5、基因的分离与鉴定

null§5基因的分离与鉴定§5基因的分离与鉴定5.1 DNA克隆片段的产生与分离 5.2 重组体DNA分子的构建及导入 受体细胞 5.3 基因克隆的实验 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 5.4 克隆基因的分离 5.5 重组体分子的选择和鉴定null 基因的克隆包含着待研究的目的基因的分离和鉴定两个主要内容 在真核生物中，单个基因仅占整个基因组的极其微小的比例。必须经过扩增（amplification）才有可能分离到含有目的基因的DNA片段。因此需要先构建基因文库（gene library）或叫DNA文库（DNA library）。 DNA文库：来源于染色体DNA基因组，是来自单个基 因组的DNA克隆片段汇总，包含基因组中 所有DNA序列。 cDNA文库：来源于基因组DNA的转录本（mRNA）再 反转录成的cDNA拷贝，是单个基因组编 码序列的cDNA克隆片段汇总，包含基因 组中所有编码序列。null 应用大肠杆菌 作寄主进行外源 DNA片段克隆的 综合实验方案null真 核 基 因 克 隆 的 基 本 步 骤null5.1 DNA克隆片段的产生与分离 5.1.1 基因组DNA的片段化 （1）利用限制酶片段化基因组DNA的一般问题 获得外源DNA片段最简单的 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 是鸟枪法（shotgun approach）：利用限制酶消化给体基因组DNA，不经过凝胶电泳分布分离，就直接用来同载体分子作连接反应的克隆方法。此种方法的缺点是：载体上插入的外源片段大小不同，克隆群体庞大，不利于选择带有目的基因的克隆 ；当目的基因的核苷酸序列中有一个或数个限制酶识别位点时，需要好几个克隆才有可能获得目的基因的全序列。目的基因核苷酸序列越长，需要的克隆就越多；限制片段太大或太小都不利于正常基因文库的构建。 解决这些问题的方法有：限制酶局部消化；机械切割法等 限制酶酶切片段的随机程度和大小与其识别序列长短有关： 4bp：44=256bp; 6bp：46=4096bp; 8bp：48=65536 随机程度高 随机程度低null（2）基因组DNA的双酶消化策略 1978年，有学者提出了利用两种限制酶混合消化基因组DNA的实验策略。应用这种方法可以获得适于克隆的随机片段化的DNA群体。 在进行局部的双酶消化后，可产生大部分为10~30kb范围的随机片段，它们之间存在着有效的随机的序列重叠现象。然后通过蔗糖密度梯度离心等方法得到20kb左右的随机的DNA片段群体，适于λ噬菌体载体的克隆能力。这样，经体外重组、包装和转化后，有把握获得足够多的重组体转化子克隆，构建成几乎完美、代表性的基因文库。 在双酶消化策略中，可根据情况选择限制酶组合或具有同尾酶特点的单酶切——在克隆组合。null5.1.2 DNA片段的大小分布 构建完整的基因文库（DNA文库）时，并不需要对某种基因或DNA片段作特别的富集处理。但如果要克隆特定大小的含有目的基因的DNA片段时，可在克隆之前先对片段化的给体DNA群体进行按大小的分步分离，则可以显著提高克隆基因的分离频率。 5.1.3 编码目的基因的克隆片段的富集 如果克隆的目的是分离特定的基因，在对该基因的信息有所了解的情况下，可以通过凝胶电泳或蔗糖梯度离心等方法进行富集。但是，被克隆的目的基因的全序列应该在一条DNA片段上，所以，随机片段化的DNA不适于用此方法。null举例：Qβ蛋白质（光合作用相关蛋白质）的psbA基因的克隆 将纯化的水稻叶绿体DNA（ctDNA）分别用BamHI、EcoRI及HindIII等限制酶局部消化，然后用含有溴化乙锭的1%琼脂糖凝胶电泳作分步分离； 进行Southern印记转移，同32P放射性标记的目的基因探针进行杂交，结果表明，2.2kb的EcoRI片段、3.8kb的BamHI片段等含有psbA基因的编码序列； 根据这些结果，将对叶绿体DNA进行再一次的电泳分步分离，把2.2～2.5kb范围的EcoRI片段（含有psbA基因的编码序列）从低熔点胶中分离出来； 在体外与pBR322质粒载体连接重组，转化大肠杆菌寄主细胞，构成水稻叶绿体基因组DNA的EcoRI文库； 从近200个转化子菌落中得到8个阳性克隆，其中有6个克隆带有2.2kb的插入片段，进一步 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 后发现这些插入片段都含有psbA基因的编码序列。null5.2 重 组 体 DNA 分 子 的 构 建 及 导 入 受 体 细 胞null5.2.1 外源DNA片段同载体分子的重组 外源DNA片段同载体分子的连接需要限制酶与连接酶的作用。进行连接反应时，需要注意以下3点： ① 实验步骤要尽可能简单易行； ② 连接形成的“接点”序列，应能被限制酶重新切割，以 便回收插入的外源DNA片段； ③ 有些情况下，对转录和转译过程中的密码结构的阅读不 不发生干扰。 