单抗、抗Ｋ９９菌 毛单抗、抗９８７Ｐ菌毛单抗、抗Ｆ４１菌毛单抗，均由 扬州大学兽医微生物实验室保存；羊抗兔荧光抗体 购自北京中杉金桥生物技术有限公司。 １．３　凝集抗原的制备 将Ｆ１８ａｂ＋大肠埃希菌１０７／８６株、Ｆ１８ａｃ＋大肠 埃希菌８８１３株、Ｋ８８＋大肠埃希菌、Ｋ９９＋大肠埃希 菌、９８７Ｐ＋大肠埃希菌、Ｆ４１＋大肠埃希菌分别接种 到ＴＳＢ培养基中，３７℃静置培养２４ｈ，并连续培养 ３代。取第３代培养物，１００００ｒ／ｍｉｎ离心１ｍｉｎ， 去上清，沉淀用８．５ｇ／Ｌ生理盐水洗涤悬浮至浓度 约１×１０１０ｃｆｕ／ｍＬ后以相应单抗确定菌毛表达与 否。 １．４　免疫抗原的制备 取重组大肠埃希菌 ＰＰＦ１０７Ｇ、ＰＰＦｅｄＡ／ａｃ、 ＰＰＦｅｄＥ／ａｂ、ＰＰＦｅｄＦ／ａｂ、ＰＰＦｅｄＦ／ａｃ，分别按照报 道的方法进行诱导表达并进行超声波裂解［１５１８］。取 大肠埃希菌ＰＰＦ１０７Ｇ、ＰＰＦｅｄＡ／ａｃ裂解物的离心后 上清，取 大 肠 埃 希 菌 ＰＰＦｅｄＥ／ａｂ、ＰＰＦｅｄＦ／ａｂ、 ＰＰＦｅｄＦ／ａｃ裂解物的离心后沉淀，分别进行ＳＤＳ ＰＡＧＥ。取ＳＤＳＰＡＧＥ电泳染色后的凝胶，分别切 取重组蛋白 ＧＳＴＦｅｄＡ／ａｂ、ＧＳＴＦｅｄＡ／ａｃ、ＧＳＴ ＦｅｄＥ／ａｂ、ＧＳＴＦｅｄＦ／ａｂ、ＧＳＴＦｅｄＦ／ａｃ相应分子质 量处的的蛋白条带并充分研磨；测定蛋白浓度后，作 为免疫抗原。 １．５　动物的免疫与血清分离 肌肉注射免疫成年健康家兔（购自扬州大学医 学院），共免疫３次，每次间隔２周，最后一次免疫 １０ｄ后心脏采血，５０００ｒ／ｍｉｎ离心分离血清。 １．６　免疫血清的检测 以玻板凝集法进行，取 Ｆ１８ａｂ＋ 大肠埃希菌 １０７／８６株、Ｆ１８ａｃ＋大肠埃希菌８８１３株的悬浮液，分 别 与 兔 抗 ＧＳＴＦｅｄＡ／ａｂ、ＧＳＴＦｅｄＡ／ａｃ、ＧＳＴ ＦｅｄＥ／ａｂ、ＧＳＴＦｅｄＦ／ａｂ、ＧＳＴＦｅｄＦ／ａｃ血清进行 玻板凝集试验，室温下作用３ｍｉｎ后，观察凝集现 象。同时设立Ｋ８８＋、Ｋ９９＋、９８７Ｐ＋、Ｆ４１＋大肠埃希 菌阴性对照，以及无抗体的空白对照检查细菌自凝 现象。 １．７　免疫血清的处理 取兔 抗 ＧＳＴＦｅｄＡ／ａｂ、ＧＳＴＦｅｄＡ／ａｃ、ＧＳＴ ＦｅｄＥ／ａｂ、ＧＳＴＦｅｄＦ／ａｂ、ＧＳＴＦｅｄＦ／ａｃ血清，分别 与过量的含有质粒ｐＧＥＸ６ｐ１的大肠埃希菌ＢＬ２１ 裂解物混合，于３７℃作用２ｈ以去除抗ＧＳＴ抗体； 然后１２０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，取上清。