高效液相色谱法分析

望氅食品安呈与趋潮 ‘ 食品科技FOODSCIENCEANDTECHNOLOGY 2008年第33卷第lf期 高效液相色谱法分析 地瓜儿多糖的单糖组成 陈克克 (西安文理学院植物应用技术实验室，西安710065) 摘要：研究分析地瓜儿多糖的单糖组成。采用水提醇沉法提取地瓜儿多糖，用三氟乙酸水解多糖 成单糖，单糖产物经衍生化试剂l一苯基一3一甲基一5一吡唑啉／R(PMP)柱前衍生化后，利用高效液相 色谱法分析单糖的PMP衍生物。结果 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明，地瓜儿多糖由甘露糖(M硼)、鼠李糖(Rha)、葡萄糖 醛酸(GlcUA)、半乳糖醛酸(GalUA)、葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)、木糖(Xyl)和阿拉伯糖(Am)8种单 糖组成，是一种酸性杂多糖，其中以半乳糖、葡萄糖和半乳糖醛酸为主，为进一步开发利用地瓜 儿这一新的野菜资源提供了科学依据。 关键词：地瓜儿多糖；单糖组成；衍生化；高效液相色谱 中图分类号：Q657．7+2 文献标志码：A 文章编号：1005—9989(2008)11-0262—04 Analysisofmonosaccharidecompositioninpolysaccharide frOmtherootoflycopuslucidusbyHPLC CHENKe—h 《AppliedPlantTechnologyLaboratory，Xi7anUniversityofArtsandScience，Xi7aN710065) Abstracts：ThemonosacchandecompositionofpolysacchandefromtherootofLycopusluciduswasanal- ysed．Thepolysacchandewasextractedbyhotdistilledwater，precipitatedbyalcohol，andhydrolyzedtogive monosaccharidesbyTFA．ThehydrolysatereactedwithPMPtoproducethePMPdenvatives，andthenthe PMPdenvativeswereanalysedbyHPLC．ResultsshowedthatthepolysaccharideWaSanacidheteropoiysac- chafideandcomprisedmannose，rhamnose。glucuronicacid，galacturonicacid，glucose，galactose，xyloseand arabonose．Scientificdataforfurtherdevelopmentandresearchisprovidedonpolysacchandefromtherootof Lycopuslucidus． Keywords：PolysacchaddefromtherootofLycopuslucidus；monosacchandecomposition；dedvatization； highperformanceliquidchromatography 地瓜儿苗LycopuslucidusTurcz．是唇形科多年 生草本植物，生于海拔1000m的阴湿多水环境， 广泛分布于全国各地，尤其主产于陕西和甘肃。 在《救荒本草》中将地瓜儿苗的地上部分称为地 瓜苗，地下根茎部分称为地瓜儿。地瓜儿又名地 参、地笋、地藕，内白外黄，形状似人参。晚秋 后采挖食用，可炒食、油炸、做酱菜等，口感鲜 嫩、松脆味美。研究发现，地瓜儿营养丰富，含 粗蛋白、可溶性糖、氨基酸以及人体所需的多种 矿质元素和维生素等，成分优于较著名的野菜，具 收稿日期：2008-03—29 基金项目：西安文理学院专项科研基金项目(KYC200728)。 作者简介：陈克克(198l—’。女，山东青岛人，硕-．L--，助教，研究方向为天然药物活性成分分析。 ·262‘矿 万方数据 2008年第33卷第7T期 食品科技 FOODSCIENCEANDTECHNOLOGY食品安呈与趁灞黪 有良好的营养保健价值11-2]，经常食用更有预防恶 性肿瘤、抑制癌细胞和减肥的作用。 糖类占据地球上有机化合物的大部分，根据 分子大小可分成单糖、寡糖和多糖3大类。多糖 广泛存在于生物界，特别是植物界，不仅具有重 要的生物功能[31，也具有重要的药用价值。研究发 现多糖具有抗肿瘤、抗炎、抗凝血、抗病毒、抗 衰老、抗辐射、降血脂和调节机体免疫等药效I蜘。 此外，多糖在食品、发酵、石油等工业上也有普 遍的应用，因此具有重要的研究意义，受到了越 来越广泛的重视，并取得了丰硕的成果，已有香 菇多糖、灵芝多糖等应用于临床川。目前有关地瓜 儿多糖的研究尚未见报道。因此，本研究首先从 地瓜儿中提取分离水溶性多糖，随后采用高效液 相色谱技术分析了地瓜儿多糖的单糖组成，为进 一步开发利用地瓜儿这一新的野菜资源提供了科 学依据。 1材料与方法 1．1材料、试剂和仪器 地瓜儿：陕西太白山，经鉴定为唇形科地瓜 儿苗LycopuslucidusTurcz．的根。 Agilent1100高效液相色谱仪：美国惠普公 司；ShimadzuC18色谱柱：日本岛津公司；RE一 52AA旋转蒸发仪；HH一2B数显恒温水浴锅。 甘露糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、半乳糖 醛酸、葡萄糖醛酸、阿拉伯糖、木糖和岩藻糖 (Fuc)9种单糖 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 品：上海医药集团；甲醇、乙腈 为色谱纯；其余试剂均为分析纯。 1．2试验方法 1．2．1色谱条件采用Agilent1100色谱系统，色 谱柱ShimadzuCIs(4．6mmxl50衄，5斗m)。流动 相：溶剂A，15％(v／v)L,腈+O．05mol／L磷酸盐缓 冲液(KH2P04一NaOH，pH6．8)；溶剂B，40％(v／v)乙 腈+O．05mol／L磷酸盐缓冲液(KH2P04一NaOH，pH 6．8)。梯度模式：时间梯度O_5一10_+60min，对 应溶剂B质量浓度梯度10％．+11．6％_+14％_+ 20％。检测波长245rim；柱温40℃；流速1．0 mL／min。 1．2．2标准品溶液的制备精确称取单糖标准品 适量，分别配制成0．2moVL的各单糖标准母液。 分别量取80灿于同一试管中，依次加入O．3m01] LNaOH100IxL和0．5moi／LPMP甲醇溶液1200 些L混匀后，70℃J水浴反应40min，冷却至室温后 加入HCI中和。用1mLCHCI，萃取3次，上层水 相即为标准品溶液。 1．2．3样品溶液的制备地瓜儿多糖样品溶液的 制备经历提取、水解和衍生化3个过程。主要步 骤如下，称取150g地瓜儿粉末，用无水乙醇80 ℃水浴提取3次，每次2h。残渣挥干乙醇。以蒸 馏水提取3次，每次2h。合并提取液，冷却后减 压浓缩至300mL，加入3倍量无水乙醇静置过夜 得多糖沉淀，反复醇沉2次。沉淀经真空干燥、 蒸馏水溶解后，先人透析袋中透析48h，后采用 Sevag法结合反复冻融法除蛋白质，然后再经浓缩 和真空干燥即为地瓜儿多糖。精确称取地瓜儿多 糖20mg，溶解于2mol／L的置氟乙酸(TFA)水溶液 2mL中，封管，100℃水解8h。冷却至室温， 1000r／rain离心5min，上清液中和至pH7．0，真 空冻干得多糖的水解产物。水解产物的衍生化过 程按1．2．2项下进行，获得的上层水相即为样品 溶液。 2结果与讨论 2．1色谱条件的选择 2．1．1 pH值的选择单糖PMP衍生物的保留时间 10 20 30 40 50 B lO 40 lO 20 30 40 50 注：a．pH=6．5时的色谱图；b．Old=6．8时的色谱图；c．pH--7．0时的色 谱图1．PMP；2．Man；3．Rha；4．GicUA；5．GaiUA；6．GIc；7．Gal；8．xYl； 9．Ara；10．Fuc。 ．