null（1） 外 源 DNA 片 段 的 定 向 插 入null（2） 非 互 补 粘 性 末 端 DNA 分 子 间 连 接①应用 化学合 成的衔 接物构 建粘性 末端进 行基因 克隆的 程序待克隆的DNA片段PstI衔接物T4多核苷 酸激酶载体分子T4DNA连接酶转化与扩增克隆的DNA片段null② 应用 BamHI 接头构 建重组 体分子 的基本 程序BamHI接头分子外源DNA片段重组体质粒null（3）最佳连接反应 ① 防止线性载体DNA分子的自我环化，通用的3种方法： A. 用碱性磷酸酶除去线性载体DNA的5′-P，留下 5′-OH； B. 使用同聚物加尾技术； C. 应用柯斯质粒进行克隆。 ② 正确调整载体DNA和外源DNA之间的比例； ③ 在体外连接反应中的DNA总浓度要高，低于20μgDNA/ml 时，DNA分子间的相互作用机会少，不利于连接反应；而 高浓 度的DNA (300~400μgDNA/ml),则有利于连接反应； ④ 连接反应的温度：26℃保温4小时所得到的转化子数大约 是4℃保温23小时的90%，而且几乎是4℃保温4小时的25 倍以上。nullDNA片 段体外 连接反 应的保 温时间 及其温 度对重 组体转 化效率 的影响null5.2.2 重组体分子导入受体细胞的途径 （1）重组体DNA的转化或转染 转化( transformation )：感受态的大肠杆菌细胞捕获和表 达外源DNA片段或质粒载体DNA分子的生命过程。 转染( transfection )：感受态的大肠杆菌细胞捕获和表达噬 菌体DNA分子的生命过程。 ① 转化或转染的基本过程： 将外源DNA分子或与载体重组的重组体DNA分子同经过氯化钙处理的大肠杆菌感受态细胞混合，置冰浴中培养一段时间后，转入42℃水浴中作短暂的热刺激( 热休克，一般90sec )。 如果是转染，将这样处理的细菌直接涂布在琼脂平板上，使其形成噬菌斑；如果是转化，将这样处理的细菌放置在肉汤培养基中保温一段时间（复苏培养，约为1h），以便新表型得到表达，然后涂布在选择性培养基平板上进行培养。null② 转化或转染效率问题 一般情况下，每微克pBR322质粒DNA可获得106左右的转化子菌落；每微克λ 噬菌体DNA可获得104~106 噬菌斑。转化（或转染）效率也同选用的大肠杆菌受体的菌株有关。 当使用重组体DNA分子进行转化（或转染）时，频率要下降102~104，这是由于，一方面载体分子同DNA插入片段之间的连接效率低造成的，另一方面含有DNA插入片段的载体分子比较大，这本身会导致转化效率下降。 我们可以用碱性磷酸酶处理法或环丝氨酸富集法等方法提高转化效率。 （2）体外包装的λ噬菌体的转导null5.3 基因克隆的实验方案 从生物有机体中克隆某一特定DNA片段（或基因）的实验程序总称为基因克隆的实验方案或策略。根据实验目的和基因克隆各种要素的特点，选择正确的克隆方案是非常重要的. 例如，人的-珠蛋白基因约为1.5kb，而人的单倍体基因组的总长度达3×106kb左右。那么究竟需要多少个长度为1.5kb的不同限制片段，才能够确保（即达到99%的必然性）在重组DNA转化子克隆群体中，至少含有一个是获得了这个基因的分子呢？也就是说一个完全的人类基因组DNA基因文库，究竟应包括多少个独立的克隆？这取决于基因组的大小和克隆的DNA片段平均大小两个参数。nullClarke—Carbon公式给出的一个完全基因文库所需要的实际克隆数（1975年）： 其中：N 为一个完整基因文库所应包含的转化子克隆数； P 为重组体群体中出现目的基因序列的几率（一 般设定为99%）； f 为限制片段平均大小与基因组DNA总量之比。nullClarke—Carbon公式可以被简化为：其中：G 为基因组的大小； f 为插入片段平均大小null对于上述提到的人的-珠蛋白基因的例子，N 的数值为： 这说明，我们需要从9百万个独立的菌落或克隆中分离和鉴定人的-珠蛋白基因，也就是说，我们必须有大量的重组体DNA群体，才有可能汇集整个人基因组的全部DNA序列。 习惯上，将这种汇集着基因组所有DNA序列的重组体DNA群体称为基因文库(gene library)或基因库(gene bank)，更确切地说，应该叫DNA文库(DNA library) 。null 如果改用λ噬菌体载体，比如克隆的插入片段平均长度为15kb，那么，一个完全的人基因文库所需要的重组体数量可减少到9×105；若用柯斯克隆，在克隆片段平均长度为40kb时，所需要的重组体数目又可减少到3.5×105。 所以，我们一般选用噬菌体和柯斯质粒作载体，克隆大片段DNA并构建基因文库；用质粒载体克隆较小片段的DNA（＜15kb），它往往可以提供方便的检测手段。 在决定选择何种克隆方案时，另一个值得考虑的重要因素是待克隆DNA分子的性质。如果是真核生物的基因全序列克隆，就应该使用基因组DNA材料；如果只是克隆编码氨基酸的表达序列，则可使用cDNA材料。