酵母双杂交protocol

BD Matchmaker 目录 （1）​ 介绍 4 （2）​ 试剂盒物品清单 7 （3）​ 额外附加物品列表 9 （4）​ 酵母菌株 11 （5）​ 酵母载体 14 （6）​  方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 简述：单杂交文库的构建和筛选 16 方法简述：双杂交文库的构建和筛选 17 （7）​ 构建用于酵母单杂交的报告质粒载体 18 （8）​ 构建用于酵母双杂交的DNA-BD融合载体 19 （9）​ 构建生成cDNA文库 21 （10）​ 构建和筛选酵母单杂交和双杂交文库（简述） 27 （11）​ 酵母单杂交文库的构建和筛选 28 （12）​ 酵母双杂交文库的构建和筛选 30 方法A:通过酵母配对（Yeast Mating）来筛选目的蛋白 30 方法B:通过共转化的方法筛选目的蛋白 35 （13）​  分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 阳性相互作用结果 38 （14）​ 问题解决指南 44 （15）​ 参考文献 47 （16）​ 相关产品 50 附录A: 双链 cDNA合成的典型结果 51 附录B: 酵母感受态的制备—LiAc 法 52 附录C： 单杂交对照载体信息 53 附录D： 双杂对照载体信息 54 表格列表 Table I． BD Matchmaker酵母菌株的基因型 11 Table II． BD Matchmaker酵母菌株的表型 11 Table III．单杂交系统的载体 14 Table IV． 双杂交系统的载体 15 Table V． 各BD-Matchmaker DNA-BD 载体的比较 19 Table VI． RNA起始浓度和PCR扩增循环数之间的关系 24 Table VII．单杂交共转化的对照实验的设置 29 Table VIII．单杂共转化对照实验：期望的结果 29 Table IX． 双杂交转化的对照实验的设置 33 Table X． 双杂交配对筛选的对照实验的设置 Table XI． 双杂交共转化的对照实验的设置 Table XII． 双杂交共转化的对照实验：期望的结果 Table XIII． 用于PCR筛选菌落的Assembling Master Mixs 图片列表 Figure 1．使用BD Matchmaker单杂交系统筛选蛋白-DNA相互作用 4 Figure 2．使用BD Matchmaker单杂交系统筛选蛋白-蛋白相互作用 4 Figure 3．酵母单杂交和双杂交筛选的大致步骤 5 Figure 4．构建和筛选BD Matchmaker酵母单杂交和双杂交文库 6 Figure 5．酵母菌株AH109和Y187中的报告基因 12 Figure 6．BD Matchmaker酵母单杂交文库的构建和筛选 16 Figure 7．BD Matchmaker酵母双杂交文库的构建和筛选 17 Figure 8．用BD SMART技术合成高质量的ds cDNA 21 Figure 9．BD CHROMA SPIN纯化柱和收集管 26 Figure 10．通过酵母重整合作用来构建AD融合文库 27 Figure 11．为双杂交筛选AD融合文库 32 Figure 12．分析和证明可能的单杂交和双杂交相互作用阳性结果的策略 39 Figure 13．通过酵母配对来验证蛋白-蛋白相互作用 42 Figure 14．用对照用人胎盘Poly A+ RNA合成双链cDNA 51 Figure 15．p53HIS对照载体的图谱 53 Figure 16．pGAD-Rec2-53 AD对照载体的图谱 53 Figure 17．pGADT7-RecT AD对照载体的图谱 54 Figure 18．pGBKT7-53 DNA-BD 对照载体图谱 54 Figure 19．pGBKT7-Lam DNA-BD 对照载体图谱 55 （一） 介绍 BD MatchmakerTM Library Construction & Screening试剂盒提供一种简便的方法构建cDNA文库用来进行酵母双杂交和单杂交的筛选，这些试剂盒结合了BD Matchmaker TM Systems和BD SMART TM cDNA Synthesis的技术，只需要用任何组织的1 μg poly A+ RNA 或total RNA就能构建cDNA文库。 通过一般细胞内克隆步骤，你能利用BD Matchmaker Systems所提供的灵敏的转录方法所构建的文库来进行单杂交或双杂交实验。 单杂交实验的原理——蛋白-DNA相互作用实验 单杂交实验使你能够确定和描述蛋白与目的顺式DNA激活序列的绑定，该序列可能是处于最小限度的启动子上游的用于增强转录的元件。这个实验也可以用于预测或新蛋白的DNA绑定结构域的确定。通过BD Matchmaker One-Hybrid System你可以很容易的获得这些基因表达的蛋白 在BD Matchmaker One-Hybrid实验中，潜在的DNA绑定蛋白基因是与克隆在pGADT7-Rec2（为单杂交设计的低拷贝载体）上GAL4激活结构域（AD）序列一起融合表达的。一个或多个目的DNA序列的串联拷贝被构建在pHIS2（含有HIS3营养缺陷报告基因的报告载体）。DNA绑定蛋白和目标序列的相互作用会激活HIS3的转录（Figure 1），该过程要在宿主菌株Y187（组氨酸缺陷型）中进行并在缺少组氨酸的培养基生长 双杂交实验的原理——蛋白-蛋白相互作用的原理 双杂实验分析能用于鉴定新的蛋白与蛋白相互作用、确定疑似作用、明确结构域。在一个BD Matchmaker双杂交实验分析中，诱饵基因是与GAL4 DNA（DNA-BD）绑定结构域序列融合表达的，同时其他的基因或其cDNA与GAL4激活域（AD）序列融合表达（Fields & Song, 1989; Chien et al., 1991）。