图1 pH值对保留时间和分离效果的影响 驽L』丝 万方数据 食品科技 FOODSCIENCEANDTECHNOLOGY 2008年第33卷第1f期 和分离效果依赖于流动相的pH值【8】。本文通过分 别调节流动相的pH值为6．5、6．8和7．0来观察其 对9种标准单糖衍生物的保留时间和分离效果的 影响，结果见图1。 随着流动相pH值的增大，各单糖洗脱顺序不 变，分离效果变好，保留时间先变短后延长。由 图1可见pH6．8为最佳的流动相pH值。 2．1．2洗脱梯度的选择本文选择流动相A15％ (v／v)乙腈+0．05mol／L磷酸盐缓冲液和流动相B 40％(v／v)L腈+0．05mol／L磷酸盐缓冲液，通过变 化不同时间下流动相A和流动相B的浓度来观察 梯度模式对保留时间和分离效果的影响，结果见 图2。 10 l c 蝴砍几 ， I lO 20 30 40 注：A时间梯度O—+5—30—+45—∞rain，相应浓度梯度O％一10％一 14％一14％—+20％％骄0B；B．时间梯度o_+5_+25_qo．+60rain，相应浓度梯 度10％一10．8％一14％一14％一16．5％溶剂B；C．时间梯度0—+5—10—60 rain，相应浓度梯度10％--"11．6％--',14％—+20％溶剂B；1．PMP；2．Man： 3．Rha；4．GIcUA；5．GalUA；6GIc；7．Gal；8．Xyl；9．Ara；10．Fuco 图2洗脱梯度对保留时间和分离效果的影响 流动相A和B的微量变化就可以改变保留时 间和分离效果，为保证两者都达到较好效果，本 文选择时间梯度为0_+5_10_60minj对应溶剂 B质量浓度梯度10％---q1．6％一+14％_20％溶剂 B为最佳的洗脱梯度。 综上所述，本文所选用的流动相是溶剂A。 15％(v／v)乙腈+0．05mol／L磷酸盐缓冲液(KHePO。一 ·2647。-矿 NaOH，pH6．8)；溶剂B，40％(v／v)乙腈+O．05mol／L 磷酸盐缓冲液(KH2P04一NaOH，pH6．8)。梯度模 式：时间梯度0叫-+10．+60min，对应溶剂B质 量浓度梯度10％一11．6％-+14％_20％。即图2中 C图所示。 2．2方法学考察 2．2．1线性关系的考察精确量取0．2mol／L的各 单糖标准溶液，按1．2．2项下衍生。取适量衍生物 用蒸馏水分别稀释2、4、6、8和10倍，在选定 色谱条件下进样4斗L，测定峰面积。以单糖标准 品峰面积(Y)对相应浓度(X，mol／L)进行线性回归 分析，求出各单糖标准品的直线回归方程结果见 表l。 表1 9种单糖的标准曲线和线性范围 单糖 回归方程 相关系数篙。捆l／s)7 ManY=3312300．88X-195919770．999931．8000～18．000 RhaY=1604437．75X．--9．45435610．999955．3407～53．407 GlcUAY=3897457．86X-6．78993040．999971．6711．16．711 GalUAY=322459281X-195748090．9999510．027．140．38 GlcY=2117043X一122．870520．9999325．200—252．00 GalY=3473556．06X--49J387710．9999610．800～108．00 XylY=1800272．18X-25．019760．999948．6438～86．438 AraY=2441275．28X--833474380．9999618．522—259．31 FucY=786105．907X-54．4608010．9999435．742～357．42 2．2．2精密度试验分别精确吸取1．2．2项下标准 品溶液4灿，重复进样5次，分别测量峰面积值， 计算出各单糖的RSD分别为Man0．40％。Rha 0．38％，GlcUA0．60％，GalUA0．65％。GIc0．91％． Gal0．63％，Xyl0．54％，Ara0．53％和Fuc0．44％。 说明精密度良好。 2．2．3稳定性试验取1．2．3项下样品溶液10此， 分别在制备后O、2、4、8、14h进样，计算样品 中各单糖含量的RSD依次为Man0．48％．Rha O．