null 在pBR322质粒上克 隆-珠蛋白的cDNA 加上了HindIII接头的β-珠蛋白cDNA重组到pBR322载体上以后，转化给大肠杆菌寄主细胞。 将生长在Amp平板上的转化子菌落原位影印培养在Tet平板上，从中可筛选出AmprTets的菌落，此即含有β-珠蛋白cDNA插入的阳性克隆。null5.3.1 互补作用基因克隆 用克隆片段与缺陷型受体细菌间的功能互补来克隆功能基因的常规方法。当缺陷型大肠杆菌菌株难以被转化时，可先转化含有F质粒的大肠杆菌菌株，然后通过F质粒为媒介，将重组体质粒导入众多的F－营养缺陷型菌株细胞。 只适于克隆细菌基因和少数低等真核生物的相关功能基因。 5.3.2 cDNA基因克隆 真核生物基因组DNA十分庞大，其复杂度是蛋白质和mRNA的100倍左右，而且含有大量的重复序列，所以，不论采取什么方法，都难以直接分离到目的基因片段。 部分生物的基因组DNA大小 Human 3.0 x 109 Mouse 3.0 x 109 Drosophila 1.1 x 108 Yeast 1.2 x 107 Bacteria 1.0 - 5.0 x 106null 尽管高等生物一般具有几万个 不同的基因，但在一定时间阶段的 单个细胞或个体都仅有15%左右的 基因得以表达，产生出几千个不同 的mRNA分子。可见，由mRNA出 发的cDNA克隆，其复杂度要比直 接从基因组克隆简单得多。 以质粒为载体构 建cDNA文库：双链质粒DNA限制酶末端转移 酶，dGTPmRNA把oligo（dT）引物 加到poly（A）尾巴反转录酶用NaOH降解mRNA链, DNA聚合酶I以发卡环 作引物合成互补DNA链SI核酸酶SI核酸酶降 解发卡结构末端转移 酶，dGTP 插入质粒载体转化给大肠杆菌，扩增pBR322null（1）cDNA文库的构建 ① 分离总RNA，从中纯化出主要 含mRNA的分部； ② 合成cDNA第一链（oligo（dT） 引导的cDNA合成法、随机引物 引导的cDNA合成法）； ③ 将mRNA-DNA杂交分子转变为 双链cDNA分子（自我引导合成 法、RNaseH酶降解取代法）； ④ 将合成的双链cDNA分子重组到 质粒或噬菌体载体上，并导入大 肠杆菌寄主细胞增殖。poly（A）mRNA与 oligo（dT）杂交而 被吸附，其它的tRNA rRNA仍处于游离状态加入总RNA oligo（dT） 纤维素100mM NaCL洗脱下来的 tRNA和rRNA10mM Tris 1mM EDTA收集洗脱下来的poly（A）mRNA用纤维素柱纯化poly(A)的 流程示意图null合成双链 cDNA的 RNaseH 酶降解取 代法null以λ 噬菌 体作载体 构建 cDNA 文库的 流程图null（2）不同丰度mRNA的cDNA克隆 不同目的基因的mRNA在特定的生物体组织中的含量有很大的差别，相应的cDNA克隆策略也不同。 ① 高丰度mRNA的cDNA克隆 相对于低丰度mRNA的cDNA克隆，高丰度mRNA的cDNA克隆并不存在什么实际的问题。按常规方法进行cDNA克隆后，用菌落杂交技术，从转化的细菌群体中筛选出目的基因序列的重组体克隆即可。 null② 低丰度mRNA的cDNA克隆 通常是构建成cDNA基因文库。组成一个合理的完全的cDNA文库所必须的重组体克隆的数目，可根据Clarke—Carbon公式算出： 其中：p 是得到完整cDNA文库的概率（通常设定为99%）； 是某一低丰度mRNA在mRNA群体中出现的概率； N 是所需的克隆数。 null③ 稀少mRNA的cDNA克隆 此种mRNA的克隆难度极大，主要采取一些特殊的技术才有可能取得成功。 A. 应用按分子量大小分部分离的技术富集克隆的mRNA； B. 使用化学合成的寡聚脱氧核苷酸纯化特定的mRNA，也可 采用根据氨基酸序列制备的混合探针来筛选cDNA文库的 方 法； C. 用差别杂交法筛选特异mRNA的cDNA克隆null（3）全长cDNA的合成 用全长双链cDNA构建cDNA文库，分离目的基因，特称为全长cDNA克隆（full-length cDNA clone）。 ① oligo（dG）引导合成法 A.第一链cDNA尚未与mRNA模板分离之前，先在其3′-末端加上一段oligo（dC）序列； B.然后通过碱性蔗糖梯度离心处理，使mRNA模板分子发生水解作用，回收全长cDNA； C.最后以互补的oligo（dG）序列作引物引导第二链cDNA的合成，这样就不会形成发卡环结构，也就没必要使用SI核酸酶进行切割处理。null寡聚脱氧胸苷 酸[oligo（dG） 引导法合成全 长双链cDNAnull② 载体引导合成法 第一连由参入到载体分子上的oligo（dT）序列引导合成； 第二链也是由参入到载体分子上的oligo（dT）序列引导合成； 产生出双链的重组体质粒分子以后，转化大肠杆菌寄主细胞，通过扩增可获得具有不同插入取向的cDNA克隆。 