当诱饵与文库融合蛋白在AH109（ADE2, HIS3, lacZ, MEL1）这样的报告菌株中相互作用， DNA-BD和 AD相接近结合，并激活报告基因转录（Figure 2) DNA-BD 和AD的融合序列是将cDNA序列克隆进酵母表达载体pGBKT7 和pGADT7-Rec载体中来实现的。pGBKT7表达了与GAL4 DNA-BD融合的蛋白，而 pGADT7-Rec表达与GAL4 AD相融合的蛋白。在酵母中，两种融合基因在组成型启动子PADH1下高水平表达的。其他的像pGBT9、ADH1、pAS2-1、pBridge基于GAL4的克隆载体与这个试剂盒也相兼容的。pBridge载体能被用于鉴定三蛋白复合体的酵母三杂交实验。 双杂和单杂文库的建立和筛选 双杂和单杂文库的建立和筛选由四个主要步骤组成，（注：有两个步骤遵从同样的流程）。 如果想去筛选双杂交相互作用，第一步是建立一种DNA-BD融合载体。第二步是使用试剂盒所提供BD SMART试剂从你所抽提poly A 和total RNA建立cDNA文库。 就酵母双杂筛选而言，如果你打算我们从预制的BD Matchmaker cDNA文库选取来替代自己准备文库，可以跳过RNA分离、cDNA合成、AD融合文库构建。这些包含非常广泛组织的文库被有效的保存在甘油中或预转化到Y187酵母菌株。我们也提供一种BD Matchmaker文库服务，基于这个服务，提供给我们你想筛选的组织与细胞，我们为你制作AD融合文库。请注意，我们尽管在高拷贝酵母表达载体中建立了很多的预制和预转化的BD Matchmaker cDNA文库，对双杂工作非常理想的，但他们很少适合单杂分析。在单杂分析中我们推荐使用pGADT7-Rec2 and pHIS2等低拷贝载体，因为他们产生较少的假阳性克隆。 其次是cDNA合成，把cDNA克隆到BD Matchmaker AD克隆载体中建立一个GAL4 AD融合文库，如果是建立双杂文库是pGADT7-Rec载体，单杂则是pGADT7-Rec2载体。克隆在细胞内通过同源重组来进行的，这一步利用酵母替内高效重组系统使ds cDNA和相应的GAL4 AD质粒融合。采用重组介导的克隆，文库的构建和筛选能紧密的完成，而不需要任何的细菌转化和扩增步骤。简单的把cDNA文库和相应的BD Matchmaker载体转化到酵母中，然后把细胞用于成分缺省培养基筛选双杂作用。 Figure 3. 酵母单杂和双杂筛选的一般步骤，更加详细单杂和双杂筛选流程图，请参考Figures 6 and 7. Figure 4. BD MatchmakerTM 单杂和双杂文库筛选与构建. 如这个图表所示，As this diagram shows,重组介导克隆使文库构建和筛选更快捷高效，尽管这里没有显示，双杂文库能通过酵母融合筛选（细节参照Section XII）.BD SMARTTM 的cDNA合成和扩增，请参照Section IX. pGADT7-Rec被用于双杂文库构建和筛选而 pGADT7-Rec2被用于单杂文库构建和筛选。被pGADT7-Rec[2]所显示的两个相关载体有不同复制元件。更多的信息请参照Section X 和相关的载体信息包.i （二）试剂盒内试剂列表 此试剂盒包含有足够试剂能制备5次单杂或5次双杂文库。 去离子水、BD CHROMA SPIN柱,、NaCl溶液、缺省(DO)补充物、NaOAc、LiAc、PEG、TE Buffer,、YPD Plus培养基在室温下保存；.酵母菌株、对照Poly A +和BD SMART III Oligo保存在–70°C，其他试剂储存在–20°C.下。 cDNA第一条链合成 cDNA扩增 Trial –Size BD Advantage TM PCR 试剂盒 cDNA 纯化 单杂交文库构建 双杂交文库构建 BD Yeastmaker 酵母转化系统 （三）自备 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 下列试剂自备，无其他特别要求所有的试剂与溶液均储存与室温下。 cDNA第一条链合成 ​ 无菌0.5ml离心管 ​ Poly A+ or total RNA ​ 矿物油 ​ 热循环仪 ​ DNA marker (1-kb DNA ladder) ​ 1.2% Agarose/EtBr gel cDNA的分离 ​ 1.5ml无菌离心管 ​ 带有小架子环型支架 ​ 95%乙醇（-20℃） ​ 1% 氯代二甲苯 诱饵质粒构建 ​ E. coli感受态细胞。像DH5α or BD Fusion-Blue 感受态细胞 ​ T4 DNA连接酶 ​ 10X T4 连接buffer ​ LB/amp 平板 ​ 50 mM NaCl ​ 从E. coli转化子中提取质粒的试剂盒 酵母转化（在无菌容器中准备试剂） ​ PEG/LiAc溶液 ​ 1.1X TE/LiAc溶液 ​ 二甲亚砜 酵母的培养与配对 ​ YPD培养基(参照Yeast Protocols Handbook) ​ YPDA培养基（添加30 mg/L adenine hemisulfate，参照Yeast Protocols Handbook） ​ TE buffer或者无菌的蒸馏水 ​ 适合转化的无菌试管和烧瓶 ​ 100-和150-培养平板 ​ 无菌玻璃棒，用于扑板弯曲的吸管 ​ X-α-Gal（用于酵母双杂MEL1表达的蓝白筛选） ​ 有agar的Minimal SD Base和没有agar的Minimal SD Base ​ 3-AT（抑制SD缺省his培养基背景生长） ​  Kanamycin 储存液（ 50 mg/ml ）保存于-20℃ ​  Ampicillin 储存液（ 50 mg/ml ）保存于-20℃ 文库长期保存 ​ 100%甘油 ​ YPD冷冻培养基（25%v/v甘油） 酵母双杂文库的构建与筛选 BD Matchmaker Two-Hybrid Library Construction & Screening Kit不提供下列缺省补充物。