95％，GIcUA1．29％，GaIUA0．64％，Glc0．85％． Gal0．77％，Xyl1．41％和Ara1．79％。说明室温下 供试品溶液在14h内稳定。 2．2．4重复性试验按1．2．3项平行制备测定单糖 含量的样品各5份，连续进样，测量峰面积值， 计算各单糖的RSD分别为Man0．40％，Rha 1．34％，GkUA1．07％，GalUA2．02％．Glc0．73％， Gal0．92％，Xyl0．43％和Ara0．71％。说明重复性 良好。 2．2．5加样回收率试验精确称取已知含量的地 瓜儿多糖5份，分别均精确加入各单糖标准溶液 加．卜8●^i¨h㈣⋯旷6¨，～U㈠川⋯U㈠㈠U一|二U：J 万方数据 2008年第33卷第"期 食品科技 FOODSCIENCEANDTECHNOLOGY畏品安茔与趋潮訾 适量，按1．2．3项下方法处理，按1．2．1项下方法 测定，计算平均加样回收率分别为Man98．82％， Rha100．63％，GlcUA99．82％，GMUA100．79％， Glc95．15％，Gal101．05％，Xyl99．65％和Ara 99．12％，相应的RSD分别为1．65％、1．98％、 4．23％、1．51％、1．83％、3．69％、0．47％和1．86％。 由结果可知回收率较好，方法可行。 2．3样品分析 单糖标准品溶液和地瓜儿多糖样品溶液的 HPLC分析结果见图3。采用面积归一化法计算各 单糖的相对峰面积如表2所示。结果显示：地瓜 儿多糖由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖 醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖8种单 糖组成，是一种酸性杂多糖，其中以半乳糖、葡 萄糖和半乳糖醛酸为主，相对峰面积分别为 325．2％、106．5％和100％。 7 6 2 5 6 ¨ h ／l崩／I八№ 一 10 20 30 40 注：1．PMP；2．Man；3．Rha；4．GIcUA；5．GalUA；6．GIc；7．Gal 8．Xyl；9．Ara。 图3地瓜儿多糖样品溶液的HPLC图 表2地瓜儿多糖的组成测定结果 3结论 高效液相色谱法是分析糖类物质的主要方法 之一，具有分辨率高、分离速度快、分离效果好、 分离模式多样等优点。本研究结果表明，采用高 效液相色谱法测定地瓜儿多糖的单糖组成，方法 简单灵敏，操作方便快速，有利于深入分析地瓜 儿多糖样品，研究地瓜儿多糖性质，为合理开发 和利用地瓜儿多糖提供科学依据。 本研究采用了磷酸盐缓冲液作为流动相，并 对流动相的pH值和洗脱梯度进行了选择和优化。 实验发现单糖PMP衍生物的保留时间和分离效果 依赖于流动相的pH值及洗脱梯度。 在地瓜儿多糖样品色谱图中还存在几个含量 较低的未知峰，是否是其他类型的单糖，因色谱 分离条件的限制还有待探讨。 地瓜儿苗的地上部分晒干后为常用中药泽 兰，和地下部分均具有重要的开发利用价值。 本研究分析了地下可食用部分多糖的单糖组成， 其地上药用部分多糖的单糖组成正在研究中。 同时有关地瓜儿多糖的生物学活性还需要进一 步研究。 参考文献： 【1】韩梅，赵淑春，杨利民，等．泽兰营养成分分析忉．吉林农业 大学学报。1998，20(2)：35—37 【2】周俊国，陈淑雅．泽Z(Lycopuslucidus)的组织培养研究叨． 河南农业大学学报，2003，37(3)：266-269 [3】杨世平，孙润广，陈国梁，等．红枣多糖微结构的原子力显 微镜观测田．陕西师范大学学报(自然科学版)，2005，33(3)： 59—6l f4】宁书年，张桂．生物多糖类物质对人体的作用们．食品科 学，2005．26(9)：613—614 【5】陈月月，李雪静，王宏芳，等．松茸多耱抗辐射功能的初步 研究忉．天然产物研究与开发，2006，18：989—990 【6】黄永春，杨锋，谢清若，等．火棘水溶性多糖PP—A2理化性 质研究阴．食品科技，2007，(6)：116--119 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