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Nbn基因对小鼠小脑神经元发育的影响.pdf

Nbn基因对小鼠小脑神经元发育的影响

豪杰
2010-11-18 0人阅读 举报 0 0 0 暂无简介

简介:本文档为《Nbn基因对小鼠小脑神经元发育的影响pdf》,可适用于自然科学领域

CHINESEJOURNALOFANATOMYVo.No.解剖学杂志年第卷第期Nbn基因对小鼠小脑神经元发育的影响王堑张莉高云周。郭敏△(辽宁医学院附属一院基础学院锦州)摘要目的:通过观察神经特异性Nbn基因敲除(NbnCNSde)和对照(NbnCNSCtr)小鼠小脑神经元发育的形态学变化探讨DNA损伤修复基因Nbn在小鼠小脑发育过程中的作用。方法:应用免疫组织化学技术和体视学方法对生后(P)、】、d的NbnCNSdel和NbnCNSCtr小鼠小脑进行系统观察和定量分析。结果:与NbnCNSctr小鼠相比NbnCNSdel小鼠生后各时间相点小脑发育迟缓皮质各层界限不清细胞排列紊乱至d未形成正常小脑皮质的层结构NeuN阳性表达的颗粒细胞面数密度和体密度值明显减小DK阳性表达的浦肯野细胞面数密度和体密度值增加。结论:DNA损伤修复基因Nbn可能是小脑发育过程中的重要基因影aN,J,鼠小脑神经元的发育和成熟。关键词Nbn小脑神经元发育体视学小鼠EffectofNbngeneonneurondevelopmentofmousecerebellumWangKunZhangLiGaoYunzhou。GuoMin△(.FirstAffiliatedHospital.BasicCollege.LiaoningMedicalUniversity。JinzhouChina)AbstractObjective:ToinvestigatetheroleofDNArepairgeneNbnonthecerebellardevelopmentbyobservingthemorphologicalchangesofNbnCNSydelandNbnCNSCtrmouseeerebellarneurons.Methods:Immunohistochemistryandstereologicalmethodswereusedtoanalysethecerebellardevelopmentinthemiceatpostnataldayand.Results:ComparedwiththeNbnCNSCtrmousetheeerebellardevelopmentinNbnCNSdelmousewasdelayedandanormalthreelayerstructurewasnotobservedatpostnatalday.TheprofilenumbericaldensitiesandvolumedensityofNeuNpositivegranulecellsweredecreasedwhilethoseofDKpositivePurkinjecellswereincreased.Conclusion:DNArepairgeneNbnmightbeakeygeneduringmousecerebellardevelopmentimpactingthedevelopmentandmaturityofcerebellarneuronsofmice.KeywordsNbncerebellumneurondevelopmentstereologymouseNbn(在人类称之为NBS)是一种重要的DNA修复基因其表达的蛋白Nibrin参与DNA损伤修复l如小头畸形、生长发育延迟、组织退化、对DNA损伤剂敏感、染色体不稳定、易患肿瘤等都与DNA损伤修复密切相关。有关Nbn基因对小脑发育影响的形态学方面的系统研究目前国内外尚少见报道本研究拟应用免疫组织化学技术结合体视学方法对NbnCNSdel和NbnCNSCtr小鼠小脑神经元的发育进行系统观察和定量分析为进一步认识DNA损伤修复基因Nbn对小鼠小脑发育的影响及其功能研究提供基本的实验依据。材料和方法.动物选择和标本制备选用生后(P)、、d的神经特异性Nbn基因第作者Email:lywangkunyahoo.eom.cn通讯作者E~mail:mguolyahoo.com.cn收稿日期:修回日期:O~~~敲除(NbnCNSde)小鼠每组只以非基因敲除的同窝小鼠(NbnCNSctr)为对照组【雌雄各半共只体质量~g(以上动物由世界卫生组织国际癌症研究署提供并获中国医学科学院基础医学研究所病理学系及实验动物中心支持完成)。