用户必须自己从其他公司购买或者按照Yeast Protocols Handbook的附录C的配比自己准备。 ​ Trp DO Supplement ​ –His/–Leu/–Trp DO Supplement ​ –His/–Trp DO Supplement ​ –Ade/–Trp DO Supplement PCR 克隆筛选 ​ BD Matchmaker GAL4 AD LD-Insert Screening Amplimer Set IV．酵母菌株 酵母生长和保藏的其它信息，请参考Yeast Protocols Handbook。我们也推荐Guthrie & Fink的Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology (1991)和Heslot & Gaillardin的Molecular Biology and Genetic Engineering of Yeasts (1992)。 A 基因型 TABLE I. BD MATCHMAKERTM酵母的基因型 a．GAL1, GAL2和 MEL1 的上游激活序列（UASs）应答于GAL4转录激活因子。trp1,his3, gal4和 gal80的突变都被删除；leu2-3, 112是一个双突变。 b. AH109衍生于 PJ69-2A菌株，包括ADE2 、HIS3营养标记和一个内源的MEL1基因(James et al., 1996)。lacZ 报告基因被引入PJ69-2A 而得到AH109菌株。 B.表现型 验证AH109 和Y187表现型是很重要的(Table II)。 1.​ 复苏冻存的菌株，用无菌环或者牙签挑少量的细胞划到YPDA平板上。 2.​ 30°C温育平板3到5天直到克隆出现，从这个工作平板上分离克隆增殖其他的平板。 3.​ 按照Table II测试营养需求 a.​ 用无菌环或者牙签，从工作平板上划3-4个克隆带单个合适的SD选择平板上。 b.​ 30°C温育平板3到6天。酵母在SD选择培养基生长比YPDA培养基上要慢一些。 c.​ 参照Table II比对你的结果，只有AH109 和Y181是期望的表现型才继续进行。 4.​ 进行菌株融合或准备感受态细胞的液体培养，要使用已分离好经过验证工作平板克隆，用保鲜膜密封好经过表型验证的工作平板，包藏在4°C。 TABLE II .BD MATCHMAKER酵母菌株的表型 注： ​ 如果TRP1 和LEU2功能基因被导入，AH109 和Y187能够在SD/–Leu/–Trp上生长。 ​ 如果AH109携带ADE2 and HIS3基因被激活，AH109 and AH109/Y187 二倍体能在SD/–Ade/–His生长。(i.e., in the presence of GAL4). C可配对的菌株 Y187 (MATα)能够与AH109, HF7c, CG-1945, Y190或 SFY526 (all MATa)相融合。 D. 克隆的颜色和大小 ​ Y187携带的ade2-101突变和AH109在缺乏GAL4显示Ade-表型。在低含量的ade 培养基上，克隆在几天后将变成粉红色，并在克隆老化后可能变暗。在补充Ade的培养基上生长时，颜色变化不显著。这些克隆生长到直径>2 mm。由于自发缺失线粒体功能的突变，会形成1–2%小的白色克隆。温育培养时要避免这些白色克隆。 ​ 总体上Y187比AH109生长慢并形成明显较小的克隆。 E.报告基因 AH109包含四个在三个远距离GAL4上游调空序列(UASs)和TATA boxes调控下的ADE2, HIS3, MEL1和 lacZ四个报告基因(Figure 5)。ADE2报告基因针对ADE2 and HIS3，单独提供强的高严紧度的营养选择，减少假阳性率(James et al., 1996)。你也可以选择分析编码α-galactosidase的MEL1。由于α-galactosidase是一种内分泌酶，MEL1对于Y187和 AH109两者是内源性的，可以通过添加X-α-Ga到选择平板来检测他的的活性，如果X-α-Gal存在，MEL1被激活，克隆将变成兰色。由于在完整的GAL1 UAS调控下，在阳性的双杂分析中Y187的lacZ表现出高水平的诱导β-galactosidase活性。 Figure 5. 酵母菌株AH109 和Y187中的报告基因。AH109是由PJ69-2A派生而来，包括了ADE2和HIS3两个营养合成基因（James et al., 1996）。MEL1是GAL4的内源效应基因。lacZ报告基因被引入PJ69-2A而建成AH109。HIS3，ADE2 和MEL1/lacZ报告基因都在不完全的GAL4效应序列和启动子元件GAL1，GAL2，MEL1的分别控制下 F. 缺失HIS3的表达 ​ 3-AT是酵母HIS3蛋白的竞争性抑制剂。它被用于在缺省方式下阻止低水平的His3p的表达，抑制缺省his SD培养基的北京生长。 ​ 由于诱饵蛋白内在的dna结合特性，源于AH109的转化子可能表现出稍高HIS3表达。通常少量3-AT足以抑制SD/–His上的背景生长。然而，如果你的选择是针对his3和 ade2两者共同表达的，在初始文库筛选中没有必要去抑制缺省的HIS3。 ​ 某些酵母菌株有相对较高本底水平的His3p，如果你使用Y190作为宿主菌，在培养基中需要25–45 mM 3-AT去抑制背景生长。 ​ 在你的选择培养基中优化3-AT的浓度 在你开始这个步骤以前，注意这个试剂盒不提供–His/–Trp缺省补充物，你必须自己单独购买或者按照Yeast Protocols Handbook的目录c的配比自己准备。 1.​ 铺酵母转化子于一系列的不同3-AT浓度的SD/–His/–Trp平板上。 ​ 如果你采用是包含有像pGBKT7这样 DNA-BD质粒的AH109转化子，我们推荐你从0 到15 mM之间开始测试3-AT的浓度（0,2.5, 5, 7.5, 10, 12.5, 15 mM） ​ 如果你是采用包含有pHIS2报告质粒Y187转化子，我推荐你从10 到60 mM之间测试3-AT的浓度。 注：这些仅仅是推荐，优化浓度的高低主要依赖于使用的构件和菌株。 2.​ 使用低浓度的3-AT，一周后，仅允许小的克隆去生长。培养基中太多的3-AT能 新的转化细胞。 （五）.酵母载体 A．单杂交系统 1、克隆载体 ​ 信号载体pHIS2：cis-acting DNA片段插在HIS3营养报告基因的上游多克隆位点（MCS）上，与HIS3基因（PminHIS3）启动子区相链接。在信号载体上还有一段高度保守的低拷贝的CEN6/ARS4序列。 ​ 克隆载体pGADT7-Rec2: 表达一个与GAL4 激活结构域(AD)相融合的蛋白，用于酵母中同源重组介导的克隆（图4）。因此用户可以用Sma1消化的pGADT7-Rec2（提供的）和ds cDNA（BD SMART文库构建法得到的）（Section IX）通过酵母转化构建cDNA/AD融合文库。 2、对照载体（附录C） ​ 阳性对照载体p53HIS2：由DNA片段（包含至少3个连续拷贝的p53 cis-acting DNA序列）插在pHIS2载体的多克隆位点上构成。插入片段在载体中HIS3基因（PminHIS3）及其启动子的上游。 ​ 阳性对照载体pGAD-Rec2-53：编码一个融合于GAL4 AD的鼠源p53蛋白。包含p53HIS2和pGAD-Rec2-53的酵母细胞可以在缺组氨酸的SD培养基（如SD/–His/–Leu/–Trp）上生长。 a、HA是血凝素，这些免疫标记用于通过体外的免疫共沉淀来鉴定蛋白与蛋白相互作用，使用的抗体和实验 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 由BD Matchmaker Co-IP 试剂盒提供。它们不适用于检测、亲合纯化和酵母内表达蛋白的免疫共沉淀。 b、通过SV40 Large T PCR Fragment和 pGADT7-Rec共转化，在体内同源重组产生的。 c、DNA-BD 和AD载体有不同的营养标记，酵母转化子被涂布在缺少特定成分的基础培养基他们可以被单独地筛选出来。 B．双杂交系统 1.​ 克隆载体 ​ pGBKT7：被用于表达一种与GAL4 DNA结合结构(DNA-BD域融合的蛋白。 ​ pGADT7-Rec：被用于表达一种与GAL4 激活结构域(AD)融合的蛋白。这个载体被设计成针对同源重组介导的克隆。提供的pGADT7-Rec是被Sma I消化的线形DNA。 2.​ 对照载体 a.​ 阳性对照 ​ pGBKT7-53编码一种GAL4 DNA-BD和鼠源的p53融合蛋白。 ​ SV40 Large T PCR Fragment编码SV40 large T-antigen。一起使用这个DNA片段和pGADT7-Rec去检测酵母转化重组的效率。SV40 Large T PCR Fragment和pGADT7-Rec重组形成pGADT7-RecT，它编码GAL4 AD 和large T-antigen的融合蛋白。 ​ p53和 SV40 large T-antigen在酵母双杂分析中相互作用 b.​ 阴性对照 ​ pGBKT7-Lam编码一种GAL4 DNA-BD和人类lamin C融合基因，提供一个对照，针对一种不相关的蛋白和pGADT7-RecT 和你的AD/library的质粒两者之一的意外作用。Lamin C既不形成复合体也不于大多数蛋白相互作用。 TABLE IV. 双杂系统的载体 a.​ HA是血凝素，这些免疫标记被用于通过体外的免疫共沉淀来鉴定蛋白与蛋白相互作用，使用的抗体和实验方案由BD Matchmaker Co-IP Kit 提供。它们无意被用于去检测、亲合纯化或者酵母内表达的蛋白的免疫共沉淀。 b.​ 通过SV40 Large T PCR Fragment和 pGADT7-Rec共转化，在体内同源重组产生的。 c.​ DNA-BD 和AD载体有不同的营养标记，当酵母转化子被扑到缺少特定成分的基础培养基他们可以被单独的选择。 d.​ 载体可以携带不同的抗生素标记因此可以在E. coli.中单独选择。 （六） 酵母双杂交文库构建与筛选 （七）酵母双杂交文库的构建和筛选 VII、构建酵母单杂实验的信号载体 A、背景 如果用BD Matchmaker单杂体系从cDNA库中筛选DNA-结合蛋白，必须先确定一个正确的或预测的靶元件。比如，敲除和点突变分析必须非常精确的运用。所构建的含有一个或多个拷贝的连续靶调控元件，其边界包含限制性酶切位点，重组入pHIS2的多克隆位点（MCS）。这就使得靶元件和HIS3信号基因联系到一起。插入靶元件后可能会影响HIS3表达的强度。因此，在做单杂实验前，要先检测一下构建的载体是否会减弱HIS3的表达。背景克隆的生长是由于HIS3的表达遗漏造成的，这可以通过在选择培养基中添加3-AT来控制，在第IV、F部分有详述。 B、靶元件的合成 每个靶-信号载体的构建都应在报告基因上游插入包含至少DNA靶元件的一个拷贝。早期的许多研究都提出，信号蛋白应包含至少3个连续拷贝的DNA靶元件。然而，Wei et al. (1999)证实了在许多情况下，单拷贝就已经足够了。关于靶元件数量问题可以参见Ghosh et al., 1993。连续的拷贝可通过多种方法制备，我们发现的最便捷、可靠的方法是寡核苷酸合成法。该方法之所以受欢迎是因为对于≤20 bp长度的调控元件该方法都很有效。 1、设计两条反向平行核苷酸链，一条为正义链，另一条为反义互补链。 注：正义链应包含一个或多个拷贝的靶元件和两端不同的酶切位点。当两链退火时，双链DNA会在每个末端有不同的突出来定向连入pHIS2。设计载体时参照pHIS2载体的多克隆位点信息（PT3705-5）。 