超量变性的 载体分子5′ null ③ 置换法合成全长cDNA 制备带有一段oligo（dT）尾巴的质粒引物和具有oligo （dG）尾巴的接头DNA；前者引导合成第一链cDNA。 构建质粒-cDNA重组体分子，然后用RNaseH酶解取代法合成第二链cDNA 。 转化大肠杆菌寄主细胞。null（4）cDNA克隆的优点和用途 ① 优点： A. 对于研究增殖过程并不经过DNA中间体的有些RNA病 毒，cDNA克隆是唯一可行的方法； B. cDNA文库的筛选比较简单易行； C. 由于每一个cDNA克隆都代表一种mRNA序列，在选择 中出现假阳性的几率比较低cDNA ② 用途： A. 克隆在细菌中表达的基因； B. 用作基因序列结构的测定； C.有关在发育过程中时间调节基因的表达特征的分析。null5.3.4 基因组DNA克隆 cDNA克隆的局限性 （1）cDNA只反映mRNA的分子结构，而并不包括基因组 DNA的 间隔序列； （2）cDNA基因文库中，不同克隆的分布状态总是反映着mRNA的 分布状态，而mRNA的分布与其丰度相关的。 （3）cDNA克隆不能够克隆到基因组DNA中的非转录区段的序列， 因而无法满足对基因编码区外侧调控序列的结构与功能的研 究。 基因组DNA克隆的优越性 （1）能有效地满足外源真核基因在真核细胞中的表达； （2）具有所有基因的序列拷贝； （3）能够满足对基因非编码区结构与功能的研究。null（1）应用λ噬菌体载体构建 基因组文库 ①通过衔接物连接法在λ噬菌体载体上 构建基因组文库 a. 加入HaeIII-AluI对真核基因组DNA作局部双酶切，分部分离20kb左右的片段； b.EcoRI甲基化酶处理，再连EcoRI衔接物； c、d.用EcoRI消化目的DNA和载体； e.按大小分部，除去载体中间区段； f.插入片段与载体分子退火连接(连接酶); g.体外包装； h.感染大肠杆菌细胞寄主细胞，构成基因组文库。高分子量真核 基因组DNA取代性λ噬菌体 载体Charon 4Anull② 用Sau3A消化真核 基因组DNA在λ噬 菌体载体上构建 基因组文库 a.载体DNA片段的 制备； b.真核基因组DNA的制备； c.体外重组构建多连体分子； d.体外包装； e.感染大肠杆菌寄主细胞。B=BamHI末端 S=Sau3A末端null（2）应用柯斯质粒载体构建基因组文库 应用λ噬菌体载体克隆外源DNA的真正有效范围仅有15kb 左右，而许多真核基因的长度比这大的多，有的长达1000kb。由于柯斯质粒可携带的外源DNA比λ噬菌体载体克隆能力的3倍，所以，柯斯质粒载体更适合于克隆真核基因。 柯斯克隆一般程序： ① 用限制酶Sau3A局部消化基因组DNA，然后分离收集长度 为35～45kb的片段群体； ② 同Sau3A的同尾酶，例如用BglII消化为线性化的柯斯质粒 载体DNA连接重组； ③ 经体外包装之后，感染大肠杆菌寄主细胞； ④ 在大肠杆菌细胞中柯斯质粒载体按质粒的特性进行复制扩 增，形成基因组文库。null柯斯克隆的缺点： ① 用噬菌斑杂交法筛选λ噬菌体重组体的基因文库，比用菌落 杂交法结果更加清晰噬菌斑杂交出来的本底，一般总要比 菌落杂交产生的本底低得多； ② 用λ噬菌体载体构建的基因文库，经扩增后几乎可以无限期 地保存，而含有重组体柯斯质粒的细菌，经过贮藏之后， 其成活率会剧烈地下降。 任何一种方法扩增的基因文库中，并不是所有的成员都是等速增殖的。因为插入的外源DNA片段的大小及序列上的差异，将影响到重组的噬菌体、质粒或柯斯质粒的复制速率，这样，当一个基因文库经过扩增之后，某些特定的重组体的比例可能增加，而有些重组体的比例则可能下降。null5.3.4 基因定位克隆 基因定位克隆是用于分离其编码产物尚不知道的目的基因的一种有效的方法。 基本步骤： ① 将目的基因（目的基因的突变）定位到染色体上，并在目 的基因两侧确定一对紧密连锁的RFLP或RAPD分子标记； ② 利用最紧密连锁的一对分子标记作探针，通过染色体步移 技术将位于这两个分子标记之间的含目的基因的特定的基 因组片段克隆并分离出来； ③ 根据其同突变体发生遗传互补的能力从此克隆中鉴定出目 的基因。null（1）拟南芥菜简介 在植物分子生物学研究中，一种小型有花植物——拟南芥菜是具有其他植物所不具备的许多优点： ① 植物个体小：一间不大的实验室里可种植上万株的实验材料； ② 时代时间短；约为5周，一年内可收集到8～9个世代的遗传数据； ③ 种子产率高：每个植株可产生4×104粒以上的种子； ④ 基因组小、结构简单：总长度为7×107bp。比大肠杆菌基因组 大20倍，却只要棉花的10%、烟草的5%、小麦的1%，单一序列比 例高，是玉米的120倍。适合于用染色体步移 技术克隆目的基因； ⑤ 天然自花受粉，所以新的突变体都是天然的纯 合子。便于通过人工杂交受粉进行基因定位。 