兔抗ＧＳＴ ＦｅｄＡ／ａｂ、ＧＳＴＦｅｄＥ／ａｂ、ＧＳＴＦｅｄＦ／ａｂ血清分别 与过量的表达Ｆ１８ａｃ菌毛的大肠埃希菌８８１３株混 合，而兔抗ＧＳＴＦｅｄＡ／ａｃ、ＧＳＴＦｅｄＦ／ａｃ血清分别 与过量的表达Ｆ１８ａｂ菌毛的大肠埃希菌１０７／８６株 混合；４℃作用过夜后，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，取 上清即作为相应亚单位的单因子血清。 １．８　Ｆ１８抗原特性的研究 取Ｆ１８ａｂ＋大肠埃希菌１０７／８６株、Ｆ１８ａｃ＋大肠 埃希菌８８１３株，分别利用步骤１．２．４中制备的兔抗 ＦｅｄＡ／ａｂ、ＦｅｄＡ／ａｃ、ＦｅｄＥ／ａｂ、ＦｅｄＦ／ａｂ、ＦｅｄＦ／ａｃ单 因子血清和羊抗兔ＩｇＧ 荧光标记抗体分别与 Ｆ１８ａｂ＋大肠埃希菌１０７／８６株、Ｆ１８ａｃ＋大肠埃希菌 ８８１３株进行间接荧光染色，以出现特异性荧光菌体 或菌团为阳性；并判断Ｆ１８菌毛抗原因子ａ、ｂ、ｃ的 与ＦｅｄＡ、ＦｅｄＥ、ＦｅｄＦ的关系。 ２　结果 ２．１　凝集抗原的制备 玻板凝集试验表明，Ｆ１８ａｂ＋大肠埃希菌１０７／８６ 株、Ｆ１８ａｃ＋ 大 肠 埃 希 菌 ８８１３ 株、Ｋ８８＋、Ｋ９９＋、 ５成大荣等：大肠埃希菌Ｆ１８菌毛结构亚单位抗原特性的研究 ９８７Ｐ＋、Ｆ４１＋大肠埃希菌均能良好的表达相应的菌 毛。 ２．２　免疫血清的检测 本试验共制备了５种血清，分别为兔抗 ＧＳＴ ＦｅｄＡ／ａｂ 血 清、兔 抗 ＧＳＴＦｅｄＡ／ａｃ 血 清、兔 抗 ＧＳＴＦｅｄＥ／ａｂ血清、兔抗ＧＳＴＦｅｄＦ／ａｂ血清、兔抗 ＧＳＴＦｅｄＦ／ａｃ血清；玻板凝集试验表明，５种血清均 能与Ｆ１８ａｂ＋大肠埃希菌１０７／８６株、Ｆ１８ａｃ＋大肠埃 希菌８８１３株均发生玻板凝集反应，而与其他对照细 菌（Ｋ８８＋、Ｋ９９＋、９８７Ｐ＋、Ｆ４１＋大肠埃希菌）均为阴 性；这揭示了ＦｅｄＡ、ＦｅｄＥ、ＦｅｄＦ均带有Ｆ１８ａｂ和 Ｆ１８ａｃ的共同决定簇。 ２．３　Ｆ１８抗原特性的研究 本试验共制备了５种单因子血清，分别为抗 ＦｅｄＡ／ａｂ单因子血清、抗ＦｅｄＡ／ａｃ单因子血清、抗 ＦｅｄＥ／ａｂ单因子血清、抗ＦｅｄＦ／ａｂ单因子血清、抗 ＦｅｄＦ／ａｃ单因子血清；分别与Ｆ１８ａｂ＋ 大肠埃希菌 １０７／８６株、Ｆ１８ａｃ＋大肠埃希菌８８１３株进行荧光抗 体染色，结果发现，抗 ＦｅｄＡ／ａｂ单因子血清、抗 ＦｅｄＦ／ａｂ单因子血清均仅与 Ｆ１８ａｂ＋ 大肠埃希菌 １０７／８６株反应，抗ＦｅｄＡ／ａｃ单因子血清、抗ＦｅｄＦ／ ａｃ单因子血清均仅与Ｆ１８ａｃ＋大肠埃希菌８８１３株反 应，表明ＦｅｄＡ、ＦｅｄＦ上带有Ｆ１８ａｂ或Ｆ１８ａｃ的特异 性决定簇；而抗ＦｅｄＥ／ａｂ血清经Ｆ１８ａｃ＋大肠埃希 菌８８１３株吸收后，与Ｆ１８ａｂ＋大肠埃希菌１０７／８６株 和Ｆ１８ａｃ＋ 大肠埃希菌８８１３株均不反应，揭示了 ＦｅｄＥ上带有Ｆ１８ａｂ和Ｆ１８ａｃ的共同决定簇（表１）。 