2、合成不含5’ 磷酸盐的双链（参照合成方法）。 C、将靶DNA插入pHIS2的多克隆位点 1、正反义链核苷酸各0.1μg在10μl 50mM NaCl中混匀 2、核苷酸置于70℃ 5min退火，慢慢冷却至室温（~30min） 3、20μl体系完全酶切0.1μg pHIS2。37℃ 2hr或者按生产商的指导。 4、取2μl样品进行1%的琼脂糖凝胶电泳，确定质粒是否完全线性化。 5、将5μl酶切后的质粒、1μl退火后的寡核苷酸和4μl水混匀。 6、加入1.2μl 10×T4连接酶buffer和0.8μl（至少0.8units）T4 DNA连接酶，置于室温4hr。 注：寡核苷酸和载体的摩尔分子量为比100：1或者更大，无需通过胶回收来出除小片段。 7、用 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 方法，每个构建的载体各自转化大肠杆菌（Sambrook et al., 1989）。我们推荐用DH5α或者BD Fusion-BlueTM 提供的感受态细胞。 8、涂布在LB/Kan平板上，３７℃过夜。 ９、用任意标准方法制备纯净的DNA（Sambrook et al., 1989）。通过用２％琼脂糖凝胶电泳和测序来鉴定靶片段插入是否正确。 Ｄ、鉴定靶－信号载体的HIS3背景表达 １、靶－信号载体用小规模方法转化Y187（参见第XI、C部分） ２、按第IV、F部分的方法来决定优化选择性培养基中３-AT的浓度。比如，我们发现１０mM ３-AT 就足够抑制Y１８７细胞转化p53HIS2对照实验的背景生长了。 VIII、为双杂分析建立一个与DNA-BD融合的载体 A. 建立一个DNA-BD融合基因 ​ 如果相同的酶切位点在测试基因和相应的载体都存在，你可以建立一个GAL4 DNA-BD融合基因。如果不，你可以通过PCR扩增基因片段，使用的引物带有相应的酶切位点，通过合并期望的突变PCR引物，一个在基因末端酶切位点可以被改变成不同的位点或者加入到不同的阅读框。另外，如果你已经把一个基因克隆到BD Creator Donor Vector中，使用Cre recombinase把你的基因转到pLP-GBKT7中。参考BD Creator DNA Cloning Kits User Manual。 ​ 更多关于克隆的具体信息，请参照Sambrook et al. (1989) TABLE V. BD MATCHMAKERTMDNA-BD载体的比较 a.​ 包含两个检测三蛋白复合体的远距离表达框。 b.​ 在以前BD Matchmaker Two-Hybrid Systems使用的DNA-BD载体。 c.​ BD Creator Acceptor Vector (LP = loxP). 从任何BD Creator Donor Vector接受基因，作为GAL4 DNA-BD融合蛋白表达它。 1.​ 纯化基因片段。（我们推荐使用NucleoSpin Extraction Kit (#K3051-1, -2)快速纯化DNA片段）。 2.​ 用合适的内切酶消化DNA-BD载体，进行磷酸化和醇化处理 3.​ 连接相应的载体和插入片段，转化连接混合物到E. coli。 4.​ 用酶切分析或PCR来鉴定被插入的质粒 B. 检测DNA-BD融合基因的转录激活 1. 使用少量转化方案（Section XII.A.7），使AH109 和Y187转化杂交。扑转化子在下列平板上： ​ SD/–Trp/X-α-Gal ​ SD/–His/–Trp/X-α-Gal ​ SD/–Ade/–Trp/X-α-Gal 包括一个假阳性对照，例如利用空载的DNA-BD载体转化细胞。 注：BD Matchmaker Library Construction & Screening Kit (#K1615-1)不提供制作这些培养基所要求的却省培养物。你必须自己单独购买或者按照Yeast Protocols Handbook的目录c的配比自己准备。 2. 结果分析 ​ 诱饵蛋白不被激活，如果转化子克隆是白色的并不能在SD/–His/–Trp 或者SD/–Ade/–Trp上生长，继续5-6步。 ​ 诱饵蛋白没有激活，如果转化子克隆是兰色的，并能SD/–His/–Trp 或者SD/–Ade/–Trp生长，用3-4步骤继续。 3.​ 如果诱饵菌株在缺少His的培养基显示背景生长，在你可以通过添加3-AT到选择培养基（Section IV.F）。也可以使用–Ade/–His/–Leu/–Trp培养基筛选文库。 4.​ 如果一个诱饵菌株在缺少Ade和His的培养基上显示背景生长，很难在双杂筛选中使用这个诱饵蛋白。请参照故障处理指导。 5.​ 如果就你的诱饵蛋白而言已知蛋白可用，用他去核对用这个特别DNA-BD/bait fusion双杂相互作用的是否 有可检测性。 6.​ 蛋白表达的鉴定 ​ 用转化的菌液做Western印记，用GAL4 DNA-BD的抗体做印记探针。使用没有转化的酵母菌液做对照。 注：使用多克隆抗体可能导致多重交叉反映带；pGBT9 和pBridge的表达水平太低不允许使用GAL4 DNA-BD单克隆抗体检测。 C. 测试DNA-BD融合蛋白的毒性 ​ 对比转化空载DNA-BD载体和DNA-BD/诱饵质粒的液体培养Y187细胞的生长率，如果诱饵菌株生长明显减慢，你的DNA-BD/诱饵质粒可能有毒。 ​ 使用少量酵母转化方案去准备转化子。在SD/–Trp上选择转化子，如下方案贮备过夜培养： 1.​ 用50 ml SD/–Trp/Kan (20 μg/ml)温育一个大的克隆（2-3mm） 2.​ 30°C，250–270 rpm 摇晃，过夜培养(16–24 hr)。 3.​ 检测培养物OD600。它应该≥0.8，如果OD600远小于0.8/，DNA-BD融合蛋白可能有毒。如果融合基因不阻止酵母的生长，她是无毒的，你可以计划用酵母融合去筛选你的双杂文库，用步骤4-7继续。