所以，拟南芥菜被称为植物王国中的果蝇null（2）RFLP分子标记 所谓的RFLP是指DNA限制片段多态性：不同生态型或地理隔离群的同源DNA分子之间表现出序列趋异性，结果，可能使限制酶识别位点的突变而引起限制位点的增加或减少，形成RFLP。null(3) RFLP 作 图原理与步骤 （拟南芥菜） 探针A代表基因A； 探针B代表基因B。 C：Columbia生态型N: Niederzenz生态型探针A探针B探针B探针A探针A探针BF1杂合子F2杂代I. A和B不连锁II. A和B紧密连锁探针B探针B探针A探针A子代子代×null（4） 染 色 体 步 移 技 术RFLP 克隆目的 基因（a）构建起始克隆的限制图； （b）亚克隆B-H片段； （c）用放射性标记的亚克隆B-H片段，从基因组文库 中筛选具重叠序列的新的一步克隆； （d）构建一步克隆的限制图； （e）亚克隆H-E片段； （f）用放射性标记的亚克隆H-E片段，从基因组文库 中筛选具重叠序列的新的二步克隆。 如此反复多次重复步骤（a）～（c），逐步 逼近，直至得到目的基因的克隆。 图中的B、E、H： B: BamHI E: EcoRI H: HindIII 值得注意的是： ①分子探针必须是唯一序列； ②插入到克隆载体上引起致 死效应的序列无法克隆的。null（5）大尺度基因组物理图谱的构建 基因组的1cM图距，在人类基因组中大约相当于1000kb的DNA长度，在拟南芥菜、番茄和小麦中分别相当于290kb、750kb和3500kb。而且大多数高等生物中存在大量的散在重复序列，这使得如果克隆的基因组DNA片段越长，染色体步移时出现的难度越大；反之，又会影响探针标记的强度，从而降低检测的灵敏度。 对于农作物的RFLP研究中，一般选用400~2000kb长度的DNA片段构建随机的基因组文库。显然，常规的克隆技术是无法承受如此大片段的DNA，下面我们就学习解决的办法。null① DNA分子大片段切割 对于DNA分子大片段切割，一般采用切割位点稀少的限制性内切酶。比如我国科学家强伯勤院士首先发现的限制酶SfiI，其识别序列是5′— GGCCNNNN↓NGGCC — 3′。目前商品化供应的切割位点稀少的限制酶已有数十种，常见的有NotI、SfiI和PacI等，已经广泛应用与大尺度的基因组物理图谱的构建。 另外，哺乳动物的基因组DNA中，除了CpG岛外，CG二核苷酸对是十分少见的。因此，一些识别序列短，却含有CG二核苷酸对的限制酶，例如，NruI（TCG↓CGA）和BssHII（G↓CGCGC）等，在哺乳动物基因组DNA中的识别位点是稀少的。可用来切割产生大分子量的限制片段。 null 限制酶DpnI可在 序列处切割DNA分子，形成平末端片段。当修饰甲基化酶M·TaqI对限制酶TaqI的识别序列TCGA进行甲基化，使其变成 时，限制酶DpnI只能在8核苷酸序列 处发生切割作用。 修饰甲基化酶M·ClaI对限制酶ClaI的识别序列ATCGAT进行甲基化，使其变成 时，限制酶DpnI只能在10核苷酸序列 处发生切割作用。 这说明，结合使用一些甲基化酶和限制酶，有可能产生若干具有额外特性的靶子位点，可获得大片段DNA分子。 null② 大片段DNA分子的分离 应用常规的琼脂糖凝胶电泳难以分离长度超过50kb的DNA片段。而脉冲电场凝胶电泳（PFGE）可以分离长度范围200~3000kb的大片段DNA分子。 基本步骤： ⅰ. 将研究材料的细胞埋藏在低熔点琼脂糖中； ⅱ. 加入有关酶及反应试剂，从细胞蛋白质和RNA混合物中游离出 DNA。因为在凝胶基质中的DNA分子较少发生断裂； ⅲ. 用适合于产生大片段DNA的限制酶在低熔点琼脂糖中进行消化； ⅳ. 被限制酶消化了的DNA的凝胶块直接埋在凝胶槽中进行电泳， 低压脉冲过夜或几天以后可得到长达百万bp的大片段DNA。 目前可以用倒转电场凝胶电泳（FIGE）的方法可以避免PFGE因为使用正交电场而引起的DNA谱带扭曲变形的缺点。因为FIGE使用的是周期性的180°交变电场，DNA分子是按直线轨迹泳动的。null③ YAC库的构建 酵母人工染色体(yeast artificial chromosome,YAC) 作为载体可以克隆数百kb的 大分子量DNA片段。 YAC载体的组成包括： ⅰ.来自酵母染色体的着丝粒序列； ⅱ.一段控制酵母DNA复制的自主复制序列（ARS）； ⅲ.一对酵母的端粒序列，有的来源于四膜虫染色体； ⅳ.选择记号； ⅴ.克隆位点。 YAC载体能够象染色体一样在酵母细胞中正常复制，并可以克隆大到1mb的大片段DNA分子。○○○在经过一次脉冲电 场凝胶电泳，把含 有插入片段的YAC 载体分离出来转化已去掉细胞壁的酵母细胞null④ 大尺度物理图谱的构建 遗传图中，基因间或分子标记间的遗传图距是以重组频率来测算的，而在物理图谱中，其分子标记间的物理图距是以核苷酸的数目来表示的。物理图谱可以通过PFGE法进行构建。 拟南芥菜基因组DNA长度为 7×104kp,如果每个基因组克隆长 度为40kb，相邻克隆之间重叠序 列长度为5kb，那么要完全覆盖全 部染色体DNA，则至少需要2000 个克隆。