仔鼠用快速断头法取出脑组织沿矢状缝纵向切开多聚甲醛固定h常规脱水、透明、石蜡定向包埋连续矢状切片厚m用于免疫组织化学显色及光镜下观察。.免疫组织化学显色石蜡切片常规脱蜡入水枸橼酸高压修复HO。消除内源性过氧化物酶活性山羊血清封闭室温孵育lO~min羊抗鼠单克隆抗体(NeuN和D一Kl:和:美国Chemicon公司)℃孵育过夜二抗(:)℃孵育min辣根酶标记链霉卵白素工作液℃孵育minDAB显色常规脱水、透明、封片光镜下观察。用PBS代替一抗作阴性对照。.体视学测定每个动物的脑组织等间隔选取切片每张切片按“S”形选取视野光镜下借助目镜方格测试系统采用点计数法按公式NAN/A和Px/Pc分别测算出颗粒层NeuN阳性表达的颗粒细胞、DK阳性表达的浦肯野细胞的面数密度和体密度值式中NX分别为NeuN和D一k阳性表达细胞的截面数Px为方格系统落在所测结构的点数P和Ac分别为测试系统落在参照系的点数和截面积(以小脑为参照系)。.统计学处理采用统计软件SPSS.对所测各项数据进行析因设计的方差分析和独立样本t检验。结果.光镜观察(图~)NeuN阳性表达于成熟的神经细胞核呈不同程度的棕黄色而DK表达于浦肯野氏细胞的胞体和突起呈不同程度的棕黄色。NbnCNSctr小鼠:P~d小脑皮质外颗粒层逐渐变薄消失分子层和内颗粒层(颗粒层)逐渐增厚。Pd皮质的外颗粒层、分子层、浦肯野细胞层和内颗粒层结构明显。外颗粒层NeuN阳性表达的细胞密集分布分子层NeuN阳性表达的细胞排列稀疏浦肯野细胞胞体较大散在排成单层突起开始发育内颗粒层NeuN阳性表达的细胞排列稀疏。Pd外颗粒层NeuN阳性表达的细胞明显减少较均匀地排列在分子层的周围分子层内NeuN阳性表达的细胞增多浦肯野细胞胞体增大突起及其分支增多内颗粒层增厚NeuN阳性表达的细胞明显增加排列较密集Pd外颗粒层消失分子层NeuN阳性表达的细胞减少内颗粒层即颗粒层NeuN阳性表达的细胞密集分布。NbnCNSdel小鼠:与NbnlCNSctr比较P~Pd小脑皮质各层界限不清细胞排列紊乱至Pd外颗粒层仍未完全消失未形成正常小脑皮质的层结构浦肯野细胞呈片状分布于整个小脑突起及其分支较少。.体视学测量NbnCNSdel与NbnCNSctr小鼠相比P~Pd小脑皮质颗粒层的NeuN阳性表达的颗粒细胞面数密度和体密度值明显减少(P%.)D一K阳性表达的浦肯野细胞面数密度和体密度增加(P<.)(表)。表NbnCNSctr和NbnCNSdel组小鼠小脑体视学参数(=士s)TabStereologicalparameterofNbnCNSCtrandNbnCNSdelinollsecerebellum(n士s)P<.betweenthetWOgroupsinsameage讨论研究表明Nbn基因功能异常可影响小鼠中枢神经系统的发育导致小头畸形、生长障碍、小脑萎缩以及共济失调等L。Nbn基因敲除的小鼠脑发育受到显著影响其脑组织重量与野生型小鼠相比明显减轻大脑皮层的脑回厚度有不同程度下降目测脑矢状面截面显著变小同时伴随小脑发育不良、萎缩。本实验结果显示与NbnlCNSctr比较Nbn基因敲除鼠PTPd小脑皮质各层界限不清细胞排列紊乱至Pd夕颗粒层未完全消失未形成正常小脑皮质的层结构浦肯野细胞呈片状分布于整个小脑突起及其分支较少。说明Nbn基因敲除小鼠小脑神经元发育受到明显影响推测Nbn基因可能是小脑正常发育的一个重要基因。NeuN免疫组织化学显色结果显示P~PdNbnCNSctr小鼠小脑皮质各层结构明显外颗粒层由外向内NeuN阳性表达的细胞逐渐增多内颗粒层NeuN阳性表达的细胞排列逐渐由稀疏到密集。Yamanaka等认为外颗粒层是由具有增生能力的神经上皮细胞不断迁移聚集所形成的同时伴有外颗粒层细胞不断内迁Lee和Abner等口u认为内源性的DNA损伤在神经干细胞和神经祖细胞发生频繁的损伤如不能进行正确及时修复就会导致细胞凋亡Frappart等报道Nbn一小鼠小脑外颗粒层有丝分裂后期颗粒细胞存在大量凋亡本研究结果显示P~PdNbnCNSdel小鼠小脑各层界限不清NeuN阳性表达的细胞排列紊乱分布不均至Pd仍未形成正常小脑皮质的层结构。体视学测量结果表明与NbnCNSctr小鼠比较P~PdNbnCNSdel小鼠小脑颗粒层NeuN阳性细胞面数密度和体密度明显减少。说明Nbn基因作为一个重要的DNA修复基因明显影响了一

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