如果你打算用共转化去筛选，你可以停在这里并采用Section IX。 4.​ 离心600 x g，5分钟。 5.​ 弃上清 6.​ 在5 ml SD/–Trp液体培养基重新悬浮，用计数器计算细胞数。细胞密度应该≥1 x 10 cells/ml. 7.​ 融合这些诱饵菌株和你的AD融合文库的宿主菌(Section XII.A.4)。 注：Y187 (MATα)能与AH109, HF7c, CG-1945, Y190, or SFY526 (MATa)菌株融合。 （九）建立一个cDNA文库 A. 用BD SMART技术建立一个cDNA文库 使用BD SMART技术mrna的转录产物能被有效的复制成ds cDNA，由于它可以保持序列的完整性同时可以高通量产生cDNA，非常适合单杂和双杂文库的构建.通过保持器官组织的复杂性，BD SMART步骤可以提供你检测稀有的和潜在的未知相互作用良好机会，在酵母单杂和双杂筛选过程中。 B. BD SMART cDNA 合成与扩增是如何进行的 在首链cDNA合成步骤中，MMLV反转录酶用于把RNA反转录成DNA.就cDNA合成的引物RNA，你即可以使用被修正的oligo(dT)引物（CDS III Primer）也可以使用随机引物(CDS III/6 Primer). 得到的cDNA文库的复杂性可能不同，主要依赖于你选择哪种引物.如果你使用CDS III引物，它杂交到poly A RNA的3'末端，在接近5'的反转录序有稍低的保真性.如果你使用CDS III/6引物替代，随机引物可以能杂交到RNA摸板序列的不同部位，你的文库应该包括很多不同5'- 和3'-端的序列，他们可能被均等的表达。 MMLV RT遇到摸板的5'末端时候，酶的末端转移活性就回增加一些额外的核酸到cDNA的3'末端，主要是脱氧胞啶。那么具有oligo(G)序列3'末端的BD SMART III寡核苷与脱氧胞啶骨架配对，产生一个延伸摸板。此时RT转换摸板继续复制到核苷酸的末端。在大部分的合成中，生成的ss cDNA包含有完整的可以与BD SMART III Oligo互补mrna 5'末端，它可以后续扩增作为长距离PCR的通用引物，仅这些具有BD SMART 5' 末端锚定序列的ss cDNAs可以做为摸板，被LD PCR呈指数级扩增。 在第二步中，ss cDNA被LD PCR扩增产生ds cDNA库。Library Construction &Screening Kits 包括一个免费试用包装BD Advantage(TM)2 PCR Kit，因而你可以产生和扩增ds cDNA。BD Advantage 2 Polymerase Mix包括有：BD TITANIUM(TM) Taq DNA Polymerase（没有n末端检测能力的Taq DNA polymerase），适用于hot-start PCR的BD TaqStart(TM) Antibody，少量的具有校正能力的聚合酶。这个酶可以允许你比普通的PCR更高的保真度来扩增cDNA（大约20 kb） Figure 8．使用BD SMART(TM) 技术高质量ds cDNA的合成 C. 良好的实验室操作 ​ 带手套保护你的RNA 、cDNA摸板免于被核酸酶降解 ​ 在悬浮液体或者混合反应物时，轻轻上下吸打液体或者轻敲打试管底部。简短的把液体甩到试管底部。在悬浮试剂时不要涡旋震荡样品；涡旋震荡可能震短你的cDNA.。 ​ 所有的操作在冰上进行，除非有其他提示。 ​ 最后加酶到反应混合液中，一定确定通过轻轻的上下戏打混合液试使酶完全混合到反应混合物中。 ​ 不要增加任何反应的体积，所有的组分都是为这个特定体积优化的。 ​ EB是致癌物，在操作与处理这些试剂小心使用。对于其他信息，参照sambrook et al。BondEx Ethidium Bromide Detoxification Cartridges 可以从BD Biosciences Clontech获得。 ​ 苯酚也是常备的，处理含有这个试剂的溶液时，一直带手套穿防护服。如果可以，在通风橱里处理含有苯酚或氯仿。 ​ 准备你的反映时，使用提供的去离子水，其他的，使用新鲜的不经DEPC处理去离子水。避免使用蒸馏水，因为某些蒸馏器的循环蒸汽可能会导入妨碍PCR的污染物。 ​ 用0.5 N NaOH 清洗所有的玻璃制品，在用去离子水冲洗，然后在烘箱160–180°C烘烤4-9小时。 ​ 处理RNA时，使用一次性的塑料移液管和枪头。 D、RNA的分离 ​ 对于total RNA和poly A RNA的分离，很多方法是有效的。BD Biosciences Clontech提供几个试剂盒用于total RNA的分离和后续poly A RNA的分离。 ​ 100 ng或者25 ng poly A RNA 是cDNA合成最少的起始材料，一般来讲，你开始有的RNA越多，扩增要求的pcr循环数越少。更少的热循环数可能更少产生非特异性pcr产物。对于优化cDNA和文库的质量是非常好的。此时，如果你的RNA样本不受限制，请按照表格使用高启动量的RNA。 E. RNA Analysis ​ 合成的ds cDNA序列完整性、最终的构建的cDNA完整性都依赖于实验起始RNA的质量。因此，在第一条合成你使用rna之前，我们推荐，你在变性凝胶上检测一个样本的RNA，来评估她的完整性。哺乳动物来源的Total RNA因该在4.5 和1.9 kb位置上出现两个亮带（28S 和18S 核糖体RNA），28S 和18S rRNA带强度比列应在1.5–2.5:1。完整的哺乳动物poly A RNA也应出现弱28S and 18S rRNA的smear带，在大小分布上应该比非哺乳动物小。 ​ 如果，28S RNA 对18S RNA（对total RNA）强度比列少于1:1或者你实验用的poly A RNA明显的比预期少。