所以，构建全基因组物 理图谱，虽然从原理上讲是十分 简单的，但实际上是一项非常庞 大而可怕的工程。 构建全基因组物理图谱及克隆库的基本程序 以拟南芥菜为例，14个重叠的基因组克隆可以 覆盖全部染色体DNA的一条小型染色体。图中竖线 表示限制酶的切割位点。该图中是根据具有共同的 限制位点模型对基因组克隆进行排列的。 null5.4 克隆基因的分离 近年来分离目的基因的技术取得了长足的发展，这与如下三个因素有直接的关系。 第一、人类基因专利事件——Watson与Healy之争； 第二、农业生产实践的压力； 第三、染色体DNA全序列测定工作的局限性。 同时，有些科学家对基因组全序列测定的必要性提出了疑义： ① 具有理论研究或生产应用价值的基因仅占基因组全序列的极少部分； ② 基因组的大部分序列并无重要的生物学功能；而且一两个个体的基因组全序列并不含有多态性的基因信息； ③ 基因组全序列测定工作耗资巨大，发展中国家无法承受； ④ 农业生产和医疗临床实践都迫切需要尽快分离出有关的目的基因。null5.4.1 应用核酸探针分离克隆的目的基因（核酸杂交筛选法） （1）核酸探针的来源 ① 根据mRNA的丰度，从cDNA文库入手制备探针； ② 从进化中保守的核苷酸编码序列入手，制备探针； ③ 从同一蛋白质家族中的保守的氨基酸序列入手，逆向推 导合成寡核苷酸探针库； （2）寡核苷酸探针的人工合成 在从蛋白质氨基酸序列入手合成寡核苷酸探针时，需要克服2个方面的困难： ① 为了保证足够的特异性，通常使用17～20个核苷酸长度的探针，也就是说，需要掌握6个以上连续排列的氨基酸组成的蛋白质序列的数据； ② 为了克服遗传密码简并问题，尽可能选择简并性最低的一段由6个氨基酸组成的蛋白质序列，作为合成寡核苷酸探针的依据。null（3）假阳性克隆 的克服 ① 猜测体探针： 用于分离克隆基因的 低简并性的人工合成 寡核苷酸探针。 如果猜测体探针 83%的核苷酸能够同 目的基因cDNA序列 杂交，并有10~12个 连续、完全配对的区 域，就可以鉴定出含 目的基因的cDNA阳 性克隆。null② PCR 猜测体技术（尿酸氧化酶编码基因的分离）② PCR 猜测体技术（尿酸氧化酶编码基因的分离）null（a）PCR扩增产物同质粒载体重组后转化大肠杆菌菌株；（b）应用中间部 位的猜测体探针作菌落杂交；（c）从阳性克隆中分离重组体质粒DNA；（d） 从重组体质粒DNA中切下插入序列供作杂交探针筛选cDNA文库；（e）挑取 含全长尿酸氧化酶基因cDNA的阳性克隆，供进一步研究使用。null5.4.2 应用差别杂交或扣除杂交法分离克隆的目的基因 （1）差别杂交 根据不同细胞群体mRNA差异，分别用cDNA探针对含有特异基因表达序列的cDNA文库进行杂交，分离克隆的目的基因。 （a）从表达和不表达目的基因mRNA的2个细胞群体中分别制备总mRNA； （b）以oligo（dT）或短的寡核苷酸随机引物，将总mRNA反转录成放射性标记的探针； （c）碱水解法除去RNA链； （d）用每种探针分子分别与cDNA文库杂交，该文库是由表达目的基因的细胞总mRNA构建的。null（2）扣除杂交 除去非目的基因的cDNA克隆或DNA序列，富集欲分离的目的基因之cDNA克隆或DNA序列的杂交方法。 比如，T细胞受体基因TCR只能在T细胞中表达，而不能在B细胞中表达。从T细胞制备来的单链cDNA同大大超量的B细胞的mRNA进行杂交，于是所有互补的序列都能形成DNA-RNA杂交分子，而T细胞特有的cDNA由于B细胞中没有相应的mRNA而仍然保持单链状态；将此种杂交混合物通过羟基磷灰石柱，使DNA-RNA杂交分子结合在柱上，回收过柱流出的单链cDNA；将其转变为双链cDNA后，与适当的λ噬菌体载体重组并转化大肠杆菌寄主细胞，这样便得到了T细胞特异的cDNA高度富集的扣除文库；制备cDNA探针，筛选文库，分离T细胞的TCR基因。null 扣除杂交法分离克隆的目的基因 （缺失突变基因） （a）野生型及突变型DNA的切割， 后者用生物素标记成探针； （b）DNA变性并与生物素标记探针 杂交； （c）过生物素结合蛋白质柱；将过 柱流出的DNA收集，多次重复 步骤（b）~（c）; （d ）PCR扩增DNA片段B； （e）连续转化形成克隆库。 最后用Southern杂交法进一步 鉴定出不能同突变型DNA杂交的含 有突变基因的阳性克隆。null5.4.3 应用mRNA差别显示技术分离克隆的目的基因 根据表达特性的差异可将高等真核生物的基因分为2大类： ① 看家基因（house-keeping gene）：以其组成性表达模 式维持细胞的基本代谢活动的基因。 ② 发育调控基因（developmental regulated gene）：以 其 时空特异性表达模式完成个体的正常的生长、 发育与进化的基因。 