表１　各单因子血清分别与Ｆ１８ａｂ＋和Ｆ１８ａｃ＋大肠埃希菌的 　　 荧光染色结果 Ｔａｂｌｅ１　ＩｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｃｅｎｃｅｏｆＦ１８ａｂ＋ａｎｄＦ１８ａｃ＋犈．犮狅犾犻ｓｔｒａｉｎｂｙ 　　　　ｕｓｉｎｇｔｈｅｆｉｖｅｓｉｎｇｌｅｆａｃｔｏｒｓｅｒｕａｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ 单因子血清 Ｓｉｎｇｌｅｆａｃｔｏｒｓｅｒｕｍ 大肠埃希菌菌株 犈．犮狅犾犻ｓｔｒａｉｎｓ １０７／８６ ８８１３ 抗ＦｅｄＡ／ａｂ单因子血清 ＳｉｎｇｌｅｆａｃｔｏｒｓｅｒｕｍｏｆＦｅｄＡ／ａｂ ＋ － 抗ＦｅｄＡ／ａｃ单因子血清 ＳｉｎｇｌｅｆａｃｔｏｒｓｅｒｕｍｏｆＦｅｄＡ／ａｃ － ＋ 抗ＦｅｄＥ／ａｂ单因子血清 ＳｉｎｇｌｅｆａｃｔｏｒｓｅｒｕｍｏｆＦｅｄＥ／ａｂ － － 抗ＦｅｄＦ／ａｂ单因子血清 ＳｉｎｇｌｅｆａｃｔｏｒｓｅｒｕｍｏｆＦｅｄＦ／ａｂ ＋ － 抗ＦｅｄＦ／ａｃ单因子血清 ＳｉｎｇｌｅｆａｃｔｏｒｓｅｒｕｍｏｆＦｅｄＦ／ａｃ － ＋ ３　讨论 Ｆ１８菌毛是ＳＴＥＣ和ＥＴＥＣ的重要黏附因子。 与Ｆ１８菌毛相关的基因已发现５个，即ｆｅｄＡ、ｆｅｄＢ、 ｆｅｄＣ、ｆｅｄＥ和ｆｅｄＦ，分别编码５种蛋白，即ＦｅｄＡ、 ＦｅｄＢ、ＦｅｄＣ、ＦｅｄＥ和ＦｅｄＦ［１０］。ＦｅｄＡ 是主要结构 亚单位，构成Ｆ１８菌毛的主干；ＦｅｄＢ、ＦｅｄＣ主要是 一些与Ｆ１８菌毛的合成、装配、成熟相关的伴侣蛋 白或运输蛋白。ＦｅｄＥ和ＦｅｄＦ是Ｆ１８菌毛的次要 结构亚单位蛋白，为Ｆ１８菌毛黏附所必需并影响菌 毛的长度。既然菌毛Ｆ１８ａｂ与Ｆ１８ａｃ均由３个结构 亚单位（即ＦｅｄＡ、ＦｅｄＥ和ＦｅｄＦ）组成，那么抗原因 子ａ、ｂ／ｃ就应该分布在 ＦｅｄＡ、ＦｅｄＥ和 ＦｅｄＦ上。 为了证实这一假说，该研究在对Ｆ１８菌毛结构亚单 位基因多样性分析和成功表达了这些结构亚单位的 基础上，进一步制备了这些亚单位的抗体，从而揭示 了ＦｅｄＡ、ＦｅｄＥ、ＦｅｄＦ在Ｆ１８菌毛对Ｆ１８菌毛抗原 特性的影响。 多价免疫血清的凝集试验表明，无论是主要结 构亚单位ＦｅｄＡ，还是次要结构亚单位ＦｅｄＥ、ＦｅｄＦ 的抗体均能凝集Ｆ１８ａｂ＋和Ｆ１８ａｃ＋大肠埃希菌。