我们建议我们建议你准备新的ran在核对了针对RNase和其他杂质的RNase纯化试剂后，如果问题在出现，你需要寻找其他来源的组织和细胞。 ​ 我们建议你用Human Placenta Poly A RNA作为cDNA合成的阳性对照，这个对照让你鉴定所有的组分正常工作并让你从你的RNA样本合成的ds cDNA的大小和产量。 ​ 在接下来的步骤中，你有选择首链合成的引物，oligo(dT)或者随机引物。反应条件变化依赖于与使用的引物。 F.使用Oligo (dT)引物合成第一条链cDNA 1. 加下列试剂到一个0.25ml离心管中 2.混合各个成分并简短混合 3.​ 72°C温育2min 4.​ 在冰上放置2min 5.​ 简短的离心 6.​ 增加下列试剂到反应试管中 2.0 μl 5X First-Strand Buffer 1.0 μl DTT (20 mM) 1.0 μl dNTP Mix (10 mM ) 1.0 μl MMLV Reverse Transcriptase 9.0 μl Total volume 7. 轻轻敲打混合。简短离心 8. 42°C温育10min 9. 加1.0 μl BD SMART III Oligonucleotide 10.在空气培养厢或者热盖热循环中42°C温育一个小时。 注：这种温育你使用水浴或者非热盖热循环，在你闭上管盖前，加一滴矿物油覆盖反应混合物。这样可以阻止因为蒸发引起的水分流失。 11. 75°C，10 min终止试管里的首链合成反应。 12.在室温下冷却，然后加入1.0 μl RNase H。 13. 37°C温育20min 14.如果你打算直接进行LD-PCR步骤，从首链合成物取2-μl液体并加入到一个干净的、预冷的、0.5ml试管中，放置在冰上，进行到Section H。如果你在首链合成中你使用矿物油，避开矿物油从试管底部取2-μl样品。 15.任何不使用的首链反应物立即放到–20°C.下。首链合成cdna在–20°C保存三个月。 G. 使用随机引物合成首链cDNA 1.​ 加下列试剂到一个0.25ml离心管中 2.​ 混合各个组分，简短离心。 3.​ 72°C 温育2min 4.​ 在冰上冷却2min。 5.​ 简短离心。 6.​ 离心管放置在室温下，加入下列组分： 2.0 μl 5X First-Strand Buffer 1.0 μl DTT (20 mM) 1.0 μl dNTP Mix (10 mM ) 1.0 μl MMLV Reverse Transcriptase 9.0 μl Total volume 7. 轻敲混匀，稍微离心 8. 在25–30°C的室温下，温育10min。 9. 42°C温育10min。 10. 加入1.0 μl BD SMART III Oligonucleotide. 11. 在空气培养箱或者热盖PCR仪上，42°C温育一个小时。 注：这种温育你使用水浴或者非热盖热循环，在你闭上管盖前，加一滴矿物油覆盖反应混合物。这样可以阻止因为蒸发引起的水分流失。 12. 放置反应试管75°C、10min，终止首链合成。 13.室温下冷却，在加1.0 μl（3个单位）RNase H。 14. 37°C温育20min。 15. 如果你打算直接进行LD-PCR步骤，从首链合成物取2-μl液体并加入到一个干净的、预冷的、0.5ml试管中，放置在冰上，进行到Section H。如果你在首链合成中你使用矿物油，避开矿物油从试管底部取2-μl样品。 16. 任何不使用的首链反应物立即放到–20°C.下。首链合成cdna在–20°C保存三个月。 H. LD-PCR扩增ds cDNA Table VI 显示基于首链合成使用的RNA的数量的最优的热循环数。较少的循环数通常意味着比较少的非特异性PCR产物。使用对照的Poly A + Human Placenta RNA来确定最优的热循环数。不同的摸板和和热循环仪对应于不同的参数。 TABLE VI. RNA数量和优化热循环数之间的关系 1.​ 预热PCR仪到95°C。 2.​ 准备足量的转化的ds cDNA，为每个实验样本建立一个100-μl PCR体系。为对照建立一个反应。在每一个反应管中，加入下列试剂： 2 μl First-Strand cDNA 70 μl Deionized H2 O 10 μl 10X BD Advantage 2 PCR Buffer 2 μl 50X dNTP Mix 2 μl 5' PCR Primer 2 μl 3' PCR Primer 10 μl 10X GC-Melt Solution 2 μl 50X BD Advantage 2 Polymerase Mix 100 μl Total volume 3. 快速的轻打试管混合。稍微离心以下。 4. 如果必要用两滴矿物油覆盖反应混合物，闭盖放到预热95°C的热循环上。 5.开始循环反应。如果你使用是热盖循环仪器，使用以下程序： a.​ 参考Table V确定最优的循环数。 b.​ 设置循环仪每个循环增加5 sec的延伸时间。 注：这些参数对于非热盖循环仪不是最优的。 7.​ 循环反应结束，每个样品在1.2% agarose/EtBr gel上分析7-μl PCR反应物，旁边加入0.25 μg的1-kb DNA大小的标记。Human Placenta Poly A RNA的典型结果显示在Appendix A。如果你的PCR不是预期的结果，请查阅故障处理。 8.​ 按照Section I处理，不使用请在–20°C下保藏ds cDNA。 I. 用BD CHROMA SPIN(TM) TE-400柱纯化ds cDNA BD CHROMA SPIN Columns包裹有树脂，它依据大小来分离分子。比孔径大的分子被树脂阻止，这些分子在离心的时候能够快速通过胶床，而比孔径小的分子被阻止。在接下来的步骤中，BD CHROMA SPIN TE-400 Column被用于选择>200 bp的DNA分子。