基因的差别表达（differential expression） 在生物个体发育的不同阶段，或是在不同的组织或细胞中发生的不同基因按时间、空间进行有序表达的方式 1992年，美国学者P.Lliang和A.D.Pardee根据基因的差别表达这一特性，发明了mRNA差别显示PCR技术，简称DDRT-PCR（differental display reverse transcription PCR）。null（1）mRNA差别显示的原理 ① 3′端锚定引物 几乎所有的真核基因mRNA分子3′-末端都带有一段多聚腺苷酸结构，即poly（A）尾巴。那么这段poly（A）序列起点之前的（5′上游）的2个碱基，在不考虑倒二位为A的情况下，只能有以下12种可能的排列组合： 5′-AGAAAAA…AA-3′ 5′-ATAAAAA…AA-3′ 5′ -CGAAAAA…AA-3′ 5′-CTAAAAA…AA-3′ 5′ -GGAAAAA…AA-3′ 5′-GTAAAAA…AA-3′ 5′ -TGAAAAA…AA-3′ 5′-TTAAAAA…AA-3′ 5′-ACAAAAA…AA-3′ 5′-CCAAAAA…AA-3′ 5′-GCAAAAA…AA-3′ 5′-TCAAAAA…AA-3′null 根据这种序列结构的特点，设计合成12种不同的下游引物，称为3′锚定引物，其结构通式为： 5′-T11MN 或 5′-T12MN 其中，M为除了T以外任何一种核苷酸；N则为任何一种核苷酸。所以，MN有12种不同的排列组合方式。锚定引物用来反转录mRNA，合成第一链cDNA。这样，每一种锚定引物都将把总mRNA群体的1/12分子反转录成mRNA-cDNA杂交分子。由此可知，使用一套 5′-T11MN或5′-T12MN引物，可以将整个mRNA群体在cDNA水平上分成具有序列结构差异的12份亚群体。null② 5′端随机引物 为了把不同发育阶段的目的基因分离出来，在PCR扩增时，还需要一种10个核苷酸组成的5′端随机引物，这种引物，可以与特定细胞类型的总mRNA群体的cDNA互补位点发生杂交作用，而这种互补位点是分布在距每条新合成的cDNA链3′-末端的不同位点上的。 用3′锚定引物和5′随机引物组成的引物对，对总mRNA进行PCR扩增的结果，可以将在不同发育阶段或不同基因型材料中基因表达的差别以cDNA标签的形式显示出来。此时，凝胶上的谱带显示了以cDNA为标签的基因表达情况，如果不同材料之间的谱带有差异，就说明着不同材料中基因表达的差异。而每个条带都代表着一种特定的mRNA。null （2）DDRT-PCR 基本步骤 ⅰ.分别从A组和B组提取总mRNA； ⅱ.加入3′锚定引物进行反转录合成第一链cDNA； ⅲ.加入一对特定组合的3′锚定引物和5′随机引物，以及35S-dNTP进行PCR扩增； ⅳ.将同位素标记的PCR产物加样在变性的DNA序列胶中作电泳分离，并进行放射自显影； ⅴ.将有关差别表达的DNA条带从测序胶上切割下来； ⅵ.用相同的引物对进行第二次PCR扩增，得到一定数量后，再作重组克隆； ⅶ.将克隆的特定DNA分别同基因组DNA及总mRNA作杂交或测序；鉴定出可能是目的基因的DNA片段； ⅷ.用此目的DNA作探针，从基因组文库或cDNA文库中筛选全长克隆； ⅸ.对筛选出的阳性克隆进行核苷酸序列结构分析及功能鉴定，获得差别表达的目的基因。null（3）mRNA差别显示法的优点和不足 优点： ⅰ.可以同时比较多个样品间基因表达的差异； ⅱ.可以同时检测“上游”和“下游”基因； ⅲ.检测灵敏度高，所需样品少； ⅳ.由于用了PCR和序列胶电泳，更加简单方便。 不足： ⅰ.假阳性比例高，可高达50~75%，一方面，由于泳动速率相同， 长度一样的多种PCR扩增产物混合在一条带中；另一方面，邻 近条带间的距离很近，在根据放射自显影底片来确定特异条带 位置时容易出现操作误差。 ⅱ.扩增的差别条带分子长度比较短小，一般只有110~450bp之间。 ⅲ.绝大多数差别显示的条带都仅仅含有3′-UTR的一短片段的信 息，而这样的序列与基因的编码区来说是比较保守的，根据这 样的序列制备的探针，在进行northern分析时容易出现假阳性。null5.4.4 应用表达文库分离克隆的目的基因 由于众所周知的原因， 真核基因不能在大肠杆菌 细胞中进行表达的。通常 选用表达载体来解决这一 难题。表达载体中，外源 DNA片段插入后在可调节 的原核启动子之下，能够 在大肠杆菌细胞中准确地 转录和表达出外源蛋质。 (1) 把cDNA克隆到表达载 体上，构建cDNA表达库， 表达的蛋白质是融合蛋白 质，而且不被细菌细胞中 有关蛋白酶消化降解。通 过对蛋白质产物的鉴定， 分离克隆的目的基因。把原处平板上的噬菌斑及其产生的融合 蛋白质影印到硝酸纤维素滤膜上滤膜与第一抗体溶液温育漂洗滤膜除去未结合的 第一抗体。加入放射性 标记的第二抗体放射自显影硝酸纤维素滤膜null（2）通过测定蛋白质的功能来筛选cDNA表达文库 在存在着Ca++离子的情况下钙调蛋白（calmodulin）能够同许多种酶结合形成稳定的复合物。