这 揭示了ＦｅｄＡ、ＦｅｄＥ、ＦｅｄＦ均与Ｆ１８菌毛的抗原性 密切相关，即ＦｅｄＡ、ＦｅｄＥ、ＦｅｄＦ均分布有与Ｆ１８菌 毛的抗原性有关的抗原决定簇。而ＦｅｄＡ／ａｂ单因 子血清只与Ｆ１８ａｂ＋大肠埃希菌呈现荧光抗体染色 阳性；ＦｅｄＡ／ａｃ单因子血清只与Ｆ１８ａｃ＋大肠埃希菌 呈现荧光抗体染色阳性；ＦｅｄＦ／ａｂ单因子血清只与 Ｆ１８ａｂ＋大肠埃希菌呈现荧光抗体染色阳性；ＦｅｄＦ／ ａｃ单因子血清只与Ｆ１８ａｃ＋大肠埃希菌呈现荧光抗 体染色阳性；ＦｅｄＥ／ａｂ单因子血清与 Ｆ１８ａｂ＋ 和 Ｆ１８ａｃ＋大肠埃希菌均不呈现荧光抗体染色阳性。 通过这些结果可以看出，Ｆ１８菌毛的“ａ”抗原因子可 分布于ＦｅｄＡ、ＦｅｄＥ、ＦｅｄＦ，而“ｂ或ｃ”则分布于Ｆｅ ｄＡ、ＦｅｄＦ。 菌毛抗原多样性赖以产生的基础是基因的多样 性，既可能是较多位点的突变，甚至是某些位点的插 入或缺失，也可能是个别关键位点的突变所造成。 通过对不同Ｆ１８＋菌株的结构基因的克隆与序列分 析［５８］，发现Ｆ１８ａｂ和Ｆ１８ａｃ菌毛的ｆｅｄＡ分为２个 基因群———ｆｅｄＡ／ａｂ和ｆｅｄＡ／ａｃ，且与已知的抗原分 群吻合；Ｆ１８ａｂ和Ｆ１８ａｃ菌毛的ｆｅｄＥ基因高度同 源，表明了 ＦｅｄＥ 是 Ｆ１８菌毛的保守性亚单位； Ｆ１８ａｂ和Ｆ１８ａｃ菌毛的ｆｅｄＦ基因也可分为２个基 因分支，且与已知的抗原分群吻合。本试验的结果 恰恰证实了Ｆ１８ａｂ和Ｆ１８ａｃ抗原的差异与ＦｅｄＡ、 ＦｅｄＦ上这些位点突变的密切相关。 ６ 动物医学进展　２００９年　第３０卷　第２期（总第１８７期） 犛狋狌犱狔狅狀犃狀狋犻犵犲狀犻犮犆犺犪狉犪犮狋犲狉犻狊狋犻犮狊狅犳狋犺犲犛狌犫狌狀犻狋狊狅犳犈．犮狅犾犻犉犻犿犫狉犻犪犉１８ ＣＨＥＮＧＤａｒｏｎｇ１，ＺＨＵＳｈａｎｙｕａｎ２，ＱＩＡＮＪｉｎｍｅｉ１，ＤＯＮＧＢｉｎｇｍｉｎ１ （１．犆狅犾犾犲犵犲狅犳犞犲狋犲狉犻狀犪狉狔犕犲犱犻犮犻狀犲，犢犪狀犵狕犺狅狌犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔，犢犪狀犵狕犺狅狌，犑犻犪狀犵狊狌，２２５００９，犆犺犻狀犪； ２．