关于更多的BD CHROMA SPIN Columns的信息，请参考BD CHROMA SPIN Columns User Manual (PT1300-1)（www.bdbiosciences.com/clontech.） 注：我们推荐离心使用BD CHROMA SPIN Columns在转桶或者水平转头上。固定角度的转子上也能被使用，但是有一定的风险，有一定比例的样品从柱子的内壁划过而不是通过凝胶柱，就导致减少或者不稳定的纯化。每个实验或者对照样本执行下列步骤： 1.​ 出去BD CHROMA SPIN Column的保护塑料盖，反转几次完全悬浮凝胶柱。每95-μl cDNA样品使用一个柱子。 2.​ 保持BD CHROMA SPIN Column垂直，拇指与食指抓紧break-away end，分开。放spin column到一个2-ml的离心管中，并弹出top cap。保存top cap 和 white-end cap。 3.​ 700 x g离心5min。离心后，柱体将出现半干状.这个步骤从柱子清除平衡buffer并重新建立柱床。 注：在吊桶转子离心时候，能放置2ml离心管的柱子能放在17 x 100-mm的聚丙烯管中. 4.​ 从转子移去spin column和收集管，弃掉收集管和柱子的平衡buffer。 注：当从转子移取时，一直握住BD CHROMA SPIN Column和2-ml离心管。 5.​ 把spin column放到第二个2-ml离心管，漫漫的仔细把你的cDNA样品加到胶床平面的中心。不要让任何样品流到柱子的内壁傍边。 注：尖的、普通的1.5ml离心管可以替代2-ml收集管，这样就把样品限制到一个比较窄的区域，容易处理。 6.​ 700 x g离心5min。 7.​ 从转子中移出spin column和收集管，拆开他们。纯化的样本在收集管的底部。 8.​ 加所有的重复实验样品到一个试管中。 9.​ 加入下列试剂： 1/10 vol. Sodium Acetate (3 M; pH 4.8) 2.5​ vol. 95% ethanol (–20°C) 10.​ 通过前后的摇晃轻轻的混合。 11.​ 把试管放到–20°C冰箱或者干冰中一个小时。（最好：放在–20°C过夜，这样可以有更好的效果。） 12.​ 室温下14,000 rpm离心20min。 13.​ 仔细的用移液器移去上清。不要搅动小块沉淀。 14.​ 稍稍离心，把剩余的液体摔到底部。 15.​ 小心的吸取液体并让小块沉淀空气干燥10min中。 16.​ 在20 μl去离子水中重新悬浮小块沉淀，轻轻的混合。这些cDNA现在准备与pGADT7-Rec 和pGADT7-Rec2在体外重组。继续进行双杂文库的构建，除非你准备使用，cDNA保存在–20°C下。 十、单杂和双杂文库的建立和筛选 A、为单杂和双杂筛选建立GAL4 AD融合文库 1.你不管是单杂筛选还是双杂筛选，建立文库的方法是同样的。在两个方案中，重组介导克隆被用于BD SMART ds cDNA与GAL4 AD的融合。虽然克隆的方法一样，但是GAL4 AD克隆载体不一样。 使用pGADT7-Rec2建立单杂文库。 使用pGADT7-Rec建立双杂文库。 pGADT7-Rec2 和pGADT7-Rec在复制的模式上不一样。pGADT7-Rec是一个高拷贝质粒，它包括 2 μ的复制起点，在细胞周期中踏可以让载体复制多次。另一方面，pGADT7-Rec2是一个低拷贝质粒，它包括一个自主复制序列，或者ARS元件，它可以让载体在细胞周期中复制一次。pGADT7-Rec2还包括一个着丝点序列，或者CEN元件，它确保质粒在减数和有丝分裂中的稳定分离，由于像pGADT7-Rec2低拷贝质粒产生更少的假阳性克隆，它们非常适合单杂分析。 3.​ 一个GAL4 AD融合文库是通过BD SMART ds cDNA和Sma I-linearized pGADT7-Rec or pGADT7-Rec2共转化酵母实现的，这也取决于你建立你建立一个单杂或者是双杂的文库。BD SMART ds cDNA与AD cloning vector体外重组产生一个完整的GAL4 AD表达载体（Figure 10）。这个建立的结构在GAL4 AD融合蛋白中表达cDNA片段。由于BD SMART III and CDS III序列通过RT和LD-PCR被加到cDNA中，也被增加到pGADT7-Rec 和pGADT7-Rec2质粒上，使得一步克隆成为可能。在酵母中，通过BD SMART cDNA末端重叠序列的重组，线形的质粒以环化形式存在，成功的质粒整合产生了阳性的(Leu2+)转化子。 Figure 10．通过酵母重组介导克隆建立AD融合文库。通过将dscDNA（由我们的改进的BD SMART方法来合成）和SmaI线性化的pGADT7-Rec（双杂交筛选）和pGADT7-Rec2（单杂交筛选）共转化入酵母来实现cDNA到载体的克隆。酵母中的修复酶会将cDNA与pGADT7-Rec（2）同源末端进行修复，重新使质粒载体环化形成完全的表达载体 B. 筛选GAL4 AD融合文库 1、酵母单杂文库筛选（共转化法） 通过重组克隆，能同时在单一宿主菌株中完成文库的构建和筛选。如果用户另外准备了DNA靶/信号质粒（如pHIS2/ 靶DNA），你可以将其和cDNA文库及pGADT7-Rec2载体共转化，三个DNA元件能形成酵母信号菌株（图4）。宿主重组过程中形成pGADT7-Rec2 AD载体时，文库筛选就开始了。共转化后涂布到培养基上通过HIS3营养信号筛选就能很容易的检测到单杂阳性克隆。(详情参阅sectionXI) 2、双杂文库的筛选（酵母融合或共转化法）， 酵母融合或者共转化法皆可筛选双杂文库。如1所述，共转化法可以让你在单一宿主菌中建立和筛选文库，这个步骤快速有效。具体的步骤见Section XI中Protocols A 和B，参照图 7（ Two-Hybrid Library C