因此，放射性同位素标记的钙调蛋白可以用作一种筛选cDNA表达文库的分子探针，从中鉴定出能够表达可在体外同钙调蛋白结合的目标蛋白质的阳性克隆。 （3）用放射性同位素标记的、带有特定蛋白质结 合位点的DNA片段作探针筛选cDNA表达文库 利用这种方法，从cDNA表达文库中鉴定出与它发生特异性结合的目标蛋白质的阳性克隆。这种方法在真核基因表达调控的研究中十分有用。尤其是用于分离与启动子元件特异性结合的转录因子的编码基因方面具有良好的效果。null5.4.5 酵母双杂交系统 （参见《现代遗传学》186页相同内容） 许多真核生物的转录激活 因子都是有结构上可以分开、 功能上相互独立的结构域组成。 DNA 结合结构域（bd) 转录激活结构域（ad） 目的蛋白基因X与编码bd的 DNA序列人工重组成X-GAL4ad； 将另一个已知的蛋白质基因与 编码bd的DNA序列人工重组成X- GAL4bd，克隆以后分别产生杂 合蛋白，如果X与Y相互作用， 在共同转化的酵母细胞中回产 生有功能的转录激活因子，下 游基因便可表达。null5.5 重组体分子的选择与鉴定 外源DNA片段与载体分子连接的反应体系中，包括了： ⅰ.不带有外源DNA片段的载体自我环化片段； ⅱ.载体与不同数目外源DNA片段连接构成的重组体子； ⅲ.不同数目外源DNA片段彼此连接形成的多聚DNA分子等 多种类型的DNA分子。 由这种混合的DNA制剂转化而来的克隆群体中，我们首先需要采用特殊的方法才能筛选出可能含有目的基因片段的重组体克隆；然后还要用某种方法检测这些筛选的重组体克隆中是否确实具有一段插入的外源DNA片段；最后必须进行认真的选择和鉴定，从这些转化子克隆中分离出真正含有目的基因的重组体克隆。null5.5.1 遗传检测法 （1）直接选择法——根据载体的 表型特征选择重组体分子 根据载体分子携带的遗传标记或表型特征来选择的一些方法 ① 抗药性记号插入失活选择法 （以pBR322为例）nullnull②β-半乳糖苷酶显色反应选择法（pUC系列载体） β-半乳糖苷酶乳糖半乳糖葡萄糖β-半乳糖苷酶异构乳糖乳糖1、β-半乳糖苷酶对乳糖的消化作用 （上图） 2、 β-半乳糖苷酶使乳糖成为异构乳糖，异构乳 糖是β-半乳糖苷酶基因表达的诱导物 （下图）。在基因工程实验中所使用的诱 导物是IPTG，所用的显色剂是X-gal。nullpUC18和pUC19质粒载体的MCS结构null（2）根据插入序列的表型特征选 择重组体分子的直接选择法 如果插入在载体分子上的外源基因能够在大肠杆菌寄主细胞中实现其功能性的表达，我们就可以根据其表型特征进行直接选择。 其基本原理是：转化进来的外源基因能够对带有缺陷（如营养缺陷型）的大肠杆菌寄主菌株发生体内抑制或互补效应，从而使被转化的寄主细胞表现出外源基因编码的表型特征。 目前已有相当数量的对其突变作了详尽研究的大肠杆菌实用菌株。而且有些类型的突变，只要外源基因产物获得低水平的表达便会抑制或发生互补作用。null5.5.2 物理检测法 在有关DNA序列结构的研究中，需要将DNA序列中的非基因编码区的片段也克隆到质粒载体上。根据重组体载体比野生型载体大这一特点，就可以检测出来。 （1）凝胶电泳检测法 转化工作之后，将含有质粒的单菌落的溶菌物，通常一次制备12个不同单菌落的溶菌样品，同时进行凝胶电泳分析测定。在细菌染色体DNA前面会出现独立的质粒DNA电泳谱带。在不同单菌落溶菌样品的电泳结果的分析中，就可以根据野生型质粒和重组体质粒DNA的迁移率的差异而鉴定出含有重组体质粒的阳性克隆。null（2）R-环检测法 在临近双链DNA变性温度下和高浓度（70%）甲酰胺溶 液中，双链的DNA-RNA分子要比双链的DNA-DNA分子更为 稳定。因此，将RNA及DNA的混合物置于这种退火条件下， RNA便会同双链DNA中的互补链退火形成稳定的DNA-RNA 杂交分子，而被取代的另一链处于单链状态，这种由单链 DNA分支与双链DNA-RNA分支形成的“泡状”体称为R-环结构。 在有利于形 成R环的条件下， 使待检测的纯化 的质粒DNA，在 含有mRNA分子 的缓冲液中局部 地变性，如果质 粒DNA分子上存 在着与mRNA探 针互补的序列， 那么这种mRNA 就将取代DNA分 子中的相应的互 补链，形成R环。 然后在电子显微 镜下观察，便可 以检测出重组体 质粒的DNA分子。null5.5.3 菌落或噬菌斑杂交筛选法 应用放射性标 记的特定的DNA或 RNA作探针，进行 DNA/DNA或 DNA/RNA杂交检 测法。具体步骤参 见第二章相应内容。null5.5.4 免疫化学检测法 用抗体鉴定那些产生外源DNA编码的抗原的菌落或噬菌斑的方法。只要克隆的目的基因能够在大肠杆菌寄主细胞中实现表达，合成出外源的蛋白质，就可以采用免疫化学法检测重组体克隆。这种方法突出的优点是能够检测不为寄主细胞提供任何选择特征的克隆基因，但需要使用特异性的抗体。（1）放射性抗体检测法 nullnull（2）免疫沉淀检测法 nullnullnul