犑犻犪狀犵狊狌犃狀犻犿犪犾犎狌狊犫犪狀犱狉狔犪狀犱犞犲狋犲狉犻狀犪狉狔犆狅犾犾犲犵犲，犜犪犻狕犺狅狌，犑犻犪狀犵狊狌，２２５３００，犆犺犻狀犪） 犃犫狊狋狉犪犮狋：Ｆｉｖｅｋｉｎｄｓｏｆｔｈｅ犈狊犮犺犲狉犻犮犺犻犪犮狅犾犻ｆｉｍｂｒｉａＦ１８ｓｕｂｕｎｉｔｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｔｅｉｎｓ：ＧＳＴＦｅｄＡ／ａｂ， ＧＳＴＦｅｄＡ／ａｃ，ＧＳＴＦｅｄＥ／ａｂ，ＧＳＴＦｅｄＦ／ａｂａｎｄＧＳＴＦｅｄＦ／ａｃｗｅｒｅｅｘｔｒａｃｔｅｄｗｉｔｈＳＤＳＰＡＧＥｍｅｔｈｏｄ． Ｆｉｖｅｇｒｏｕｐｓｏｆｒａｂｂｉｔｓｗｅｒｅｉｍｍｕｎｉｚｅｄｗｉｔｈｔｈｅｆｉｖｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｓｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ａｎｄｆｉｖｅｋｉｎｄｓｏｆ ａｎｔｉｓｅｒａ：ａｎｔｉＧＳＴＦｅｄＡ／ａｂ，ａｎｔｉＧＳＴＦｅｄＡ／ａｃ，ａｎｔｉＧＳＴＦｅｄＥ／ａｂ，ａｎｔｉＧＳＴＦｅｄＦ／ａｂａｎｄａｎｔｉＧＳＴ ＦｅｄＦ／ａｃｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｔｈｅｄｉｒｅｃｔａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎｔｅｓｔｏｆｔｈｅｆｉｖｅｋｉｎｄｓｏｆａｎｔｉｓｅｒａｂｙｕｓｉｎｇ Ｆ１８ａｂｐｏｓｉｔｉｖｅ犈．犮狅犾犻ｓｔｒａｉｎＦ１０７／８６ａｎｄＦ１８ａｃｐｏｓｉｔｉｖｅ犈．犮狅犾犻ｓｔｒａｉｎ８８１３ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｓｈｏｗｅｄｔｈａｔａｎｔｉ ＧＳＴＦｅｄＡ／ａｂ，ａｎｔｉＧＳＴＦｅｄＡ／ａｃ，ａｎｔｉＧＳＴＦｅｄＥ／ａｂ，ａｎｔｉＧＳＴＦｅｄＦ／ａｂａｎｄａｎｔｉＧＳＴＦｅｄＦ／ａｃａｌｌ ｃｏｕｌｄｒｅｃｏｇｎｉｚｅＦ１８ａｂａｎｄＦ１８ａｃ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｔｅｓｔｓｂｙｕｓｉｎｇｓｉｎｇｌｅｆａｃｔｏｒｓｅｒａｏｆ ＦｅｄＡ／ａｂ，ＦｅｄＡ／ａｃ，ＦｅｄＥ／ａｂ，ＦｅｄＦ／ａｂａｎｄＦｅｄＦ／ａｃｃｏｎｆｉｒｍｅｄｔｈａｔｔｈｅａｎｔｉｇｅｎｉｃｆａｃｔｏｒ“ａ”ｗａｓｃｏｒｒｅｌａ ｔｉｖｅｔｏＦｅｄＡ，ＦｅｄＥ，ａｎｄＦｅｄＦ，ａｎｄａｎｔｉｇｅｎｉｃｆａｃｔｏｒｓ“ｂ，ｃ”ｗｅｒｅｃｏｒｒｅｌａｔｉｖｅｔｏＦｅｄＡａｎｄＦｅｄＦ． 犓犲狔狑狅狉犱狊：犈狊犮犺犲狉犻犮犺犻犪犮狅犾犻；ｆｉｍｂｒｉａＦ１８；ｓｕｂｕｎｉｔ；ａｎｔｉｇｅｎｉｃｆａｃｔｏｒ 参考文献 见《动物医学进展》２００９年第２期 ７成大荣等：大肠埃希菌Ｆ１８菌毛结构亚单位抗原特性的研究